戴 亚等 叠氮活化烟草多酚氧化酶 I I的机理 l

    烟气与化学

    叠氮活化烟草多酚氧化酶 I I的机理

    戴 亚 施春华 汪长国 刘清亮

    摘 要

    至今人们一直报道叠氮作为金属蛋 白( 特别是铜蛋 白) 的一种抑制剂， 本研究表 明叠氮也可 以作为烟草多酚氧化酶 I I ( 简称

    P P OI I ) 的激活剂。在天然 P P OI I 、 叠氮一P P OI I 络合物和过氧化物一P P OI I 络合物的方波电位学研究中， 从硝基蓝四唑 ( n i t r o b l u e

    t e t r a z o l i u m) 能被酶还原和 P P OI I 能被过氧化物激活的试验结果 可以看 出， 叠氮与 P P OI I的结合诱导 了天然 P P OI I活性 中心 的

    C u O2 C u生成 了C u O2 2 - Cu活性中心结构。叠氮作为激活剂的原因应归因于叠氮分子与 P P OI I的络合反应导致了Cu O2 2 C u的生

    成， 它恰是过氧化物一P P OI I 络合物的活性中心， 其实质是过氧负离子起到激活剂的作用。

    关键词 ：烟草 多酚氧化酶 叠氮 活化 铜蛋白质

    中图分类号 ： T S 4 1 3 文献标识码 ： A 文章编号 ： 1 0 0 4 —5 7 0 8 ( 2 0 0 4 ) 0 6 —0 0 0 1 —0 6

    多酚氧化酶是一组铜蛋白， 它们广泛分布于从菌

    类到哺乳动物的整个种族系列中I 1 ] ， 他们的共 同性质

    是利用分子 氧催化氧化多酚到醌[ 2 ] 。P P OI I已经从

    Ni c o t i a n a烟草中成功地分离纯化出来[ 3 ] ， 它的分子量

    为3 5 6 0 0并且含有反铁磁性偶合的两个铜离子 ， P P OI I

    的最适 p H和温度分别为p H一6 . 5和 4 O ℃， 我们的试

    验表明， P P OI I 不能催化氧化对苯二酚和间苯二酚， 对

    多酚氯原酸仅有很低的活性[ 4 ] 。

    由于叠氮分子能与许多含铜的酶形成配合物， 至

    今人们一直报道它是多酚氧化酶的抑制剂[ 5 ] ， 叠氮

    与铜的配位可能有 3种类型的结构[ 8 ] ， 即 一 1 ， 3桥式；

    一

    1 ， 1桥式和T 7 一 终端式 。 根据N。 一 不对称伸缩振动的拉

    曼光谱实验得出的结论 ， 十八烷基载体蛋白( 6去饱和

    酶) 就是用两种方式与叠氮配位的， p H一7 . 8时的7 7 ( 1 )

    终端式和 p Hi7 . 0时的 一 1 ， 3桥式E g , l o ] 。叠氮与氧化

    过 的 细 胞 色 素 C 氧 化 酶 ( 来 源 于 Pa r a c o c c u s

    d e n t r i f i c a n s) 的相互作用表明叠氮也是以两种形式结

    合 ： 强亲和方式 ， 叠氮结合在近于双核中心的非金属位

    点上 ； 弱结合方式， ( Kd一4 . 1 mo 1 ) ， 叠氮以桥式结

    合 于双核 中心[ 】 “ ] 。细 胞 色素 B氧化 酶 ( 来 源 于

    戴 亚， 男 ， 5 7岁 ， 教授 ， 重庆烟草工业公司技术 中心， 重庆南岸区南

    坪东路 2号宏声大厦1 8 F， 重庆 ， 4 0 0 0 6 0

    施春华 ， 刘清亮 ， 中国科学技术大学化学系， 合肥 ， 2 3 0 0 2 6

    汪长国， 通讯地址同第一作者。

    收稿 日期 ； 2 0 0 3 — 1 1 - 2 7

    Es c h e r i c h i a c o l i )也是两种结构方式结合叠氮， 在血

    红素 O( 3 ) 和 C u — B之 间形成桥式 的配合物I 】 ， 这与

    L l i t t l e等[ 1 报道， 即叠氮以终端方式结合于 C u — B是

    不同的， 从 N。 一 的F T— I R的不对称伸缩振动和 4 1 0 n m

    处吸收的增加证实了它与活性中心的结合是终端式

    的 。

    叠氮可使金属酶中毒( 特别是铜蛋白酶) 。主要是

    它与活性中心的金属离子有强的配位能力 ， 并改变了

    活性中心的配位数和构象， 消除了活性中心内金属离

    子的活性。 在叠氮与铜氧化酶的反应中， 叠氮分子可能

    阻碍了酪氨酸与铜的配合 ， 从而妨碍了关键性 中间体

    的生成而抑制氧化酶的活性[ “ ] ， 换句话说 ， 叠氮保护

    了酶使其不失去C u( I ) 离子口 引。这结果可以设想在叠

    氮与金属酶的相互作用中可能具有一种还不知道的功

    能。事实上， 我们发现在低浓度下叠氮能激活烟草

    P P OI I ， 这与其他人报道叠氮总是铜蛋白的抑制剂是

    不相同的。本文将讨论叠氮激活P P OI I的机理和在激

    活铜蛋白的过程中叠氮的新功能。

    1 材料与方法

    1 . 1 材 料

    新鲜烟叶( Ni c o t i a n a) 直接从烟 田摘取 ， 洗涤后

    在冰箱 内 4 ℃以下保存 约 2 4 h 。层析柱填料 DE AE—

    S e p h a d e x A一 5 0，CM— S e p h a d e x C一 5 0和 Se p h a d e x G一

    7 5是从 P h a r ma c i a C o r p o r a t i o n ( 瑞典)购买。Na t i o n

    维普资讯 http:www.cqvip.com 2 中国烟草学报 2 0 0 4年 1 2月 第 1 0卷 第 6 期

    溶液( 5 乙醇溶液) 从 S i g ma C o r p o r a t i o n( 美国) 购

    买 。

    1 . 2 蛋白质 制备

    天然 P P OI I ( 以后简称 P P OI I ) 蛋白质的制备按如

    下步骤进行： 丙酮萃取 ， 3 0 和 8 0 硫酸胺沉淀， 然后

    是 DEAE— S e p h a d e x A一 5 0 ，CM— S e p h a d e x C一 5 0 和

    S e p h a d e x G一 7 5层析 柱分 离纯 化[ 3 ] ， 其酶 的纯度 用

    S DS P AGE和MAL DI — T OF — MS方法进行测量L 】 。 一

    个单位酶活性定义为 4 2 0 n m下每mi n增加 0 . 0 1单位

    的吸收。蛋 白质浓度的测定按 照B r a d f o r d方法并用

    B S A作为标准蛋白口 。

    1 . 3 方波电位测量

    电化学测量是在L K 9 8微机控制的电化学系统上

    进行的。 方波电位测量使用了一个叁电极隔离电槽， 一

    个 4 mm 玻璃 电极 ( GC) 作 为工作电极 ， 一个铂 电极

    ( P t ) 为对照电极 ， 一个 Ag Ag C1 电极为参比电极。每

    次试验之前 ， 用金刚砂抛光GC电极表面， 二次蒸馏水

    完全冲洗干净， 并在空气中干燥 。 P P OI I在GC电极上

    膜的制备步骤如下： 把 3 L浓度为2 0 mg mL的P P OI I

    溶液与 3 L的n a f i o n储备液( 1 5 ) 进行充分混合 ， 涂

    布在GC电极表面， 在空气中4 C下干燥6 h 。 1：1叠氮

    一

    P P OI I 和 1： 4叠氮一P P OI I 络合物样品兑去离子水

    透析5 h。 把Hz O ( 1 mmo l L) ] D 人到电解液中 ......