中国生物工程杂志 C h i n a B i o t e c h n o l o g y ， 2 0 0 5 ， 2 5 ( 1 ) ： 7 6 ～8 0

    转基因烟草荧光定量检测方法研究

    郭兆 奎 ” 颜 培强

    ( 1黑龙江烟草科学研究所 牡丹江 1 5 7 0 1 1

    万 秀清 李丽 杰 杨 谦

    2哈尔滨工业大学生命科学院 哈尔滨 1 5 0 0 0 1 )

    摘要 依据实时定量P C R原理， 参照3 5 S启动子、 N O S终止子、 G U S 基因和N t r F I I 基因序列设计

    T a q Ma n引物和荧光标记探针。采用美国 Ⅲ 公司O p t i c o n T M 2 荧光定量 P C R检测 系统对烤后烟叶

    进行转基因定量检测技术研究， 从中筛选出扩增效率高， 灵敏度好的 P C R引物和探针序列， 同时

    通过对扩增体 系， 扩增条件的梯度实验， 优化 出荧光定量检测的最佳反应体系和反应条件， 从而

    建立了转基因烟草定量检测方法 该方法经验证其检测灵敏度达到0 . 0 5 %。在 2 0 0 3年 6月参

    加 C O R E S T A ( 国际烟草科研与合作中心) 组织的国际烟草转基 因定量检测合作试验中， 该优化转

    基因烟草定量检测技术获得 了较好成绩， 对盲检样品检测结果评价( Z 。 s c o r e ) 列国际 1 2家实验室

    之首， 证明此法灵敏度高、 稳定性好。

    关键词 烟草 转基因检测 荧光定量 P C R

    由于转基因作物的安全性研究尚未取得突破性

    进展， 还没有足够证据证明转基因产品对环境和对

    人体健康是否具有危害， 消费者还不能完全接受转

    基因制品， 各国政府相继出台了转基因制品管理条

    例， 转基因检测已成为市场准入的重要检测指标。

    作为基因工程研究的模式植物， 烟草是进行转

    基因研究最早， 也是转基因种类较多的经济作物， 自

    1 9 ~ o 6年以来， 已经将烟草花叶病毒 ( Ⅳ) ， 马铃薯Y

    病毒( P V y) ， 马铃薯 x病毒( P v x) ， 黄瓜花叶病毒

    ( C M V ) ， 苜蓿花叶病毒( 州 ) ， 烟草脆裂病毒( T R v)

    的外壳蛋白基因， 马铃薯Y病毒复制酶基因、 黄瓜花

    叶病毒的微卫星 R N A， 几丁质酶基因、 抗菌肽基因、葡萄糖氧化酶、 苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因( 盯)

    和蛋白酶抑制剂基因…等上百种外源基因转入烟草

    获得表达， 致使转基因烟草目的基因种类较为复杂，同时由于烤烟必须经过长达6天的高温( 约7 0 o C ) 烘

    烤调制过程， D N A降解严重， 给转基因检测技术提出

    了更高的要求， 郭等 优化了适于烤后烟叶 D N A提

    取方法并提出了转基因烟草检测方法， 他们 利

    用竞争性 P C R原理提出了转基因烟草半定量检测方

    法， 为进一步提高检测灵敏度， 杜绝操作中可能出现

    收稿日期 ： 2 0 0 4 - 0 9 - 2 0 修回日期 ： 2 O O 4 — 1 0 - 2 6

    国家烟草专卖局资助项 目( 1 1 0 2 0 0 1 0 1 0 0 8 )

    电子信箱： G - -Z K@s o h u . c 0 I n

    的污染的影响， 我们引入了内标准荧光定量 P C R技

    术 ， 通过靶序列和内标序列T a q Ma n 引物、 探针设

    计和反应体系、 条件优化， 进行转基因烟草定量检测

    技术的试验研究。

    1 材 料

    1 . 1 材 料

    标准样品含有 0 . 1 %， 0 . 5 %， 1 %， 2 %， 5 %， 0 %

    转基 因成分 ( 由英 国政府化学家实验室 I _ F A 3提

    供) ， 待测样品 A、 B 、 C 、 D、 E、 F 、 G由本实验室 自行

    配制含量分别为 0 . 4 o %、 1 . 1 0 %、 0 . 6 0 %、 0 . 1 0 %、2 . 0 o %、 0 . 5 0 %、 0 . 2 0 %， H为阴性对照。

    1 . 2 试 剂

    实时定量 P C R检测试剂购 自美 国 A B I 公司，其它主要化学试剂为美国 P r o m e g a 、 S i g m a 公司或国

    产 A R级试剂。荧光定量 P C R引物和探针由大连

    宝T a K a R a 生物公司合成。

    1 . 3 仪 器

    采用美国 Ⅲ 公司 O p t i c o n T M 2实时荧光基因检

    测系统

    2 方 法

    2 . 1 样品 D N A提取与浓度、 纯度测定

    称 3 0 0 m g烟草干粉样品加入 1 . 5 m l 离心管中，维普资讯 http:www.cqvip.com 郭兆奎 等 ： 转基因烟草荧光定量检测方法研究 7 7

    加 7 0 0 t t l 2倍 C T A B ( 2 % C T A B ； 2 0 % 0 . 5 m o l L T r i s ；

    4 % 0 . 5 m o l L E D T A； 8 . 1 8 % N a C l ； 1 % P V P ) 抽提缓

    冲液， 振荡混 匀后， 6 5 ℃的恒 温水 浴 1 0 m i n 。加

    7 0 0 t t l 氯仿 异戊醇 ( 2 4： 1 ， v v ) ， 混匀 1 2 0 0 0 g离心

    5 m i n 。取上清液 ， 加 1 1 0体积的 1 0 % C T A B提取缓

    冲液 ， 加入等体积的氯仿 异戊醇( 2 4： 1 ， v v ) 混匀后

    在 1 2 0 0 0 g 离心 5 m i n 。取上清， 加等体积的 C T A B沉

    淀缓冲液( 1 % C T A B ； 1 %0 . 5 m o l L T r i s ； 2 %0 . 5 m o l

    L E D T A ) ， 混匀后在 1 5 0 0 0 g离心 8 mi n去上清， 加

    i 0 0 t ~高盐 ， I E缓 冲液 ( 2 % 0 . 5 m o l L T r i s ； 0 . 2 %

    E 叽 ； 5 . 8 4 4 % N a C 1 ) ， 6 5 o C水浴 1 0 m i n加入二倍体

    积冷无水乙醇， 于 一4 0 ℃冷置 3 0 m i n 。1 5 0 0 0 g离心

    8 m i n ， 沉淀溶于 5 0 0 t ~超纯水， 通过紫外分光光度计

    2 6 0 n m和2 6 0 n m 2 8 0 n m估算 D N A提取物的浓度和

    纯度。

    2 . 2 荧光定量 P C R引物和探针设计

    根据 花 椰 菜 花 叶 病 毒 3 5 S启 动 子 ( ：

    2 1 7 3 3 9 6 ) ， 根癌农杆菌 n o s终止 子 ( g i ： 3 3 1 9 8 6 1 ) 、G U S 报告基因( ： 4 7 5 1 6 9 ) 和卡那霉素抗性基因

    ( N P T I I ) 序列( g i ： 1 9 5 6 9 2 3 0 ) J ， 设计合成 4种荧光

    P C R反应扩增引物和荧光标记探针进行烟草转基

    因定量检测的引物优化 ， 为消除 P C R反应管中模

    板量差异而引起的荧光信号的误差， 试验中以烟草

    内源基因烟草硝酸还原酶基因 N R( ： 1 9 8 9 4 ) 设计

    引物和探针作为内标加入同一反应管中， 应用 I Ⅵ J

    公司o p t i c 0 n 2 荧光定量 P C R实时检测外源序列和

    内源序列的荧光信号( 表 1 ) ......