β反义寡核苷酸对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响
关键词: 反义寡核苷酸;血管平滑肌细胞;再狭窄;血小板衍化生长因子;受体;细胞核增殖抗原
摘 要:目的 研究血小板衍化生长因子β受体(PDGFR-β)反义寡核苷酸(AODN)对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响. 方法 建立大鼠血管平滑肌细胞体外增殖模型.将细胞分为反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组和空白对照组，其中反义组按浓度又分为1，2.5，5，10和15μmol L-1 5小组.在加药后24，48和72h以流式细胞仪测定细胞周期，免疫细胞化学染色分析细胞核增殖抗原的表达，MTT(四唑盐)比色法测定细胞增殖活力. 结果 10μmol L-1 PDGFR-βAODN干预VSMC48h后，处于DNA合成前期(G0 /G1 )细胞数分数(0.70)高于空白对照组(0.07，P<0.05);PCNA免疫细胞化学染色发现以5～15μmol L-1 PDGFR-βAODN干预48h后VSMC各组胞核染色强度为20.4%～6.4%明显弱于空白组(73.8%)，正义组(72.9%)和无义组(75.6%)(P<0.05);10μmol L-1 PDGFR-βAODN作用48h后VSMC的增殖抑制率为66.7%，高于正义组(8.1%)，错义组(11.8%)和5μmol L-1 AODN组(45.4%)(P<0.05);同时10μmol L-1 AODN组48h增殖抑制率与24h(9.1%)相比明显增加(P<0.05). 结论 PDGFR-βAODN对VSMC增殖有明显抑制作用，并且呈时间和浓度依赖性.
Effect of PDGFR┐βantisense oligonucleotides on proliferation of cultured rat aortic smooth muscle cells
GU Chun-Hu，HOU Ying-Ping，QIAO Hong-Qing，LI Yan，WANG Yun-Ya，LIN Guo-Cheng
Department of Nuclear Medicine，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:antisense oligonucleotide;vascular smooth muscle cell;restenosis;platelet derived growth factor;receptor;proliferating cell nuclear antigen
Abstract:AIM To study the effect of PDGFR-βAODN on proliferation of cultured rat aortic vascular smooth muscle cells(VSMC).METHODS Cultured rat aortic VSMC mod-el was established in vitro.The cells were divided into antis-ese oligonucleotide(AODN)group，sense oligonucleotide(SODN)group，scrambled oligonucleotide(CODN)group and control group.The cells in AODN group were subdivided into five small groups by concentration of1，2.5，5，10，15μmol L-1 .MTT assay，flow cytometry，immunohis-tochemistry for proliferating cell nuclear antigene(PCNA)were used to determine the effects of PDGFR-βAODN on proliferation of VSMC.RESULTS The percentage of quies-cent cells(G0 /G1 )of AODN group at48h(0.70)were much higher than that of control group(0.07)，P<0.05.The per-centages of expression of PCNA with5～15μmol L-1 AODN were between6.4%and20.4%，which were lower than that of control group(73.8%)，SODN group，and CODN group(P<0.05).The inhibiting rate of proliferation of VSMC in10μmol L-1 AODN group at48h(64.7%)was higher than that of SODN group(8.1%)，CODN group(11.8%)，5μmol L-1 AODN group(45.4%)，and10μmol L-1 AODN group at24h(9.1)(P<0.05).CONCLUSION PDGFR-βAODN could inhibit proliferation of cultured VSMC in a dose and time-dependent pattern.
0 引言
经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)和冠状动脉旁路移植术(CABG)是治疗冠心病的有效手段，但30%～50%术后再狭窄严重影响手术疗效[1，2] .研究证明再狭窄的实质就是血管中层平滑肌细胞向内膜下迁移和增生
[3] .血小板衍化生长因子及其β受体(PDGFR-β)在血管平滑肌细胞(VSMC)的迁移增生过程中起重要作用
[4] .我们拟探讨在大鼠体外VSMC增殖模型中，PDGFR-β反义寡核苷酸(AODN)对VSMC增殖的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠清洁级，4wk龄，雌雄不限，体质量(250±20)g，4～8wk龄，由第四军医大学实验动物中心提供;抗大鼠PCNA mAb、混合胶原酶、胰蛋白酶、MTT购于Sigma公司;96孔培养板、6孔培养板购于Costar公司;PDGFR-βAODN链(18bp)5'TAT CAC TCC TGG AAG CCC3'，正义寡核苷酸链(SODN)5'GGG CTT CCA GGA GTG ATA3'，无关寡核苷酸链(CODN)5'GTG ATA GTA TGC CGA GCA3'，由加拿大上海Sagon公司合成并进行全硫代磷酸化修饰和电泳鉴定;SABC试剂盒购于武汉博士德生物工程公司;胎牛血清购于浙江金华犊牛研究所;流式细胞仪(EFICS ELITE法国);酶联免疫检测仪(DG5031，华东电子仪器厂);SD大鼠颈椎脱臼法处死后，采用胶原酶法分离取得VSMC进行原代培养和传代培养，经α-SMactin免疫细胞化学染色鉴定确为VSMC、纯度>95%，采用5～10代细胞为实验对象.
1.2 方法
1.2.1 VSMC细胞增殖活力的测定 取生长融合期细胞制成1×104 L-1 密度的单细胞悬液接种于96孔板，待细胞完全贴壁伸展后，无血清DMEM培养液驯化24h.采取不同的加药方案:①单加不同浓度的反义寡核苷酸;②加入5.0μmol L-1 反义、正义、无义寡核苷酸;③空白组加等量培养液，设调零孔.每24h各取8孔，每孔内加入MTT20μL，37℃继续孵育4h后小心吸去培养液.每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，震荡器震荡10min，用酶联免疫检测仪(波长490nm)测定各孔的吸光度值[5] .细胞增殖抑制百分率=(1-试验组A值)/对照组A值均数×100%.
1.2.2 PCNA免疫细胞化学染色 将5×105 L-1 密度细胞悬液，接种于已置盖玻片的6孔培养板中，待细胞完全贴壁伸展后，无血清DMEM培养液驯化24h后，加入含不同干预因素(同1.2.1)的200mL L-1 胎牛血清DMEM，每24h各取5孔，取出盖玻片，按SABC试剂盒说明进行其余步骤操作，最后DAB显色，常规系列脱水、透明.镜下观察.PCNA染色阳性标准:细胞核内出现棕黄色颗粒.随机计数5张盖玻片中5个以上高倍镜视野500个细胞，计算平均每100个细胞中阳性百分率，根据染色强度和范围分为:阴性(-):阳性细胞<10%;阳性(+):阳性细胞10%～50%;强阳性(++):阳性细胞>50%.
1.2.3 流式细胞仪测定细胞周期 将细胞制成2×105 L-1 密度的单细胞悬液，接种培养瓶，48h后弃去 培养液，无血清驯化24h，细胞周期同步化后，分别加入5.0μmol L-1 反义、无义寡核苷酸，继续培养，48h后停止培养，0.01mol L-1 PBS(pH7.4)洗2次，2.5g L-1 胰酶消化后离心，以700mL L-1 的冷乙醇制成1×10
6 L-1 密度单细胞悬液，30min后，PI染色，流式细胞仪检测.
统计学处理:实验数据用x ±s表示，组间进行t检验，P<0.05为差异显著.
2 结果
2.1 寡核苷酸对VSMC增殖活力的影响 相同浓度(10μmol L-1 )各种寡核苷酸对血管平滑肌作用24h后，各加药组与空白对照组相比MTT A值无明显差异(P>0.05)，各加药组之间也无明显差异(P>0.05);在加药后48h反义组与空白组之间有显著性差异(P<0.05)，反义组与正义组和错义组之间有明显差异(P<0.05)，空白、错义、正义各组之间无明显差异(P>0.05).这说明PDGFR-β对VSMC的增殖有明显的抑制作用(Tab1).PDGFR-β反义寡核苷酸对VSMC的增殖抑制作用呈明显的时间依赖关系.实验中发现5μmol L-1 以下的PDGFR-βAODN作用VSMC48h后对细胞无明显增殖抑制作用(P>0.05)，5μmol L-1 以上浓度的PDGFR-βAODN对细胞有明显增殖抑制作用，表明PDGFR-βAODN增殖抑制作用有明显的浓度依赖效应.
表1 寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的影响 略
2.2 PDGFR┐βAODN对细胞周期的影响 与空白对照组相比10μmol L-1 AODN作用于VSMC24h后细胞G1 期(DNA合成前期)比数分数达到0.70，而空白对照组G1 期细胞只占0.50明显低于AODN组(P<0.05);AODN组S期(DNA合成期)比例为0.07，空白对照组为0.35，两组之间有显著差异(P<0.05).
2.3 PCNA免疫细胞化学染色 空白对照组PCNA染色呈强阳性(Fig1A);5μmol L-1 PDGFR-βAODN作用于VSMC48h后细胞PCNA染色呈阳性;10μmol L-1 以上AODN作用于VSMC48h后细胞PCNA染色呈阴性(Fig1B)，阳性率与对照组比较有明显差异(P<0.05，Tab2，3).
图1 PCNA染色 略
表2 不同寡核苷酸对血管平滑肌细胞PCNA表达的影响 略
表3 反义寡核苷酸浓度对血管平滑肌细胞PCNA表达的影响 略
3 讨论
PDGF对VSMC是一种强烈的促增殖剂和趋化剂，并且PDGF对VSMC的作用有一定的组织特异性[6] .当大量PDGF和β型受体结合后通过络氨酸激酶启动细胞的增殖信号，最终导致VSMC大量增生和再狭窄的发生[7，8] .PDGF的主要作用是使细胞从非分裂状态的G1 期进入分裂周期，起着一种“获能因子”(competence factor)的作用，其他生长因子如成纤维细胞生长因子(FGF)可以促进细胞从G1 期进入DNA合成期[9] .反义寡核苷酸可以通过其特异的碱基序列与目的基因相结合阻止目的基因的表达[10] .因此PDGFR-β反义寡核苷酸可以阻止VSMC的PDGFR-β蛋白的表达从而阻断其与PDGF的结合，使细胞停留于G1 期，最终抑制VSMC的增殖.另外我们在实验中发现PDGFR-βAODN作用于VSMC24h对VSMC无明显增殖抑制作用，这与AODN虽被细胞摄取，但尚未能与目的基因达到充分结合等原因有关;过去的研究证明PCNA是DNA复制和细胞分裂过程中DNA多聚酶最重要的辅助因子.PCNA位于细胞核内，它的表达量与VSMC的增殖活力呈正相关[11] .因此我们在实验中以PCNA的表达强度侧面反映VSMC的增殖活力，结果间接证明了PDGFR-βAODN对VSMC增殖抑制作用.另外也有少数人认为寡核苷酸的作用无需任何序列特异性，而是与各种生长因子或膜蛋白相结合，抑制细胞的迁移、增殖.这与目前大多数同仁的观点不符，与本实验的研究结果也不相符.我们发现正义寡核苷酸和错义寡核苷酸对VSMC的增殖均无明显抑制作用.这说明寡核苷酸对细胞的影响有严格的序列特异性.
PDGFR-βAODN作为基因工程和分子生物学的产物对体外培养VSMC的增殖可以产生很大程度的抑制，另外因为该反义寡核苷酸对于VSMC具有一定的组织特异性，所以PDGFR-βAODN有望能在体内成功抑制血管损伤后VSMC的异常增生和再狭窄的形成.
参考文献:
[1]Gonsalves C，Bandyk DF，Action AJ.Duplex features of vein grafts stenosis and the success of percutaneous transluminal an-gioplasty [J].J Endovasc Surg，1999;6:66-72.
[2]Espinola Klainc，Rupprecht HJ.Impact of restenosis10years after coronary angioplasty [J].Eur Heart J，1998;19:1047-1053.
[3]Zhu HL，Yang JX，Zhang WD，Cui Q，Chen WS.Correlation between extracellular matrix and stenosis of autologous vein grafts in rabbit mAel [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2001;22(5):407-409.
[4]Hart CE，Clowes AW.Platelet derived growth factor and arteri-al response to injury [J].Circulation，1997;95:555-556.
[5]Zhao HL，Ling SX，Jia B，Li J，Zhang LL，Zhang SF.Inhibito-ry effects of salidroside on hypeoxia-induced proliferation of rab-bit pukmonary arterial smooth muscle cells [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(2):186-190.
[6]Ren YS，Chen Q，Jia GL，Jing Y，Dong SZ.Expression ofβre-ceptor of palelet derived growth factor in human coronary artery [J].Di-si Jinyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，1998;19(60):652-655.
[7]Waltenberger J，Andreallecker D，Kroll J，Frank H，Mayr U，Jeffrey D，Donald B，Fujita D，Gazit A，Hombach V，Levitzki A，Frank-D，Bǒhmer.A dual inhibitor of platelet-derived growth factorβ-receptor and Src kinanse activity potently inter-feres with motogenic and mitogenic responses to PDGF in vascu-lar smooth muscle cells [J].Circ Res，1999;85:12-22.
[8]Tan SJ，Jin LR，Chen WC.Effect of kallikrein on PDGF-in-duced proliferation of cultured rat aortic vascular smooth muscle cells [J].Shanghai Yixue(J Shanghai Med)，1999;22:112-114.
[9]Gao W，Huo Y，Zhu GY.The cellular and molecular biology of restenosis [J].Zhongguo Jieru Xinzang Binxue Zazhi(Chin J Interv Cardiol)，1997;5(2):84-91.
[10]Wang HG，Li KZ，Dou KF.Expression of inhibition of vascular endothelial growth factor of human hepatocellular carcinoma cell by antisense oligodeoxynucleotide [J].Di-si Junyi Daxue Xue-bao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(11):1327-1329.
[11]Wang L，Hui YN，Wang YS，Hui HX，Jin M.Inhibition of an-tisense PCNA and antisense bcl-2oligonucleotides cultured hu-man letinal pigment epithelial [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(2):204-206.
基金项目: 第四军医大学创新工程资助项目(CX99A006)
通讯作者: 侯英萍.Tel.(029)3375453Email.xjhyx@fmmu.edu.cn 作者简介: 顾春虎(1973-)，男(汉族)，安徽省蚌埠市人.住院医生，助教，硕士生(导师乔宏庆).Tel.(029)3375453 Email.Xjhyx@fmmu.edu.cn
第四军医大学西京医院核医学科，陕西西安710033
编辑 许昌泰, 百拇医药(顾春虎 侯英萍 乔宏庆 李焰 王云雅 林国城)
摘 要:目的 研究血小板衍化生长因子β受体(PDGFR-β)反义寡核苷酸(AODN)对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响. 方法 建立大鼠血管平滑肌细胞体外增殖模型.将细胞分为反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组和空白对照组，其中反义组按浓度又分为1，2.5，5，10和15μmol L-1 5小组.在加药后24，48和72h以流式细胞仪测定细胞周期，免疫细胞化学染色分析细胞核增殖抗原的表达，MTT(四唑盐)比色法测定细胞增殖活力. 结果 10μmol L-1 PDGFR-βAODN干预VSMC48h后，处于DNA合成前期(G0 /G1 )细胞数分数(0.70)高于空白对照组(0.07，P<0.05);PCNA免疫细胞化学染色发现以5～15μmol L-1 PDGFR-βAODN干预48h后VSMC各组胞核染色强度为20.4%～6.4%明显弱于空白组(73.8%)，正义组(72.9%)和无义组(75.6%)(P<0.05);10μmol L-1 PDGFR-βAODN作用48h后VSMC的增殖抑制率为66.7%，高于正义组(8.1%)，错义组(11.8%)和5μmol L-1 AODN组(45.4%)(P<0.05);同时10μmol L-1 AODN组48h增殖抑制率与24h(9.1%)相比明显增加(P<0.05). 结论 PDGFR-βAODN对VSMC增殖有明显抑制作用，并且呈时间和浓度依赖性.
Effect of PDGFR┐βantisense oligonucleotides on proliferation of cultured rat aortic smooth muscle cells
GU Chun-Hu，HOU Ying-Ping，QIAO Hong-Qing，LI Yan，WANG Yun-Ya，LIN Guo-Cheng
Department of Nuclear Medicine，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:antisense oligonucleotide;vascular smooth muscle cell;restenosis;platelet derived growth factor;receptor;proliferating cell nuclear antigen
Abstract:AIM To study the effect of PDGFR-βAODN on proliferation of cultured rat aortic vascular smooth muscle cells(VSMC).METHODS Cultured rat aortic VSMC mod-el was established in vitro.The cells were divided into antis-ese oligonucleotide(AODN)group，sense oligonucleotide(SODN)group，scrambled oligonucleotide(CODN)group and control group.The cells in AODN group were subdivided into five small groups by concentration of1，2.5，5，10，15μmol L-1 .MTT assay，flow cytometry，immunohis-tochemistry for proliferating cell nuclear antigene(PCNA)were used to determine the effects of PDGFR-βAODN on proliferation of VSMC.RESULTS The percentage of quies-cent cells(G0 /G1 )of AODN group at48h(0.70)were much higher than that of control group(0.07)，P<0.05.The per-centages of expression of PCNA with5～15μmol L-1 AODN were between6.4%and20.4%，which were lower than that of control group(73.8%)，SODN group，and CODN group(P<0.05).The inhibiting rate of proliferation of VSMC in10μmol L-1 AODN group at48h(64.7%)was higher than that of SODN group(8.1%)，CODN group(11.8%)，5μmol L-1 AODN group(45.4%)，and10μmol L-1 AODN group at24h(9.1)(P<0.05).CONCLUSION PDGFR-βAODN could inhibit proliferation of cultured VSMC in a dose and time-dependent pattern.
0 引言
经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)和冠状动脉旁路移植术(CABG)是治疗冠心病的有效手段，但30%～50%术后再狭窄严重影响手术疗效[1，2] .研究证明再狭窄的实质就是血管中层平滑肌细胞向内膜下迁移和增生
[3] .血小板衍化生长因子及其β受体(PDGFR-β)在血管平滑肌细胞(VSMC)的迁移增生过程中起重要作用
[4] .我们拟探讨在大鼠体外VSMC增殖模型中，PDGFR-β反义寡核苷酸(AODN)对VSMC增殖的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠清洁级，4wk龄，雌雄不限，体质量(250±20)g，4～8wk龄，由第四军医大学实验动物中心提供;抗大鼠PCNA mAb、混合胶原酶、胰蛋白酶、MTT购于Sigma公司;96孔培养板、6孔培养板购于Costar公司;PDGFR-βAODN链(18bp)5'TAT CAC TCC TGG AAG CCC3'，正义寡核苷酸链(SODN)5'GGG CTT CCA GGA GTG ATA3'，无关寡核苷酸链(CODN)5'GTG ATA GTA TGC CGA GCA3'，由加拿大上海Sagon公司合成并进行全硫代磷酸化修饰和电泳鉴定;SABC试剂盒购于武汉博士德生物工程公司;胎牛血清购于浙江金华犊牛研究所;流式细胞仪(EFICS ELITE法国);酶联免疫检测仪(DG5031，华东电子仪器厂);SD大鼠颈椎脱臼法处死后，采用胶原酶法分离取得VSMC进行原代培养和传代培养，经α-SMactin免疫细胞化学染色鉴定确为VSMC、纯度>95%，采用5～10代细胞为实验对象.
1.2 方法
1.2.1 VSMC细胞增殖活力的测定 取生长融合期细胞制成1×104 L-1 密度的单细胞悬液接种于96孔板，待细胞完全贴壁伸展后，无血清DMEM培养液驯化24h.采取不同的加药方案:①单加不同浓度的反义寡核苷酸;②加入5.0μmol L-1 反义、正义、无义寡核苷酸;③空白组加等量培养液，设调零孔.每24h各取8孔，每孔内加入MTT20μL，37℃继续孵育4h后小心吸去培养液.每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，震荡器震荡10min，用酶联免疫检测仪(波长490nm)测定各孔的吸光度值[5] .细胞增殖抑制百分率=(1-试验组A值)/对照组A值均数×100%.
1.2.2 PCNA免疫细胞化学染色 将5×105 L-1 密度细胞悬液，接种于已置盖玻片的6孔培养板中，待细胞完全贴壁伸展后，无血清DMEM培养液驯化24h后，加入含不同干预因素(同1.2.1)的200mL L-1 胎牛血清DMEM，每24h各取5孔，取出盖玻片，按SABC试剂盒说明进行其余步骤操作，最后DAB显色，常规系列脱水、透明.镜下观察.PCNA染色阳性标准:细胞核内出现棕黄色颗粒.随机计数5张盖玻片中5个以上高倍镜视野500个细胞，计算平均每100个细胞中阳性百分率，根据染色强度和范围分为:阴性(-):阳性细胞<10%;阳性(+):阳性细胞10%～50%;强阳性(++):阳性细胞>50%.
1.2.3 流式细胞仪测定细胞周期 将细胞制成2×105 L-1 密度的单细胞悬液，接种培养瓶，48h后弃去 培养液，无血清驯化24h，细胞周期同步化后，分别加入5.0μmol L-1 反义、无义寡核苷酸，继续培养，48h后停止培养，0.01mol L-1 PBS(pH7.4)洗2次，2.5g L-1 胰酶消化后离心，以700mL L-1 的冷乙醇制成1×10
6 L-1 密度单细胞悬液，30min后，PI染色，流式细胞仪检测.
统计学处理:实验数据用x ±s表示，组间进行t检验，P<0.05为差异显著.
2 结果
2.1 寡核苷酸对VSMC增殖活力的影响 相同浓度(10μmol L-1 )各种寡核苷酸对血管平滑肌作用24h后，各加药组与空白对照组相比MTT A值无明显差异(P>0.05)，各加药组之间也无明显差异(P>0.05);在加药后48h反义组与空白组之间有显著性差异(P<0.05)，反义组与正义组和错义组之间有明显差异(P<0.05)，空白、错义、正义各组之间无明显差异(P>0.05).这说明PDGFR-β对VSMC的增殖有明显的抑制作用(Tab1).PDGFR-β反义寡核苷酸对VSMC的增殖抑制作用呈明显的时间依赖关系.实验中发现5μmol L-1 以下的PDGFR-βAODN作用VSMC48h后对细胞无明显增殖抑制作用(P>0.05)，5μmol L-1 以上浓度的PDGFR-βAODN对细胞有明显增殖抑制作用，表明PDGFR-βAODN增殖抑制作用有明显的浓度依赖效应.
表1 寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的影响 略
2.2 PDGFR┐βAODN对细胞周期的影响 与空白对照组相比10μmol L-1 AODN作用于VSMC24h后细胞G1 期(DNA合成前期)比数分数达到0.70，而空白对照组G1 期细胞只占0.50明显低于AODN组(P<0.05);AODN组S期(DNA合成期)比例为0.07，空白对照组为0.35，两组之间有显著差异(P<0.05).
2.3 PCNA免疫细胞化学染色 空白对照组PCNA染色呈强阳性(Fig1A);5μmol L-1 PDGFR-βAODN作用于VSMC48h后细胞PCNA染色呈阳性;10μmol L-1 以上AODN作用于VSMC48h后细胞PCNA染色呈阴性(Fig1B)，阳性率与对照组比较有明显差异(P<0.05，Tab2，3).
图1 PCNA染色 略
表2 不同寡核苷酸对血管平滑肌细胞PCNA表达的影响 略
表3 反义寡核苷酸浓度对血管平滑肌细胞PCNA表达的影响 略
3 讨论
PDGF对VSMC是一种强烈的促增殖剂和趋化剂，并且PDGF对VSMC的作用有一定的组织特异性[6] .当大量PDGF和β型受体结合后通过络氨酸激酶启动细胞的增殖信号，最终导致VSMC大量增生和再狭窄的发生[7，8] .PDGF的主要作用是使细胞从非分裂状态的G1 期进入分裂周期，起着一种“获能因子”(competence factor)的作用，其他生长因子如成纤维细胞生长因子(FGF)可以促进细胞从G1 期进入DNA合成期[9] .反义寡核苷酸可以通过其特异的碱基序列与目的基因相结合阻止目的基因的表达[10] .因此PDGFR-β反义寡核苷酸可以阻止VSMC的PDGFR-β蛋白的表达从而阻断其与PDGF的结合，使细胞停留于G1 期，最终抑制VSMC的增殖.另外我们在实验中发现PDGFR-βAODN作用于VSMC24h对VSMC无明显增殖抑制作用，这与AODN虽被细胞摄取，但尚未能与目的基因达到充分结合等原因有关;过去的研究证明PCNA是DNA复制和细胞分裂过程中DNA多聚酶最重要的辅助因子.PCNA位于细胞核内，它的表达量与VSMC的增殖活力呈正相关[11] .因此我们在实验中以PCNA的表达强度侧面反映VSMC的增殖活力，结果间接证明了PDGFR-βAODN对VSMC增殖抑制作用.另外也有少数人认为寡核苷酸的作用无需任何序列特异性，而是与各种生长因子或膜蛋白相结合，抑制细胞的迁移、增殖.这与目前大多数同仁的观点不符，与本实验的研究结果也不相符.我们发现正义寡核苷酸和错义寡核苷酸对VSMC的增殖均无明显抑制作用.这说明寡核苷酸对细胞的影响有严格的序列特异性.
PDGFR-βAODN作为基因工程和分子生物学的产物对体外培养VSMC的增殖可以产生很大程度的抑制，另外因为该反义寡核苷酸对于VSMC具有一定的组织特异性，所以PDGFR-βAODN有望能在体内成功抑制血管损伤后VSMC的异常增生和再狭窄的形成.
参考文献:
[1]Gonsalves C，Bandyk DF，Action AJ.Duplex features of vein grafts stenosis and the success of percutaneous transluminal an-gioplasty [J].J Endovasc Surg，1999;6:66-72.
[2]Espinola Klainc，Rupprecht HJ.Impact of restenosis10years after coronary angioplasty [J].Eur Heart J，1998;19:1047-1053.
[3]Zhu HL，Yang JX，Zhang WD，Cui Q，Chen WS.Correlation between extracellular matrix and stenosis of autologous vein grafts in rabbit mAel [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2001;22(5):407-409.
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[5]Zhao HL，Ling SX，Jia B，Li J，Zhang LL，Zhang SF.Inhibito-ry effects of salidroside on hypeoxia-induced proliferation of rab-bit pukmonary arterial smooth muscle cells [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(2):186-190.
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基金项目: 第四军医大学创新工程资助项目(CX99A006)
通讯作者: 侯英萍.Tel.(029)3375453Email.xjhyx@fmmu.edu.cn 作者简介: 顾春虎(1973-)，男(汉族)，安徽省蚌埠市人.住院医生，助教，硕士生(导师乔宏庆).Tel.(029)3375453 Email.Xjhyx@fmmu.edu.cn
第四军医大学西京医院核医学科，陕西西安710033
编辑 许昌泰, 百拇医药(顾春虎 侯英萍 乔宏庆 李焰 王云雅 林国城)