再障患者B19病毒抗原检测及临床意义
关键词: 再生障碍性贫血;人细小病毒B19;免疫荧光技术
0 引言
人细小病毒B19(B19)是与人类疾病密切相关的小DNA病毒，与急性再生障性贫血(AAA)的关系屡有报道
[1] .为探讨B19抗原检测用于诊断AAA患者B19感染的价值及其临床意义，我们应用间接免疫荧光法(IIF)对21例AAA患儿骨髓进行B19抗原检测.
1 对象和方法
1.1 对象 病例组21例，为1998-01/1999-12在我院儿科和血液科住院的急性再障患者，年龄3～13岁，平均年龄6岁3月，均符合第6版《实用儿科学》再障诊断标准.所有患儿均采集新鲜骨髓液0.2mL于无菌肝素抗凝管，-20℃冰箱冻存，同时收集骨髓涂片，冷丙酮固定15min，-20℃密封保存待检.
1.2 方法
1.2.1 IIF法检测再障患者骨髓涂片B19抗原 鼠抗B19病毒特异性mAb IgG(一抗)购自国际生化公司，羊抗鼠FITC标记的IgG(二抗)购自华美生物工程公司，试验步骤参见文献[2].①于待检骨髓涂片上加一抗放于湿盒内4℃过夜.②PBS-5g L-1 BSA液漂洗3次，每次5min，吹干.③加荧光二抗，湿盒内37℃保温30～60min.④PBS-5g L-1 BSA液漂洗2次，每次5min，用蒸馏水洗1次.⑤用500g L-1 缓冲甘油封片，荧光显微镜检.同时设立阳性对照及阴性对照.
1.2.2 巢式PCR检测骨髓B19-DNA 巢式PCR所用引物、DNA提取、PCR反应具体步骤及结果观察参见文献[3].
2 结果
21例AAA患者骨髓中有3例B19抗原阳性，其中1例呈弱阳性，另2例呈强阳性，黄绿色阳性荧光信号主要位于细胞膜及胞质周边，呈点状分布，阳性对照骨髓片呈阳性，阴性对照呈阴性;B19-DNA阳性7例;B19抗原阳性标本DNA亦阳性.B19抗原检测与巢式PCR相比，灵敏度为43%，特异度为100%，总符合率为81%，阳性预告值为100%，阴性预告值为78%.
3 讨论
自1981年Pattison证实B19感染诱发镰状细胞贫血患者再障危象以来，B19感染与再障的关系日益引起广大学者关注.B19感染不仅可引起溶血性贫血患者再障危象，免疫抑制或缺陷患者纯红细胞再障，而且免疫功能正常宿主B19感染引起再障的报道亦愈来愈多.目前国内已建立PCR及巢式PCR技术，并从包括AAA在内的多种疾病患者临床标本中检出B19-DNA，证明PCR具有高度灵敏性和特异性.但IIF法用于AAA患者骨髓B19抗原的检测，国内报道甚少.我们的研究结果说明再障患者B19抗原检测的敏感性低于DNA，用IIF诊断B19感染时需同时检测B19-DNA.
目前，B19引起急性再障的机制尚未完全阐明.许多学者认为与B19细胞受体(即血型P抗原)介导的细胞(尤其是红系细胞)毒作用及免疫损伤有关.我们从AAA患者骨髓中检出3例B19抗原阳性，B19抗原主要位于细胞膜及胞质周边，与国外研究结果基本一致，提示B19对骨髓细胞的直接毒性作用是导致AAA患者血细胞减少的主要原因之一，充分说明人类骨髓为允许B19复制的细胞体系，为B19体外培养提供了实验依据;B19-DNA阴性骨髓片中尚有4例B19抗原阴性，考虑与IIF检测敏感性较低有关，此外我们考虑这些患者血细胞减少主要由免疫机制所介导，B19并未在骨髓中繁殖或病毒产量较少.总之，免疫荧光技术虽然敏感性较低，但简便、快速，有助于了解B19在细胞内的分布以及进行半定量研究，推测B19致病机制，从形态学角度为B19感染诊断提供更直观的信息.
参考文献:
[1]Mustafa MM，Mcclain KL.Diverse hematologic effects of par-vovirus B19infection [J].Pediatr Clin North Am，1996;43(30):809-821.
[2]Vassias I，Perol S，Coulombel L.An situ hybridization tech-nique for the study of B19human parvovirus replication in bone marrow cell cultures [J].J Virol Methods，1993;44(2-3):329-338.
[3]Cheng SQ，Zhang GC，Xu DL.Investigation of parvovirus B19DNA in serum of patients with arthritis by nested PCR [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fouth Mil Med Univ)，1999;20(9):812-814.
作者简介: 曹玉红(1970-)，女(汉族)，河南省偃师市人.硕士，主治医师.Tel.(029)3375399
第四军医大学西京医院儿科，陕西西安710033
编辑 王 睿, 百拇医药(曹玉红 张国成 许东亮)
0 引言
人细小病毒B19(B19)是与人类疾病密切相关的小DNA病毒，与急性再生障性贫血(AAA)的关系屡有报道
[1] .为探讨B19抗原检测用于诊断AAA患者B19感染的价值及其临床意义，我们应用间接免疫荧光法(IIF)对21例AAA患儿骨髓进行B19抗原检测.
1 对象和方法
1.1 对象 病例组21例，为1998-01/1999-12在我院儿科和血液科住院的急性再障患者，年龄3～13岁，平均年龄6岁3月，均符合第6版《实用儿科学》再障诊断标准.所有患儿均采集新鲜骨髓液0.2mL于无菌肝素抗凝管，-20℃冰箱冻存，同时收集骨髓涂片，冷丙酮固定15min，-20℃密封保存待检.
1.2 方法
1.2.1 IIF法检测再障患者骨髓涂片B19抗原 鼠抗B19病毒特异性mAb IgG(一抗)购自国际生化公司，羊抗鼠FITC标记的IgG(二抗)购自华美生物工程公司，试验步骤参见文献[2].①于待检骨髓涂片上加一抗放于湿盒内4℃过夜.②PBS-5g L-1 BSA液漂洗3次，每次5min，吹干.③加荧光二抗，湿盒内37℃保温30～60min.④PBS-5g L-1 BSA液漂洗2次，每次5min，用蒸馏水洗1次.⑤用500g L-1 缓冲甘油封片，荧光显微镜检.同时设立阳性对照及阴性对照.
1.2.2 巢式PCR检测骨髓B19-DNA 巢式PCR所用引物、DNA提取、PCR反应具体步骤及结果观察参见文献[3].
2 结果
21例AAA患者骨髓中有3例B19抗原阳性，其中1例呈弱阳性，另2例呈强阳性，黄绿色阳性荧光信号主要位于细胞膜及胞质周边，呈点状分布，阳性对照骨髓片呈阳性，阴性对照呈阴性;B19-DNA阳性7例;B19抗原阳性标本DNA亦阳性.B19抗原检测与巢式PCR相比，灵敏度为43%，特异度为100%，总符合率为81%，阳性预告值为100%，阴性预告值为78%.
3 讨论
自1981年Pattison证实B19感染诱发镰状细胞贫血患者再障危象以来，B19感染与再障的关系日益引起广大学者关注.B19感染不仅可引起溶血性贫血患者再障危象，免疫抑制或缺陷患者纯红细胞再障，而且免疫功能正常宿主B19感染引起再障的报道亦愈来愈多.目前国内已建立PCR及巢式PCR技术，并从包括AAA在内的多种疾病患者临床标本中检出B19-DNA，证明PCR具有高度灵敏性和特异性.但IIF法用于AAA患者骨髓B19抗原的检测，国内报道甚少.我们的研究结果说明再障患者B19抗原检测的敏感性低于DNA，用IIF诊断B19感染时需同时检测B19-DNA.
目前，B19引起急性再障的机制尚未完全阐明.许多学者认为与B19细胞受体(即血型P抗原)介导的细胞(尤其是红系细胞)毒作用及免疫损伤有关.我们从AAA患者骨髓中检出3例B19抗原阳性，B19抗原主要位于细胞膜及胞质周边，与国外研究结果基本一致，提示B19对骨髓细胞的直接毒性作用是导致AAA患者血细胞减少的主要原因之一，充分说明人类骨髓为允许B19复制的细胞体系，为B19体外培养提供了实验依据;B19-DNA阴性骨髓片中尚有4例B19抗原阴性，考虑与IIF检测敏感性较低有关，此外我们考虑这些患者血细胞减少主要由免疫机制所介导，B19并未在骨髓中繁殖或病毒产量较少.总之，免疫荧光技术虽然敏感性较低，但简便、快速，有助于了解B19在细胞内的分布以及进行半定量研究，推测B19致病机制，从形态学角度为B19感染诊断提供更直观的信息.
参考文献:
[1]Mustafa MM，Mcclain KL.Diverse hematologic effects of par-vovirus B19infection [J].Pediatr Clin North Am，1996;43(30):809-821.
[2]Vassias I，Perol S，Coulombel L.An situ hybridization tech-nique for the study of B19human parvovirus replication in bone marrow cell cultures [J].J Virol Methods，1993;44(2-3):329-338.
[3]Cheng SQ，Zhang GC，Xu DL.Investigation of parvovirus B19DNA in serum of patients with arthritis by nested PCR [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fouth Mil Med Univ)，1999;20(9):812-814.
作者简介: 曹玉红(1970-)，女(汉族)，河南省偃师市人.硕士，主治医师.Tel.(029)3375399
第四军医大学西京医院儿科，陕西西安710033
编辑 王 睿, 百拇医药(曹玉红 张国成 许东亮)