第29卷

    2001年7月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第7期

    832～835

    共振光散射光谱的校正

    黄承志3

    李原芳 奉 萍

    (西南师范大学环境化学研究所 , 重庆 400715)

    摘 要 以罗丹明6G在pH 7. 40时的共振光散射光谱(RLS)为例 , 引进仪器特性因子和分子吸收因子

    讨论荧光分光光度计的检测灵敏度和体系分子吸收对 RLS光谱的影响 , 提出光谱校正方程。在吸收体

    系中 ,吸收带附近的散射光强度降低 ,并导致散射光谱发生畸变。通过光谱校正 , 除消除了不同仪器因

    光源和检测系统的差异对 RLS光谱特性影响外 ,有效地消除了分子吸收的影响 ,提高了测定灵敏度。

    关键词 罗丹明6G, 共振光散射 , 光谱校正

    2000208225收稿;2001202212接受

    本文系国家自然科学基金(29875019) 、教育部优秀年轻教师基金(2000211)和重庆市应用基础研究资助项目

    1 引 言

    使用普通荧光分光光度计可以十分方便地获得分子散射光谱〔 1 ,2〕,能十分灵敏地测定因发生了分

    子组装或聚集的生物大分子物质〔 3～5〕,表征分子染料在表面活性剂或生物大分子存在下的聚集等〔 6 ,7〕。

    在我们的研究过程中发现 ,影响 RLS光谱的因素很多 ,例如仪器灵敏度 ,反应前后粒子大小 ,分子的吸

    收等 ,使用不同的仪器将获得不同特征的 RLS光谱 ,甚至 RLS光谱的特征波长都将发生变化 ,无疑需要

    对 RLS光谱进行校正以后才能获得真正的 RLS光谱特征。Borissevitch〔 8 ,9〕 和姚钢等〔 10. 11〕 讨论了卟啉分

    子聚集和偶氮磺 D与蛋白质作用过程中 RLS光谱校正。在此基础上 ,本文以罗丹明 6G的 RLS特征为

    例 , 结合理论推导 ,讨论了由于仪器灵敏度和体系吸收对 RLS特征的影响。

    2 实验部分

    2. 1 仪器和试剂

    F24500型荧光分光光度计(日本日立公司) , pH计(美国 Orion 公司) 。4. 0 ×10 - 4

    mol L 罗丹明 6G

    (Rh6G)溶液。Tris2HCl 缓冲溶液(pH = 7. 40) 。使用二次蒸馏水 ,所用试剂均为分析纯。

    2. 2 试验方法

    在10 mL 比色管中加入一定体积的4. 0 ×10 - 4

    mol L Rh6G溶液和 1. 0 mL Tris2HCl 缓冲溶液 ,用二

    次蒸馏水稀释至刻度 ,混合均匀后于荧光光度计上于λem =λex处进行同步扫描获得 RLS光谱 ,每间隔

    3. 0 nm取得 RLS强度数据 ,荧光分光光度计的激发和发射狭缝始终保持在 5. 0 nm ,试验在 24～26 ℃下

    进行。RLS数据经450 nm归一化后使用Origin 5. 0软件处理 , 获得体系的归一化 RLS光谱。

    3 结果与讨论

    3. 1 非吸收体系的 RLS光谱校正

    当我们使用普通荧光光度计检测没有光吸收的溶液时 ,可以通过积分在激发( X)和发射( Y)光方向

    溶液被照射高度为 Z0 的体积微元 d xd yZ0 获得:

    Ims = k βI0d xd yZ0 (1)

    其中 Ims是没有光吸收溶液的光散射强度 ,β是比例系数 , I0 是入射光强度 ,d x 和d y 分别是在X 和 Y方

    向的分部微分 , Z0 是激发光在 Z方向上光束所能照射到的溶液高度 ,由仪器性质所决定 ,为一个常数 ,因此 ,积分式(1)得:Ims =βI0 X0 Y0 Z0 (2)

    但在各向同性非吸收体系中 ,光散射强度遵守Rayleigh散射定律 , 与入射波长的四次方成反比。因

    此 ,所获得的光散射信号 Ims对 Rayleigh散射定律的偏离源于仪器的 光源特性和检测灵敏度 , 如果仪器

    参数稳定 , 则仪器参数 S ( λ)仅与波长有关 ,即:

    S ( λ) =

    Ims

    R ( λ)

    (3)

    式中 S ( λ)是仪器随波长变化的仪器参数 , 体现了光源的能量发射和检测器对不同光波长信号的响应 ,为讨论方便 ,我们都使用在450 nm处归一化的 Rayleigh散射光谱 R( λ)和测定的非吸收体系的散射光谱

    Ims ( λ) 。因此在对仪器于不同波长处的灵敏度进行校正后 ,获得非吸收体系的校正 RLS光谱 , 如果使

    用1 cm厚度的比色池 ,则式(3)为:

    ICorr (λ) =

    Ims (λ)

    S (λ)

    =

    βI0 Z0

    S (λ)

    (4)

    式中 ICorr ( λ)是校正后的光散射信号。通过进行式(4)的光谱校正后获得仪器校正曲线λ 2S( λ) ,如图(1)

    图1 空白(缓冲)溶液的 RLS光谱( ● ) 、 Rayleigh理论散

    射光谱( ■ )和 F 24500荧光分光光度计仪器校正因子 S ( λ)

    ( ▲ )

    Fig. 1 resonance light scattering (RLS) spectra of blank so2

    lution ( buffer) ( ●) , calculated rayleigh light scattering( ■) ,and instrument correction factor of F 24500 spectrofuorometer

    ( ▲ ) 。

    所示 , F24500荧光分光光度计在 500～580 nm区域

    有较好的稳定性 ,而在其他区域校正因子变化较大。

    这些变化来源于仪器本身 ,如光源的能量发射系统

    和仪器的信号检测系统。对于一台确定的仪器 ,在

    仪器工作条件稳定的情况下 ,式(4)所表示的各项参

    数是恒定的 ,所以图1所示的非吸收溶液体系的λ 2S

    ( λ)曲线不应发生变化 ......