尿中 L2精氨酸及其甲基化产物的高效液相色谱法测定

    陈本美3

    夏令伟 梁绍先 陈国华 邓富良 (中南大学湘雅医学院分析测试中心 ,长沙 410078)

    张卫茹 陶立坚 (中南大学湘雅医院 ,长沙 410008)

    摘 要 用反相高效液相色谱邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生荧光检测 ,可以直接同时分离和定量尿中的 L2精氨

    酸(L2Arg) 、 NG

    ,NG

    2二甲基精氨酸(ADMA)和NG

    ,N′ G

    2二甲基精氨酸(SDMA) 。方法的平均回收率大于 97 %;含

    量的相对标准差低于4. 6 %;而保留时间的相对标准差低于 0. 32 %;信噪比为 3∶ 1 时 ,其检测限为 0. 3 pmol。

    用该方法测定了正常人和肾衰患者尿中 L2Arg、 ADMA和 SDMA的含量。

    关键词 尿 ,精氨酸 ,二甲基精氨酸 ,高效液相色谱法

    2001206227收稿;2001211222接受

    1 引 言

    二甲基精氨酸包括不对称二甲基精氨酸(NG

    ,NG

    2dimethyl2L2arginine , asymmetric DMA , ADMA)和对

    称二甲基精氨酸(NG

    N′ G

    2dimethyl2L2arginine , symmetric DMA , SDMA) 。它们由内皮细胞合成后释放于血

    浆中 ,存在于血和尿中1 ,2。ADMA是一氧化氮合酶(NOS)的一种内源性抑制剂 ,抑制一氧化氮(NO)的

    合成。肾衰病人由于ADMA的排泄减少 ,ADMA在体内积聚 ,引起肾衰高血压1。SDMA没有这种生物

    活性 ,但ADMA和 SDMA都干扰精氨酸及其它阳离子氨基酸的运输3。ADMA 在高血压肾病及其它相

    关疾病中所起的作用 ,引起了各有关领域研究者的广泛兴趣。因此 ,检测生物样品中 L2精氨酸及其甲

    基化产物的各种分析方法也随之发展起来4 ～9

    ,其中最有效的方法是高效液相色谱法(HPLC)

    4 ～7。最

    近 ,又发展起来毛细管电泳(CE)

    8

    和液质联用法(LCP MS)

    9。由于生物样品中 ADMA 和 SDMA 与其它

    氨基酸的浓度差别很大 ,HPLC将它们完全分离难度大 ,因此 ,许多人采用离子交换柱进行固相萃取 ,经

    过浓缩再进行色谱分析5 ,7

    ,这种方法不仅费时 ,步骤繁琐 ,而且在样品处理过程中会损失一部分被测

    物 ,回收率不高 ,影响了分析结果的准确性 ,更不利于大批样品的分析。我们曾采用直接衍生法分离了

    人血浆中ADMA4

    ,但没有同时报道 L2Arg和 SDMA的数据。我们经过大量研究 ,对色谱条件进行优化 ,样品经固体磺基水杨酸去蛋白 ,不须经过任何纯化步骤 ,直接用OPA进行荧光衍生反应后上色谱柱分

    离 ,使ADMA、 SDMA及 L2Arg与其它氨基酸达到基线分离。成功地分析了正常人与肾衰病人尿中的上

    述物质 ,大大简化了样品处理步骤 ,提高了分析效率和分析结果的准确度。

    2 实验部分

    2. 1 试剂与标准

    氨基酸、 ADMA和 SDMA标准(美国 Sigma 公司) ,用 0. 1 molP L HCl 配制成 0. 5 mmolP L 的标准贮备

    液 ,标准应用液以0. 1 molP L HCl 稀释贮备液 ,使各标准物质的浓度为25μmolP L。OPA和β 2巯基乙醇(美

    国 Sigma 公司) ;四氢呋喃(THF)和醋酸钠(分析纯) ,甲醇(色谱纯) 。所有用水均为双蒸水。

    2. 2 仪器

    色谱系统为LC210ADvp 高效液相色谱仪(日本岛津公司) ,包括LC210ADvp 四元梯度泵、 CTO210Avp

    柱温箱、 RF210Axl 荧光检测器、 7725手动进样器(美国 Rheodyne 公司)和 Echrom98色谱工作站(大连依利

    特科学仪器有限公司) 。分析柱为 Nova2Pak C18柱(150 ×4. 6 mm ,4μ) ;保护柱为 C18 guard2 pak (美国

    Waters公司) 。

    第30卷

    2002年5月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第5期

    611～6142. 3 色谱条件

    流动相为50 mmolP L 的醋酸钠(pH 6. 8) 、甲醇和 THF(A :82∶ 17∶ 1 ; B :22∶ 77∶ 1) 。临用前超声脱气。

    各成分均经过0. 45μm滤膜过滤 ,柱温为30 ℃,流速为1. 0 mLP min。梯度程序见表 1。荧光检测器的激

    发波长338 nm ,发射波长425 nm。采用峰面积定量。

    表1 分离甲基化精氨酸的时间程序

    Table 1 Gradient program for separation O 2phthaldialdehyde (OPA)2dimethylarginine derivatives

    时间 Time (min) 0 6 16 25 29 32 35

    流动相 A Mobile phase A( %) 95 88 66 30 0 0 95

    流动相 B Mobile phase B( %) 5 12 34 70 100 100 5

    2. 4 样品收集和制备

    正常人和肾衰病人均收集24 h尿 ,测量总体积 ,取1 mL 尿样 ,加 10 mg磺基水杨酸 ,混匀后冰浴 10

    min ,2000 g离心10 min ,取上清液用0. 45μm滤膜过滤 ......