蛋白质水解液中氨基酸组成的定量分析

    丁雅韵 谢孟峡3

    康 娟 (北京师范大学分析测试中心 ,北京 100875)

    摘 要 以氯甲酸292芴基甲酯(FMOC 2Cl)为柱前衍生化试剂在液相色谱上分离 17 种常见氨基酸的衍生物并

    测定其摩尔吸光系数。用绝对分析法和标准曲线法对标准氨基酸溶液进行了定量分析 ,除组氨酸外两种方法

    测定结果的相对偏差在5. 00 %以内。对氨基酸的稳定性进行模拟水解实验 ,发现在 110℃ P 24 h的水解条件

    下 ,丝氨酸等不稳定氨基酸的降解较在150℃ P 1. 5 h条件下小。用绝对分析法定量测定了牛胰岛素在不同水

    解条件下水解液中氨基酸的含量 ,大部分氨基酸的相对收率都接近100 %。

    关键词 绝对分析法 ,氨基酸 ,氯甲酸292芴基甲酯 ,牛胰岛素

    2001205204收稿;2001211226接受

    1 引 言

    蛋白质中氨基酸的含量测定一般是先对蛋白质进行水解 ,使其形成游离的氨基酸 ,然后再用柱前衍

    生和液相色谱分离分析。传统氨基酸的定量测定方法是标准曲线法或内标法 ,步骤较为繁杂 ,且内标法

    会对某些氨基酸带来较大的误差。近年来发展起来的绝对分析法在液相色谱的定量分析方面开拓了一

    条新的思路 ,并在氨基酸和肽的定量分析1 ,2

    ,环境污染物芳香胺的高效液相色谱定量分析3 ,4

    方面有具

    体的应用。

    绝对分析法的数学表达式5 ,6

    为:

    Ai F = 10

    3

    ε bN0 = 10

    3

    ε bVloop ci

    (1)

    式中 , F(cm3

    · min

    - 1)为流动相的流量 , b (cm)为吸收池光程 ,V (dm3)为定量进样管的体积 ,10

    3

    为数

    值因子 ,以保证所得的摩尔吸光系数值与文献值一致; N0 (mol)是流出溶质分子的摩尔数 ,若在色谱过程

    中溶质没有丢失 ,它等于进样时溶质的量;ε(L· mol

    - 1

    · cm- 1)为在使用波长下溶质的摩尔吸光系数; ci

    (mol L)是样品的浓度; Ai

    (min)为溶质的色谱峰面积。本文以 FMOC2Cl 为氨基酸的液相色谱柱前衍生

    化试剂 ,用绝对分析法和标准曲线法测定标准氨基酸混合液中各氨基酸的浓度 ,两种方法得到的结果基

    本一致 ,进一步验证了绝对分析法的可靠性;并将其运用于氨基酸模拟水解液和蛋白质水解液中各氨基

    酸含量的测定 ,得到了比较满意的结果。

    2 实验部分

    2. 1 仪器与试剂

    美国Waters公司液相色谱仪:510 HPLC泵 ,Rheodyne 7725 型六通阀进样器(配以经校正体积为1512

    μ L 的定量环) ,810色谱工作台;Waters 490E可变波长紫外2可见检测器。LUNA 5 μ18

    C色谱柱(250 mm×

    4. 60 mm I.D. ) 。

    2. 2 氨基酸和蛋白质的水解

    取准确体积的氨基酸或胰岛素的6 molP L 盐酸20. 5 %苯酚溶液于水解管中 ,超声 ,同时抽真空脱气 ,N2 密封保护 ,油浴加热水解。水解完毕 ,将水解液旋蒸至干 ,用10

    - 2

    molP L 稀盐酸定容 ,待色谱分析。

    2. 3 衍生化步骤及色谱分离

    取准确体积的氨基酸的10

    - 2

    molP L 盐酸溶液或水解液(总浓度约为 2 ×10

    - 3

    molP L) ,室温下加入等

    体积的硼酸缓冲溶液(0. 2 molP L ,pH = 9. 20) ,然后加入2倍体积的FMOC2Cl 溶液(溶于乙腈 ,浓度为10

    - 2

    molP L) ,衍生15 min后 ,再加入2倍体积的ADAM溶液(溶于乙腈和水体积比为 1∶ 1 的溶液 ,浓度为 4 ×

    第30卷

    2002年4月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第4期

    418～42110

    - 2

    molP L) ,进样分析。

    采用二元梯度洗脱 ,流动相 A :50 mmolP L 的 NaAc2HAc 缓冲体系 ,pH = 4. 20 ;流动相B :乙腈。流速

    为1. 0 mLP min ,紫外检测器波长为263 nm ,定量管体积为15. 2μ L。色谱分离图及流动相梯度见图1。

    3 结果与讨论

    3. 1 衍生反应的重复性

    对于标准氨基酸混合液 ,在选定的实验条件下 ,进行了 6 次平行衍生及色谱分析 ,各色谱峰峰面积

    的相对标准偏差均小于3. 00 % ,衍生、分离分析的平行性较好。

    图1 17种氨基酸分离色谱图

    Fig. 1 The chromatogram of 17 standard amino acids

    3. 2 绝对分析法和标准曲线法所得实验结果

    的比较

    表1列出了用绝对分析法测定的 17 种氨

    基酸 FMOC2衍生物的摩尔吸光系数 ,从这些数

    据看出 ,对于单衍生产物其摩尔吸光系数基本

    都在2. 00 ×10

    4

    左右 ,色氨酸(TRP)因本身带

    有发色团 ,其摩尔吸光系数在 2. 25 ×10

    4

    ,双衍

    生产物的摩尔吸光系数对不同的氨基酸有较

    大的差异 ,胱氨酸(CYS 2CYS)的双衍生产物比

    较稳定 ,其摩尔吸光系数相当于两个单衍生的

    氨基酸 ,在 3. 89 ×10

    4

    左右。而其它几个双衍

    生产物 (CYS、 LYS、 HIS) 的摩尔吸光系数在

    3116×10

    4

    ～3. 47 ×10

    4

    之间 ,这些双衍生产物

    的摩尔吸光系数比较低的原因是这些氨基酸

    的第二个可衍生基团的衍生物不稳定所致。

    对于绝大部分氨基酸 ,绝对分析法和标准曲线法测定结果吻合得很好(见表 1) ,两种方法之间的相

    对偏差均小于5. 00 %;组氨酸的相对偏差大于5. 00 % ,是由于它的双衍生物产物不稳定。

    表1 标准曲线法及绝对分析法测定氨基酸浓度结果的比较

    Table 1 Comparison of the results obtained from calibration curve and absolute analysis method

    氨基酸 Amino acid

    摩尔吸光系数ε

    Molar absorption

    coefficient

    标准曲线法 Standard calibration

    curve method (μmolP L)

    绝对分析法 Absolute analysis

    method (μmolP L)

    相对偏差 Relative deviation

    ( %)

    精氨酸 Arginine 1. 98× 104 ......