评述与进展

    酶催化反应模拟作用的研究及分析应用

    黄应平3

    蔡汝秀 (三峡大学化学系 ,宜昌 443000) (武汉大学化学系 ,武汉 430072)

    摘 要 生物转化是化学和生物学交叉研究领域 ,包括生物催化剂(酶)工程和反应介质工程两大要素。一方

    面 ,开发性能优良的模拟酶 ,能模拟天然酶在生物体内的高催化活性(酶模拟) ;另一方面 ,介质工程可以用体

    外的方法模拟酶在生物体内细胞膜的微环境(膜模拟) ,对用体外的方法研究生物体内催化信息 ,探讨生物体

    系的生命现象具有重要的意义。

    关键词 过氧化物酶 ,模拟酶 ,反相胶束 , 评述

    2001204212收稿;2001211221接受

    本文系国家自然科学基金(No. 29775015)及博士基金资助课题

    1 引 言

    生物酶催化剂和反应介质是研究生物酶催化体系的两大要素1 , 2。生物酶催化剂工程(biocatalytic

    engineering)利用生物学、化学及物理学的方法对天然酶催化剂进行改造 , 或通过化学合成方法制备既

    具有天然酶优点又可避免其不足的模拟酶(或人工酶、仿酶)

    3;反应介质工程(medium engineering)寻求

    酶催化反应理想的溶剂体系 , 使酶催化反应的溶剂介质能模拟生物细胞膜的微环境(如反相胶束介质

    体系) , 促使酶呈现“超级活性” 4。对酶催化反应酶模拟和膜模拟的双重模拟作用研究是当今酶法分

    析研究的主要趋势 ,不仅可以发展高灵敏度的分析方法 , 而且对探讨生物体内酶催化反应机理 , 用体

    外的方法提取生物体内酶催化反应信息有重要的意义。

    2 过氧化物模拟酶的研究

    过氧化物酶 (POD ; EC 1. 11. 1. 7)是一种以血红素为辅基 , 参与生物体内生理代谢的天然酶5 ,6。

    以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase , HRP)为代表的过氧化物酶及模拟酶在其结构、化学性质及应

    用研究方面多有报道7 ～12。HRP除了价格昂贵 , 容易失活以外 , 在酶法免疫分析中 , 不利于抗原和抗

    体之间的反应 , 而且标记过程复杂。因此模拟酶的研究工作具有重要的意义。

    目前主要通过化学修饰、固定化技术和化学合成手段改善酶的催化效率 , 包括天然酶的修饰、固定

    化酶和模拟酶(人工酶、仿酶)的开发13。对过氧化物模拟酶的研制主要是根据 HRP的结构特点 , 制备

    能模拟 HRP催化特性的小分子化合物模拟物14。事实上目前模拟酶的研究主要集中在模拟天然酶的

    催化部位和结合部位两个方面。

    过氧化物模拟酶主要包括自然酶和化学合成酶。自然酶有模拟 HRP催化活性的血红蛋白、肌红

    素、漆酶、叶绿素、维生素 B12、细胞色素 C15 , 16

    及生物小分子氯化血红素( hemin) 或高羟氯化血红素

    (hamin)

    17;合成的过氧化物酶主要包括可溶性金属卟啉化合物18

    、金属酞菁化合物19 , 20

    、席夫碱金属

    络合物21

    和化学修饰的过氧化物模拟酶(如化学修饰的 PEG 2HRP 及 hemin2BSA)

    22

    、固定化酶 (如

    MTTP42resin及 HRP2chitosan beads)

    23。在化学合成的过氧化物模拟酶中 , 以金属卟啉化合物研究较多。

    这也是由于卟啉分子为 HRP催化部位的主要结构模型(母体卟吩核) , 而且具有合成简单和其结构周

    边功能团的位置和方向可以加以控制、轴向配体周围的空间大小和相互作用方向控制余地较大等特点

    所决定的24。目前主要是在卟啉周边取代基、轴向配体的引入及中心离子的改变上入手 , 合成过氧化

    第30卷

    2002年5月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 评述与进展

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第5期

    615～620物酶的模拟物25。Saito

    26 , 27

    等首次以阴离子交换树脂吸附可溶性金属卟啉化合物作为过氧化物模拟

    酶进行了大量的研究。慈云祥研究小组28 , 29

    及沈含熙研究小组30 , 31

    合成了一批新的金属卟啉络合物

    模拟 HRP的催化作用。研究表明:金属卟啉模拟酶中心离子的电子结构和氧化态以及其金属卟啉对额

    外配位体的亲合力决定着酶的活性32

    ,但活性一般比 HRP要低。另外配体相同的不同金属元素对模拟

    酶的活性也有较大的影响。文献33

    发现组氨酸和咪唑均使 Hemin的催化活性明显提高 , 原因是组氨酸

    和咪唑模拟了 HRP辅基的第五配体中多肽链上的组氨酸残基。说明金属卟啉化合物催化性能不如

    HRP的根本原因是由于其缺乏蛋白质的三维空间结构。金属酞菁和席夫碱两类化合物中铁离子的电

    子结构、氧化价态和额外配体的亲合力决定了其可以模拟过氧化物酶的催化部位 , 而体现过氧化物酶

    的催化活性34。

    近年来 , 利用大分子化合物对客体分子的超分子识别作用 , 使其成为模拟过氧化物酶良好的结合

    部位35。目前对环糊精及其修饰物研究较多。毛陆原36

    将 FePPS4 包合到β 2CD 聚合物树脂上形成了

    固定超分子作为 HRP模拟酶 , 使其催化活性、稳定性、催化显色灵敏度均有改善。蔡汝秀37 ,38

    研究了β 2

    CD2Hemin作为 HRP的模拟酶 , 用于 H2O2 含量的光度分析。 β 2CD2Hemin不仅具有比 Hemin和金属卟啉

    模拟物高的催化活性 , 而且使酶催化反应的介质酸度趋向与 HRP催化相似的酸度条件。这表明β 2CD

    模拟了天然酶蛋白质的三维空间结构即酶的结合部位 , 而体现出比一般合成酶(如金属卟啉化合物)较

    高的催化活性。除此之外 , 杯芳烃、环番、大环多胺同样也可以模拟酶的结合部位39。氯化血红素是

    HRP的辅基 , 其羟化高铁血红素催化活性以单位重量计算比 HRP高40 倍。许金钩40

    研究小组对氯化

    血红素、羟化高铁血红素天然小分子及氯化血红素标记蛋白质复合物作为 HRP模拟酶作了较多的研

    究。

    此外 , 自然界中一些天然蛋白质也能模拟 HRP的催化特性(称自然酶) 。如和 HRP具有相似辅基

    的血红蛋白、肌红蛋白和细胞色素 P450。血红蛋白是一种寡聚蛋白质。以往人们主要集中在对血红蛋

    白输氧功能、蛋白质结构特征及有关“血红蛋白病”的研究。蔡汝秀41 ,42

    首次用血红蛋白作为 HRP的模

    拟物用于分析应用 , 表明其催化活性与 HRP相似。漆酶为含4个紧密结合的铜 C的糖蛋白氧化酶 , 其

    催化分子氧对底物多酚及其相关物的氧化 , 担负着把底物中的电子转移给氧的功能。虽然其结构和催

    化反应机理与 HRP有一定的差异 , 但对酶催化反应而言都存在给氧中间体的过程。文献43 ,44

    进行了有

    关漆酶氧化邻苯二胺和2 , 32二氰基25 , 62二卤氰醌底物的探讨 , 表明漆酶也具有 HRP的催化性质。由

    于其催化氧化邻苯二胺不需外加 H2O2 , 其酶催化体系可以很好的用于反相胶束介质中的酶催化研究。

    自然酶由于蛋白质能很好的模拟 HRP的活性部位以及调控部位 , 其展示着比目前合成模拟酶更高的

    催化活性。

    多年来 , 人工合成模拟酶与天然 HRP的催化效率还存在着较大的差别 , 而且天然酶与模拟酶的最

    佳pH值存在差异。现在虽然注重用大环化合物模拟 HRP的结合部位。但对酶催化的其它因素没有重

    视 , 如氨基酸多肽链的调控作用等 ......