切应力对PLGA膜片上内皮细胞形态及功能的影响
Effect of shear stress on the form and function of vascular endothelial cells on PLGA mesh
XIONG Meng, XIA WenSen, LU KaiHua，AI YuFeng， TIAN JinHong, GUO ShuZhong
1Department of Plastic Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China, 2Department of Plastic Surgery, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210000, China
【Abstract】 AIM: To study the growth of vascular endothelial cells (ECs) on PLGA mesh under shear stress in vascular bioreactor. METHODS: After seeded on PLGA mesh, vascular ECs were given shear stress in vascular bioreactor for 7 d and the growth and the externalization of the cells were observed. RESULTS: After cultured for 5-7 d, the vascular ECs grew well and they elongated in appearance. The cells had a tendency to change their appearances along the orientation of the fluid. The ECs secretary volume was (0.875±0.011)×10-9 mol/min. CONCLUSION: The materials of PLGA have a good affinity to the cells. The ECs function of releasing NO and other active substances of blood vessels is normal. Primary experimental data have been obtained for further researches on the tissueengineering vessel construction in vitro by using bioreactors and on the improvement of intima tolerance to blood flows impact.
【Keywords】 shear stress; vessel endothelial cells; bioreactors
【摘要】 目的: 探讨血管生物反应器中切应力作用下血管内皮细胞(ECs)在PLGA膜片的生长情况. 方法: 接种血管ECs于可降解基质膜片PLGA上,施加不同切应力,观察细胞生长情况及分泌情况. 结果: 在培养5～7 d后，ECs生长良好,形态略有伸长，细胞整体上有沿流体方向改变形态的趋势. ECs在PLGA膜片上NO的分泌量为(0.875±0.011)×10-9 mol/min. 结论: PLGA材料对细胞亲和力较好. ECs释放NO等血管活性物质功能正常. 为进一步开展采用生物反应器体外构筑组织工程血管及探索提高组织工程血管内膜层抗血流冲击能力提供实验数据.
【关键词】 切应力；血管内皮细胞；生物反应器
0引言
血管的内腔面被覆一层内皮细胞(ECs)，ECs具有多种功能，它不仅维持血管壁的形态及内表面的光滑，还可调节血管的通透性及分泌多种生物活性物质(如PGI2，ET等)，在组织工程中将ECs接种于可降解材料的表面，形成一层类似于体内血管管腔的内皮屏障结构，防止移植物植入体内后的血栓形成及钙化. 在以往的研究中，人工血管内皮化后临床效果较差的主要原因就是由于血流长时间冲击导致ECs的脱落而形成血栓. 本实验中，我们采用自行研制的血管生物反应器，在切应力的作用下，对牛血管ECs在聚羟基乙酸/聚乳酸(PLGA)膜片材料上的生长情况进行了初步的研究，为进一步开展采用生物反应器体外构筑组织工程血管及探索提高组织工程血管内膜层抗血流冲击能力提供初步的实验数据.
1材料和方法
1.1材料
I型胶原酶为Invitrogen公司产品， RPMI 1640培养液及DMEM培养液为Gibco公司产品，血管生物反应器为自行研制，NO测定试剂盒由第三军医大野战外科研究所提供.
1.2方法
取新鲜屠宰的牛主动脉长约10 cm，0.9 g/L无菌生理盐水反复冲洗管腔内外，去除附壁的血细胞，剪除外膜脂肪与筋膜，结扎小分支血管，钳夹闭合主动脉管腔一端，从另一端注入0.1 g/L I型胶原酶，至稍充盈，夹闭端口后置入37℃孵箱中孵育20 min(中间翻转一次)，将液体收集入10 mL离心管中，800～1000 r/min离心5～7 min，弃去上清，加入1 mL 100 mL/L RPMI 1640培养液，反复吹打，形成细胞悬液，倒置显微镜下行细胞计数，测浓度3×108/L，将细胞悬液移入25 mL培养瓶中，24 h后换液，细胞贴壁生长后4～5 d传代，稳定传代备用.
1.2.1切应力的计算根据切应力公式τ=6 η Q/Wh2 [1] . 其中η为循环液的黏度，Q为循环液的流量，W为流室的宽度，h为流室的高度. 在本实验中，η=0.75 mPaS，W=6 cm，h=3.5 cm，因此切应力τ与流量Q的关系为τ=0.2563Q(单位：dyn/cm2，Q：mL/min).
1.2.2实验系统的构成整个实验系统采用我们自行研制的血管生物反应器进行,系统由流动小室、恒流泵、医用硅胶管道、储液瓶构成. 灌流液由恒流泵泵出后经管道流入流动小室，对ECs施加剪切应力，再经管道回到储液瓶中. 整套系统置于37℃恒温的CO2培养箱中. 灌流液使用DMEM培养液.
1.2.3切应力的作用将3～7代牛血管ECs以3.5×105/L个细胞的浓度种植于同等大小的PLGA膜片材料上(采用同等大小的盖玻片作为对照)，体外培养7 d后，将PLGA材料与盖玻片共同置于生物反应器的灌流小室中，通过恒流泵给予ECs不同大小的切应力作用，根据国内外文献[2]的报道，我们采用1，2，5和10 dyn/cm2 4种切应力分别作用于第1，3，5，7日. 每日在倒置显微镜下观察膜片及盖玻片上细胞的形态.
1.2.4NO的测定在第7日，收集1 min内的灌流液标本，采用NO测定试剂盒，按照试剂盒的说明进行测定，观察流体切应力作用下ECNO的表达.
统计学处理：数据用x±s表示，统计分析方法为t检验.
2结果
ECs种入玻片及PLGA膜片上，均可在倒置显微镜下观察，细胞3～4 h即开始贴壁、伸展，初始状态多为圆形，伸展后呈短梭形，核呈圆形或长圆形，有一到数个核仁，可见核分裂像. 细胞开始呈集落生长，生长较快，5 d后各个细胞集落开始互相融合，细胞呈多角形，融合成片后呈现特征性的鹅卵石样形态，排列致密，胞质丰富. 一般5～7 d传代，经多次传代(超过8代后)或冻存复苏后，细胞形态会有所改变，可呈长梭形或多角形(Fig 1A). 在培养5～7 d后，可逐步发现材料及盖玻片上的ECs形态伸长，细胞间隙略有增加，部分区域细胞长轴顺流体的方向而排列，细胞整体上有沿流体方向改变形态的趋势(Fig 1B,C). 7 d后在10 dyn/cm2流体切应力的作用下，测得内皮细胞在PLGA膜片上NO的分泌量为(0.875±0.011)×10-9 mol/min(n=6)，在盖玻片上的分泌量为(1.175±0.074)×10-9 mol/min(n=6). 两片上的分泌量差别有统计学意义(P<0.05).
3讨论
有关流体作用下ECs的变化的研究较多[3,4]，但比较体外ECs在传统的培养介质(玻璃)与生物可降解材料PLGA膜片的研究还未见报道. 我们发现，不仅静息状态下ECs在PLGA膜片上生长状态良好，在流场切应力较长时间作用下也未见明显的细胞变圆及脱落的情况(与盖玻片上表现相近)，说明PLGA材料的细胞亲和力较好.
ECs释放NO等血管活性物质是流体力学变化调节血管张力的重要途径之一. 一般以测定NO的代谢产物NO2来间接反映NO的含量. 实验中采用NO检测试剂盒，初步测定了ECs在PLGA膜片上NO的表达情况，与在盖玻片上比较，两者无统计学差异，说明在PLGA上生长的ECs不仅与材料较好地结合，且具有一定的分泌功能. 从另一个侧面反映了PLGA材料的生物相容性. 在流场的较长时间的作用下，可促进ECs的定向排布，有与流场方向相一致的排列分布趋势，以往研究表明，人工血管(PTFE等)种植ECs虽然能够在短时间内提高血管的通常率，存在的主要问题是种植的ECs在血流冲击下大多脱落[5]. 因此，血管移植物在体内就面临着内膜层能否耐受血流的冲击. 在体内环境中，ECs一方面依赖机体对血流调节的保护机制，另一方面依赖自身对流体环境产生适应性变化. ECs与基质的牢固结合依赖细胞内微丝形成的应力纤维(stress fiber). 在非流动的环境下形成的ECs，其微丝主要以分布在细胞周围的致密周围束的形式出现，细胞中间没有粗大的微丝束，只有少量短的微丝随意分布；而体外给予较小的剪切应力，ECs即使没有形态的变化，细胞的中央也出现应力纤维，说明剪切应力有诱导ECs形成应力纤维的作用.
因此，在流体环境中，对种植的ECs逐步进行剪切应力适应性的“训练”，可促使中央应力纤维的形成，从而有利于内膜层对抗剪切应力的作用. 人体血管所受的生理状态剪切应力大约为5～36 dyn/cm2. 在本实验中，我们逐步增加剪切应力从1～10 dyn/cm2(剪切应力数值界于毛细血管与中小动脉之间)，逐步给予ECs剪切应力的“锻炼”，提高其抗血流冲击的能力. 下一步工作中，我们将具体探讨合适的剪切应力训练量. 因为过大可使ECs来不及形成应力纤维就已经脱落，而太小则诱导的应力纤维少，难以达到抵抗体内较大剪切应力的目的.
我们还观察到流体环境中ECs在PLGA或盖玻片上的增殖均慢于静态培养中，这与其他文献报道结果一致. 流动产生的剪切应力对ECs的分裂具有抑制的作用. 可能是一个相对处于静止状态的单层ECs有助于其正常功能的发挥. 我们采用自行研制的血管生物反应器，在剪切应力的作用下，对血管ECs在聚羟基PLGA膜片材料上的生长情况进行了初步的研究，经过为期7 d的运行，整个反应器工作正常，无污染，加液、取样方便，基本上达到了设计的要求，也为进一步开展采用生物反应器体外构筑组织工程血管及探索提高组织工程血管内膜层抗血流冲击能力提供初步的实验数据.
【参考文献】
[1] 丛兴中，姜宗来，李玉泉. 用于内皮细胞和平滑肌细胞联合培养的流动腔系统[J]. 医用生物力学，2001；16(1)：1-5.
Cong XZ,Jiang ZL,Li YQ. A new flow chamber system for endothelial and smooth muscle cells coculture model[J]. J Med Biomech, 2001；16(1)：1-5.
[2] 韩林，张宝仁，柳兆荣,等. 稳态层流下的内皮细胞形态特征变化[J]. 第二军医大学学报，1999;20(10)：801-804.
Han L,Zhang BR,Liu ZR,et al. Changes in the morphometric feature of endothelial cells under steady flow state[J]. Acad J Sec Mil Med Univ, 1999;20(10)：801-804.
[3] 薛军辉,张作明. 流体切应力作用血管内皮系统机制的研究[J]. 第四军医大学学报，2001;22(增刊)：97-100.
Xue JH,Zhang ZM. The study on mechanisms of the effects of fluid shear stress on endothelial cells[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2001;22(Suppl)：97-100.
[4] 张文胜， 陈槐卿. 内皮细胞应力反应元件的研究进展[J]. 生物医学工程学，2001;18(3):461-465.
Zhang WS,Chen HQ. The study on the shear stress responsive element in endothelial cells[J]. J Biomed Eng, 2001;18(3):461-465.
[5] Sayers SD，Raptis S，Berce M. Longterm results of femorotibial bypass with vein or polytetrafluoroethylene [see comments] [J]. Br J Surg, 1999;86(1):137.
基金项目：国家自然科学基金重点项目(30070777)
通讯作者：郭树忠.Tel.(029)84775301 Email.XJZXWKA@fmmu.edu.cn
作者简介：熊猛(1972)，男(汉族)，甘肃省兰州市人.主治医师,博士生(导师鲁开化). Tel.(029)84775305Email.zxwkgsz@fmmu.edu.cn
(1第四军医大学西京医院整形外科,陕西 西安 710033,2东南大学附属中大医院整形外科，江苏 南京 210000)
编辑袁天峰, http://www.100md.com(熊猛, 夏文森, 鲁开化,艾玉峰, 田晋洪,郭树忠)
XIONG Meng, XIA WenSen, LU KaiHua，AI YuFeng， TIAN JinHong, GUO ShuZhong
1Department of Plastic Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China, 2Department of Plastic Surgery, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210000, China
【Abstract】 AIM: To study the growth of vascular endothelial cells (ECs) on PLGA mesh under shear stress in vascular bioreactor. METHODS: After seeded on PLGA mesh, vascular ECs were given shear stress in vascular bioreactor for 7 d and the growth and the externalization of the cells were observed. RESULTS: After cultured for 5-7 d, the vascular ECs grew well and they elongated in appearance. The cells had a tendency to change their appearances along the orientation of the fluid. The ECs secretary volume was (0.875±0.011)×10-9 mol/min. CONCLUSION: The materials of PLGA have a good affinity to the cells. The ECs function of releasing NO and other active substances of blood vessels is normal. Primary experimental data have been obtained for further researches on the tissueengineering vessel construction in vitro by using bioreactors and on the improvement of intima tolerance to blood flows impact.
【Keywords】 shear stress; vessel endothelial cells; bioreactors
【摘要】 目的: 探讨血管生物反应器中切应力作用下血管内皮细胞(ECs)在PLGA膜片的生长情况. 方法: 接种血管ECs于可降解基质膜片PLGA上,施加不同切应力,观察细胞生长情况及分泌情况. 结果: 在培养5～7 d后，ECs生长良好,形态略有伸长，细胞整体上有沿流体方向改变形态的趋势. ECs在PLGA膜片上NO的分泌量为(0.875±0.011)×10-9 mol/min. 结论: PLGA材料对细胞亲和力较好. ECs释放NO等血管活性物质功能正常. 为进一步开展采用生物反应器体外构筑组织工程血管及探索提高组织工程血管内膜层抗血流冲击能力提供实验数据.
【关键词】 切应力；血管内皮细胞；生物反应器
0引言
血管的内腔面被覆一层内皮细胞(ECs)，ECs具有多种功能，它不仅维持血管壁的形态及内表面的光滑，还可调节血管的通透性及分泌多种生物活性物质(如PGI2，ET等)，在组织工程中将ECs接种于可降解材料的表面，形成一层类似于体内血管管腔的内皮屏障结构，防止移植物植入体内后的血栓形成及钙化. 在以往的研究中，人工血管内皮化后临床效果较差的主要原因就是由于血流长时间冲击导致ECs的脱落而形成血栓. 本实验中，我们采用自行研制的血管生物反应器，在切应力的作用下，对牛血管ECs在聚羟基乙酸/聚乳酸(PLGA)膜片材料上的生长情况进行了初步的研究，为进一步开展采用生物反应器体外构筑组织工程血管及探索提高组织工程血管内膜层抗血流冲击能力提供初步的实验数据.
1材料和方法
1.1材料
I型胶原酶为Invitrogen公司产品， RPMI 1640培养液及DMEM培养液为Gibco公司产品，血管生物反应器为自行研制，NO测定试剂盒由第三军医大野战外科研究所提供.
1.2方法
取新鲜屠宰的牛主动脉长约10 cm，0.9 g/L无菌生理盐水反复冲洗管腔内外，去除附壁的血细胞，剪除外膜脂肪与筋膜，结扎小分支血管，钳夹闭合主动脉管腔一端，从另一端注入0.1 g/L I型胶原酶，至稍充盈，夹闭端口后置入37℃孵箱中孵育20 min(中间翻转一次)，将液体收集入10 mL离心管中，800～1000 r/min离心5～7 min，弃去上清，加入1 mL 100 mL/L RPMI 1640培养液，反复吹打，形成细胞悬液，倒置显微镜下行细胞计数，测浓度3×108/L，将细胞悬液移入25 mL培养瓶中，24 h后换液，细胞贴壁生长后4～5 d传代，稳定传代备用.
1.2.1切应力的计算根据切应力公式τ=6 η Q/Wh2 [1] . 其中η为循环液的黏度，Q为循环液的流量，W为流室的宽度，h为流室的高度. 在本实验中，η=0.75 mPaS，W=6 cm，h=3.5 cm，因此切应力τ与流量Q的关系为τ=0.2563Q(单位：dyn/cm2，Q：mL/min).
1.2.2实验系统的构成整个实验系统采用我们自行研制的血管生物反应器进行,系统由流动小室、恒流泵、医用硅胶管道、储液瓶构成. 灌流液由恒流泵泵出后经管道流入流动小室，对ECs施加剪切应力，再经管道回到储液瓶中. 整套系统置于37℃恒温的CO2培养箱中. 灌流液使用DMEM培养液.
1.2.3切应力的作用将3～7代牛血管ECs以3.5×105/L个细胞的浓度种植于同等大小的PLGA膜片材料上(采用同等大小的盖玻片作为对照)，体外培养7 d后，将PLGA材料与盖玻片共同置于生物反应器的灌流小室中，通过恒流泵给予ECs不同大小的切应力作用，根据国内外文献[2]的报道，我们采用1，2，5和10 dyn/cm2 4种切应力分别作用于第1，3，5，7日. 每日在倒置显微镜下观察膜片及盖玻片上细胞的形态.
1.2.4NO的测定在第7日，收集1 min内的灌流液标本，采用NO测定试剂盒，按照试剂盒的说明进行测定，观察流体切应力作用下ECNO的表达.
统计学处理：数据用x±s表示，统计分析方法为t检验.
2结果
ECs种入玻片及PLGA膜片上，均可在倒置显微镜下观察，细胞3～4 h即开始贴壁、伸展，初始状态多为圆形，伸展后呈短梭形，核呈圆形或长圆形，有一到数个核仁，可见核分裂像. 细胞开始呈集落生长，生长较快，5 d后各个细胞集落开始互相融合，细胞呈多角形，融合成片后呈现特征性的鹅卵石样形态，排列致密，胞质丰富. 一般5～7 d传代，经多次传代(超过8代后)或冻存复苏后，细胞形态会有所改变，可呈长梭形或多角形(Fig 1A). 在培养5～7 d后，可逐步发现材料及盖玻片上的ECs形态伸长，细胞间隙略有增加，部分区域细胞长轴顺流体的方向而排列，细胞整体上有沿流体方向改变形态的趋势(Fig 1B,C). 7 d后在10 dyn/cm2流体切应力的作用下，测得内皮细胞在PLGA膜片上NO的分泌量为(0.875±0.011)×10-9 mol/min(n=6)，在盖玻片上的分泌量为(1.175±0.074)×10-9 mol/min(n=6). 两片上的分泌量差别有统计学意义(P<0.05).
3讨论
有关流体作用下ECs的变化的研究较多[3,4]，但比较体外ECs在传统的培养介质(玻璃)与生物可降解材料PLGA膜片的研究还未见报道. 我们发现，不仅静息状态下ECs在PLGA膜片上生长状态良好，在流场切应力较长时间作用下也未见明显的细胞变圆及脱落的情况(与盖玻片上表现相近)，说明PLGA材料的细胞亲和力较好.
ECs释放NO等血管活性物质是流体力学变化调节血管张力的重要途径之一. 一般以测定NO的代谢产物NO2来间接反映NO的含量. 实验中采用NO检测试剂盒，初步测定了ECs在PLGA膜片上NO的表达情况，与在盖玻片上比较，两者无统计学差异，说明在PLGA上生长的ECs不仅与材料较好地结合，且具有一定的分泌功能. 从另一个侧面反映了PLGA材料的生物相容性. 在流场的较长时间的作用下，可促进ECs的定向排布，有与流场方向相一致的排列分布趋势，以往研究表明，人工血管(PTFE等)种植ECs虽然能够在短时间内提高血管的通常率，存在的主要问题是种植的ECs在血流冲击下大多脱落[5]. 因此，血管移植物在体内就面临着内膜层能否耐受血流的冲击. 在体内环境中，ECs一方面依赖机体对血流调节的保护机制，另一方面依赖自身对流体环境产生适应性变化. ECs与基质的牢固结合依赖细胞内微丝形成的应力纤维(stress fiber). 在非流动的环境下形成的ECs，其微丝主要以分布在细胞周围的致密周围束的形式出现，细胞中间没有粗大的微丝束，只有少量短的微丝随意分布；而体外给予较小的剪切应力，ECs即使没有形态的变化，细胞的中央也出现应力纤维，说明剪切应力有诱导ECs形成应力纤维的作用.
因此，在流体环境中，对种植的ECs逐步进行剪切应力适应性的“训练”，可促使中央应力纤维的形成，从而有利于内膜层对抗剪切应力的作用. 人体血管所受的生理状态剪切应力大约为5～36 dyn/cm2. 在本实验中，我们逐步增加剪切应力从1～10 dyn/cm2(剪切应力数值界于毛细血管与中小动脉之间)，逐步给予ECs剪切应力的“锻炼”，提高其抗血流冲击的能力. 下一步工作中，我们将具体探讨合适的剪切应力训练量. 因为过大可使ECs来不及形成应力纤维就已经脱落，而太小则诱导的应力纤维少，难以达到抵抗体内较大剪切应力的目的.
我们还观察到流体环境中ECs在PLGA或盖玻片上的增殖均慢于静态培养中，这与其他文献报道结果一致. 流动产生的剪切应力对ECs的分裂具有抑制的作用. 可能是一个相对处于静止状态的单层ECs有助于其正常功能的发挥. 我们采用自行研制的血管生物反应器，在剪切应力的作用下，对血管ECs在聚羟基PLGA膜片材料上的生长情况进行了初步的研究，经过为期7 d的运行，整个反应器工作正常，无污染，加液、取样方便，基本上达到了设计的要求，也为进一步开展采用生物反应器体外构筑组织工程血管及探索提高组织工程血管内膜层抗血流冲击能力提供初步的实验数据.
【参考文献】
[1] 丛兴中，姜宗来，李玉泉. 用于内皮细胞和平滑肌细胞联合培养的流动腔系统[J]. 医用生物力学，2001；16(1)：1-5.
Cong XZ,Jiang ZL,Li YQ. A new flow chamber system for endothelial and smooth muscle cells coculture model[J]. J Med Biomech, 2001；16(1)：1-5.
[2] 韩林，张宝仁，柳兆荣,等. 稳态层流下的内皮细胞形态特征变化[J]. 第二军医大学学报，1999;20(10)：801-804.
Han L,Zhang BR,Liu ZR,et al. Changes in the morphometric feature of endothelial cells under steady flow state[J]. Acad J Sec Mil Med Univ, 1999;20(10)：801-804.
[3] 薛军辉,张作明. 流体切应力作用血管内皮系统机制的研究[J]. 第四军医大学学报，2001;22(增刊)：97-100.
Xue JH,Zhang ZM. The study on mechanisms of the effects of fluid shear stress on endothelial cells[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2001;22(Suppl)：97-100.
[4] 张文胜， 陈槐卿. 内皮细胞应力反应元件的研究进展[J]. 生物医学工程学，2001;18(3):461-465.
Zhang WS,Chen HQ. The study on the shear stress responsive element in endothelial cells[J]. J Biomed Eng, 2001;18(3):461-465.
[5] Sayers SD，Raptis S，Berce M. Longterm results of femorotibial bypass with vein or polytetrafluoroethylene [see comments] [J]. Br J Surg, 1999;86(1):137.
基金项目：国家自然科学基金重点项目(30070777)
通讯作者：郭树忠.Tel.(029)84775301 Email.XJZXWKA@fmmu.edu.cn
作者简介：熊猛(1972)，男(汉族)，甘肃省兰州市人.主治医师,博士生(导师鲁开化). Tel.(029)84775305Email.zxwkgsz@fmmu.edu.cn
(1第四军医大学西京医院整形外科,陕西 西安 710033,2东南大学附属中大医院整形外科，江苏 南京 210000)
编辑袁天峰, http://www.100md.com(熊猛, 夏文森, 鲁开化,艾玉峰, 田晋洪,郭树忠)