人脑胶质瘤骨桥蛋白的表达
Expression and significance of osteopontin in human gliomas
SUN ChangYi, BU XingYao
1Clinical Laboratory, 2Department of Neurosurgery, Henan Provincial Peoples Hospital, Zhengzhou 450003, China
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of osteopontin in human gliomas as well as its function. METHODS: Osteopontin expression in human normal brain cells and glioma cells was detected by immunohistochemical staining and RTPCR method. RESULTS: Osteopontin was expressed in glioma cells but was not expressed in human normal brain cells. CONCLUSION: Osteopontin expression in glioma is closely related to the malignant degree of glioma.
【Keywords】 glioma; osteopontin; immunohistochemistry
【摘要】 目的：探讨骨桥蛋白(OPN)在人脑胶质瘤中的作用、表达及其意义. 方法： 采用RTPCR及免疫组化染色方法检测脑胶质瘤组织和正常组织中骨桥蛋白. 结果： 骨桥蛋白在胶质瘤组织细胞中表达，而在正常脑组织细胞中无表达，而且OPN的表达浓度与胶质瘤恶性程度呈正相关. 结论： 人脑胶质瘤中OPN的表达与其恶性程度密切相关.
【关键词】 神经胶质瘤；骨桥蛋白；免疫组织化学
0引言
人脑胶质瘤侵袭性生长是术后复发和临床疗效差的主要原因，过程涉及到细胞信号传导、细胞黏附、细胞迁移等多个环节. 骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种含有整合素结合序列GRGDS的分泌型磷酸化酸性糖蛋白，它对于OPN的黏附功能起重要作用. 整合素是OPN的受体，OPN通过细胞黏附序列GRGDS识别整合素与细胞结合，刺激了细胞信号的传送途径，促进了细胞的黏附与迁移，促使了细胞向恶性发展[1-3]，我们采用免疫组化和RTPCR方法，探讨OPN在脑胶质瘤中的表达.
1材料和方法
1.1材料
河南省人民医院200308/200502手术切除胶质瘤转移和正常脑组织标本共36例. 按WHO病理分级将胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ级，其中Ⅰ级6例，Ⅱ级7例，Ⅲ级6例，Ⅳ级4例，转移癌8例，正常脑组织5例.
1.2方法
1.2.1免疫组化染色采用SP染色三步法. SP试剂盒购于美国ZYMED生物技术公司. 按操作说明进行各组的OPN免疫组化染色. 简要步骤： 30 mL/L过氧化氢室温孵育，DH2O冲洗，PBS浸泡，100 mL/L山羊血清封闭；滴加适当比例稀释的一抗工作液，PBS冲洗；滴加生物素标记二抗，PBS冲洗；滴加辣根过氧化物酶标记物，显色剂(DAB)显色. 阳性对照用已知OPN表达阳性的组织切片，阴性对照用PBS代替一抗，以胞浆/胞膜内出现棕黄色或棕色颗粒为阳性细胞.
1.2.2总RNA的提取和RTPCR① 每0.1 g组织中加入1 mL Trizol，提取总RNA并按说明书操作. ② 逆转录反应： 总RNA 4 μg, 0.5 g/L oligo(Dt) 1 μL,加入一定量DPEC处理水,使总体积少于15 μL，放70℃ 5 min. 将反应体系立即置冰上，再加入5 mmol/L Buffer 6 μL,10 mmol/L dNTP 1 μL, 833.5 μkat/L RNAsin 0.5 μL, 3.334 mkat/L MMLV 1 μL,用DPEC处理水定容于30 μL. 37℃ 1 h, 94℃ 5 min. ③ PCR： 将逆转录产物进行扩增. 引物是自行设计并由上海生物有限公司合成. OPN上游引物序列为5′CTGATGCTACAGACGAGGAC 3′(668687)；下游引物序列为5′ACTATCAATCACATCGGAAT 3′(912893)；内参照G3PDH上游引物序列为5′GGTCGGAGTCAACGGATTGGTCG 3′(90113)；下游引物序列为5′CCTCCGACGCCTGCTTCACCA 3′ (877856). 50 μL的反应体系中加入10 mmol/L buffer 2μL, 25 mmol/L MgCl2 10 mmol/L dNTP 1 μL,G3PDH引物各1 μL, OPN引物各1 μL, 83.35 μkat/L Taq酶0.5 μL,反转录产物5 μL,加DEPC处理水至50 μL. 94℃ 5 min预变性，94℃ 30 s→55℃ 1 min→72℃ 80 s,共30个循环，72℃ 10 min,4℃冷却后-20℃保存. ④ 电泳及定量分析：PCR产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，凝胶成像系统分析灰度值，结果为OPN灰度值/G3PDH灰度值.
统计学处理： 各组织相对积分值以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行数据处理，组间差异比较采用非参数秩和检验.
2结果
在正常脑组织中(Fig 1)未见棕黄色或棕色阳性颗粒，即没有表达OPN，而在胶质瘤组织(Fig 2)细胞膜和细胞质中以及血管内皮细胞均见棕黄色或棕色阳性颗粒，即表达OPN. 且IV级胶质瘤组织中OPN的表达要比II级胶质瘤组织中表达明显增加(Tab 1).表1RTPCR检测OPN mRNA在正常人脑组织和人脑胶质瘤组织中的表达量(略)
3讨论
OPN是一种细胞分泌性蛋白，富含甘氨酸、精氨酸、丝氨酸、天冬氨酸残基的磷酸化酸性糖蛋白[2],它首先由骨骼中分离出，在人体免疫调节、细胞信号传导、炎症反应、癌肿的转移中起重要作用，通过其受体融合素及CD44等促进细胞趋化、黏附、迁移并刺激细胞信号的传送途径[4-6]，从而促进了细胞的恶性发展. 免疫组化结果检测发现恶性星形细胞瘤表达OPN的量较高，而良性星形细胞瘤与非肿瘤组织表达OPN的量较低，这些结果也表明胶质瘤细胞能表达OPN，且表达程度与它的恶性程度相关[1]，而与癌细胞的转移有关的是OPN中的GRGDS序列通过其受体整合素与细胞结合完成对细胞的黏附与迁移作用. Takano等[7]认为OPN与血管生成有关，可介导OPNmRNA在血管内皮中的表达.
本结果说明，OPN和胶质瘤恶性程度之间及胶质瘤与正常脑组织间存在内在联系，统计学上呈明显的正相关性. 有学者认为，OPN在启动巨噬细胞介导的细胞素Th1、抑制素Th2的延迟性超敏反应中起重要作用，肿瘤的生长常常因为机制缺乏正常的免疫识别能力和抵抗能力来调节应急反应[8]，而OPN可能在这种情形中起到了关键性的作用. 而在转移癌中OPN的积分稍低于Ⅲ～Ⅳ级脑胶质瘤中OPN的积分，原因是OPN主要与癌瘤的侵袭转移及细胞迁移有关. 在转移肿瘤与正常组织交界处表达比较强，在肿瘤实质中心部分表达不对周围脑组织影响，而主要是挤压和引起脑水肿为主，这也许可以解释为什么转移癌与脑组织的手术界限一般比较清楚，且术后神经功能少有缺失，复发相对较少.
关于OPN在组织细胞中的阳性表达，从20世纪90年代开始，国内外很多学者就对它与许多组织、细胞(血管平滑肌细胞和血管内皮细胞)、肿瘤(人脑胶质瘤)的密切关系进行报道. 1996年Bautista等[9]建立了一种血中OPN抗原检测方法. 杨力等[10]观察到OPN在侵袭转移胃癌中的表达. 但是OPN在微血管及内皮细胞中强阳性表达，而在低级别的星性细胞瘤微血管及内皮细胞系统中的表达呈弱阳性，正常微血管内皮中的阳性表达，还未见系统的表达. OPN在人脑胶质瘤微血管及内皮细胞中强阳性表达，而在低级别的星性细胞瘤微血管及内皮细胞系统中表达呈弱阳性，正常微血管及内皮细胞系统不表达，这与Takano等[7]所认为的OPN与血管生成并可介导OPN在微血管内皮细胞中的表达、促进血管快速生成、刺激内皮细胞的迁移有关. 刘智敏等[11]报道了粘着斑相关非激酶是血管生成的一个标志，对胶质瘤的迁移有抑制作用. 本结果表明OPN表达的强弱，是胶质瘤血管生成的一个标志，与胶质瘤的生成呈正相关. 这些实验与报道，或许可以证明，通过抗血管治疗，能为抗胶质瘤提供一条新的治疗途径.
【参考文献】
[1]靖大道, 李继坤, 黄君剑,等. 骨桥蛋白mRNA的表达与胃癌临床病理分期的关系[J]. 胃肠病学, 2004; 9(3): 137-140.
Jing DD, Li JK, Huang JJ, et al. Relationship between osteopontin mRNA expression and the clinicopathological staging of gastric cancer[J]. Chin J Gastr, 2004; 9(3): 137-140.
[2]Rittling SR, Chambers AF. Role of osteopontin in tumour progression [J]. Br J Cancer, 2004; 90(10):1877-1881.
[3]Hynes RO. Integrins: Versatility, modulation, and signaling in cell adhesion [J]. Cell, 1992; 69(1):11-25.
[4]柴锡庆, 郑斌, 韩梅,等. 骨桥蛋白的制备及功能研究[J]. 中国老年病学杂志, 2004; 24(8): 725-727.
Chai XQ, Zheng B, Han M, et al. Preparation and characterization of osteopontin [J]. Chin J Geront, 2004; 24(8): 725-727.
[5]Oates AJ, Barraclough R, Rudland PS. The role of osteopontin in tumorigenesis and metastasis [J]. Invasion Metastasis, 1997; 17(1):1-15.
[6]Weber GF, Ashkar S, Glimcher MJ, et al. Receptorligand interaction between CD44 and osteopontin (Eta1)[J]. Science, 1996; 271(5248):509-512.
[7]Takano S, Tsuboi K, Tomono Y. et al. Tissue factor, osteopontin, alphavbeta3 integrin expression in microvasculature of gliomas associated with vascular endothelial growth factor expression [J]. Br J Cancer, 2000; 82(12):1967-1973.
[8]Weber GF, Ashkar S. Molecular mechanisms of tumor dissemination in primary and metastatic brain cancers [J]. Brain Res Bull, 2000; 53(4):421-424.
[9]Bautista DS, Saad Z, Chambers AF, et al. Quantification of osteopontin in human plasma with an ELISA: Basal levels in preand postmenopausal women [J]. Clin Biochem, 1996; 29(3):231-239.
[10]杨力, 张东涛, 郭新宁. 骨桥蛋白和核因子κB在侵袭转移性胃癌中的表达[J]. 中国肿瘤临床, 2004; 31(16): 901-904.
Yang L, Zhang DT, Guo XN. The Expression of the Osteopontin and Nuclear FactorκB in the Invasion and Metastasis of Gastric Cancer [J]. Chin J Clin Onco, 2004; 31(16): 901-904.
[11]刘智敏, 韩梅, 温进坤. 粘着斑相关非激酶对骨桥蛋白促血管平滑肌细胞迁移的抑制作用及分子机制[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2004; 20(1): 131-137.
Liu ZM, Han M, Wen JK. Effect of focal related nonkinase on osteopontininduced vascular smooth muscle cell migration [J]. Chin J Biochem Mol Biol, 2004; 20(1): 131-137.
作者简介：孙长义(1957)，男(汉族)，河南省郑州市人. 副主任技师. Tel. (0371)65580208Email. schy371@sina.com
(河南省人民医院： 1检验科， 2神经外科，河南 郑州 450003)
编辑袁天峰, http://www.100md.com(孙长义，步星耀)
SUN ChangYi, BU XingYao
1Clinical Laboratory, 2Department of Neurosurgery, Henan Provincial Peoples Hospital, Zhengzhou 450003, China
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of osteopontin in human gliomas as well as its function. METHODS: Osteopontin expression in human normal brain cells and glioma cells was detected by immunohistochemical staining and RTPCR method. RESULTS: Osteopontin was expressed in glioma cells but was not expressed in human normal brain cells. CONCLUSION: Osteopontin expression in glioma is closely related to the malignant degree of glioma.
【Keywords】 glioma; osteopontin; immunohistochemistry
【摘要】 目的：探讨骨桥蛋白(OPN)在人脑胶质瘤中的作用、表达及其意义. 方法： 采用RTPCR及免疫组化染色方法检测脑胶质瘤组织和正常组织中骨桥蛋白. 结果： 骨桥蛋白在胶质瘤组织细胞中表达，而在正常脑组织细胞中无表达，而且OPN的表达浓度与胶质瘤恶性程度呈正相关. 结论： 人脑胶质瘤中OPN的表达与其恶性程度密切相关.
【关键词】 神经胶质瘤；骨桥蛋白；免疫组织化学
0引言
人脑胶质瘤侵袭性生长是术后复发和临床疗效差的主要原因，过程涉及到细胞信号传导、细胞黏附、细胞迁移等多个环节. 骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种含有整合素结合序列GRGDS的分泌型磷酸化酸性糖蛋白，它对于OPN的黏附功能起重要作用. 整合素是OPN的受体，OPN通过细胞黏附序列GRGDS识别整合素与细胞结合，刺激了细胞信号的传送途径，促进了细胞的黏附与迁移，促使了细胞向恶性发展[1-3]，我们采用免疫组化和RTPCR方法，探讨OPN在脑胶质瘤中的表达.
1材料和方法
1.1材料
河南省人民医院200308/200502手术切除胶质瘤转移和正常脑组织标本共36例. 按WHO病理分级将胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ级，其中Ⅰ级6例，Ⅱ级7例，Ⅲ级6例，Ⅳ级4例，转移癌8例，正常脑组织5例.
1.2方法
1.2.1免疫组化染色采用SP染色三步法. SP试剂盒购于美国ZYMED生物技术公司. 按操作说明进行各组的OPN免疫组化染色. 简要步骤： 30 mL/L过氧化氢室温孵育，DH2O冲洗，PBS浸泡，100 mL/L山羊血清封闭；滴加适当比例稀释的一抗工作液，PBS冲洗；滴加生物素标记二抗，PBS冲洗；滴加辣根过氧化物酶标记物，显色剂(DAB)显色. 阳性对照用已知OPN表达阳性的组织切片，阴性对照用PBS代替一抗，以胞浆/胞膜内出现棕黄色或棕色颗粒为阳性细胞.
1.2.2总RNA的提取和RTPCR① 每0.1 g组织中加入1 mL Trizol，提取总RNA并按说明书操作. ② 逆转录反应： 总RNA 4 μg, 0.5 g/L oligo(Dt) 1 μL,加入一定量DPEC处理水,使总体积少于15 μL，放70℃ 5 min. 将反应体系立即置冰上，再加入5 mmol/L Buffer 6 μL,10 mmol/L dNTP 1 μL, 833.5 μkat/L RNAsin 0.5 μL, 3.334 mkat/L MMLV 1 μL,用DPEC处理水定容于30 μL. 37℃ 1 h, 94℃ 5 min. ③ PCR： 将逆转录产物进行扩增. 引物是自行设计并由上海生物有限公司合成. OPN上游引物序列为5′CTGATGCTACAGACGAGGAC 3′(668687)；下游引物序列为5′ACTATCAATCACATCGGAAT 3′(912893)；内参照G3PDH上游引物序列为5′GGTCGGAGTCAACGGATTGGTCG 3′(90113)；下游引物序列为5′CCTCCGACGCCTGCTTCACCA 3′ (877856). 50 μL的反应体系中加入10 mmol/L buffer 2μL, 25 mmol/L MgCl2 10 mmol/L dNTP 1 μL,G3PDH引物各1 μL, OPN引物各1 μL, 83.35 μkat/L Taq酶0.5 μL,反转录产物5 μL,加DEPC处理水至50 μL. 94℃ 5 min预变性，94℃ 30 s→55℃ 1 min→72℃ 80 s,共30个循环，72℃ 10 min,4℃冷却后-20℃保存. ④ 电泳及定量分析：PCR产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，凝胶成像系统分析灰度值，结果为OPN灰度值/G3PDH灰度值.
统计学处理： 各组织相对积分值以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行数据处理，组间差异比较采用非参数秩和检验.
2结果
在正常脑组织中(Fig 1)未见棕黄色或棕色阳性颗粒，即没有表达OPN，而在胶质瘤组织(Fig 2)细胞膜和细胞质中以及血管内皮细胞均见棕黄色或棕色阳性颗粒，即表达OPN. 且IV级胶质瘤组织中OPN的表达要比II级胶质瘤组织中表达明显增加(Tab 1).表1RTPCR检测OPN mRNA在正常人脑组织和人脑胶质瘤组织中的表达量(略)
3讨论
OPN是一种细胞分泌性蛋白，富含甘氨酸、精氨酸、丝氨酸、天冬氨酸残基的磷酸化酸性糖蛋白[2],它首先由骨骼中分离出，在人体免疫调节、细胞信号传导、炎症反应、癌肿的转移中起重要作用，通过其受体融合素及CD44等促进细胞趋化、黏附、迁移并刺激细胞信号的传送途径[4-6]，从而促进了细胞的恶性发展. 免疫组化结果检测发现恶性星形细胞瘤表达OPN的量较高，而良性星形细胞瘤与非肿瘤组织表达OPN的量较低，这些结果也表明胶质瘤细胞能表达OPN，且表达程度与它的恶性程度相关[1]，而与癌细胞的转移有关的是OPN中的GRGDS序列通过其受体整合素与细胞结合完成对细胞的黏附与迁移作用. Takano等[7]认为OPN与血管生成有关，可介导OPNmRNA在血管内皮中的表达.
本结果说明，OPN和胶质瘤恶性程度之间及胶质瘤与正常脑组织间存在内在联系，统计学上呈明显的正相关性. 有学者认为，OPN在启动巨噬细胞介导的细胞素Th1、抑制素Th2的延迟性超敏反应中起重要作用，肿瘤的生长常常因为机制缺乏正常的免疫识别能力和抵抗能力来调节应急反应[8]，而OPN可能在这种情形中起到了关键性的作用. 而在转移癌中OPN的积分稍低于Ⅲ～Ⅳ级脑胶质瘤中OPN的积分，原因是OPN主要与癌瘤的侵袭转移及细胞迁移有关. 在转移肿瘤与正常组织交界处表达比较强，在肿瘤实质中心部分表达不对周围脑组织影响，而主要是挤压和引起脑水肿为主，这也许可以解释为什么转移癌与脑组织的手术界限一般比较清楚，且术后神经功能少有缺失，复发相对较少.
关于OPN在组织细胞中的阳性表达，从20世纪90年代开始，国内外很多学者就对它与许多组织、细胞(血管平滑肌细胞和血管内皮细胞)、肿瘤(人脑胶质瘤)的密切关系进行报道. 1996年Bautista等[9]建立了一种血中OPN抗原检测方法. 杨力等[10]观察到OPN在侵袭转移胃癌中的表达. 但是OPN在微血管及内皮细胞中强阳性表达，而在低级别的星性细胞瘤微血管及内皮细胞系统中的表达呈弱阳性，正常微血管内皮中的阳性表达，还未见系统的表达. OPN在人脑胶质瘤微血管及内皮细胞中强阳性表达，而在低级别的星性细胞瘤微血管及内皮细胞系统中表达呈弱阳性，正常微血管及内皮细胞系统不表达，这与Takano等[7]所认为的OPN与血管生成并可介导OPN在微血管内皮细胞中的表达、促进血管快速生成、刺激内皮细胞的迁移有关. 刘智敏等[11]报道了粘着斑相关非激酶是血管生成的一个标志，对胶质瘤的迁移有抑制作用. 本结果表明OPN表达的强弱，是胶质瘤血管生成的一个标志，与胶质瘤的生成呈正相关. 这些实验与报道，或许可以证明，通过抗血管治疗，能为抗胶质瘤提供一条新的治疗途径.
【参考文献】
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Chai XQ, Zheng B, Han M, et al. Preparation and characterization of osteopontin [J]. Chin J Geront, 2004; 24(8): 725-727.
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[7]Takano S, Tsuboi K, Tomono Y. et al. Tissue factor, osteopontin, alphavbeta3 integrin expression in microvasculature of gliomas associated with vascular endothelial growth factor expression [J]. Br J Cancer, 2000; 82(12):1967-1973.
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[10]杨力, 张东涛, 郭新宁. 骨桥蛋白和核因子κB在侵袭转移性胃癌中的表达[J]. 中国肿瘤临床, 2004; 31(16): 901-904.
Yang L, Zhang DT, Guo XN. The Expression of the Osteopontin and Nuclear FactorκB in the Invasion and Metastasis of Gastric Cancer [J]. Chin J Clin Onco, 2004; 31(16): 901-904.
[11]刘智敏, 韩梅, 温进坤. 粘着斑相关非激酶对骨桥蛋白促血管平滑肌细胞迁移的抑制作用及分子机制[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2004; 20(1): 131-137.
Liu ZM, Han M, Wen JK. Effect of focal related nonkinase on osteopontininduced vascular smooth muscle cell migration [J]. Chin J Biochem Mol Biol, 2004; 20(1): 131-137.
作者简介：孙长义(1957)，男(汉族)，河南省郑州市人. 副主任技师. Tel. (0371)65580208Email. schy371@sina.com
(河南省人民医院： 1检验科， 2神经外科，河南 郑州 450003)
编辑袁天峰, http://www.100md.com(孙长义，步星耀)