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编号:10955400
Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和测序
http://www.100md.com 《第四军医大学学报》 2006年第3期
     Cloning and sequencing of recombinant plasmid affecting survivin gene translation by RNA interference technique

    SHI CongYan, GUO DeYu

    Institute of Pathology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

    【Abstract】 AIM: To clone the recombinant plasmid affecting survivin gene translation by RNA interference and to analyze the nucleic acid sequence of the recombinant plasmid for new gene therapy for tumors. METHODS: Two DNA sequences containing small hairpin structure were designed and synthesized. The complement form was obtained by annealing and being cloned into vector pSilencer 3.1H1 hygro and the recombinant plasmid was transformed into strain DH5α. The plasmid identified by restriction enzyme was used for sequencing. RESULTS: The recombinant plasmid was cloned and the aimed sequence was obtained. CONCLUSION: Successful cloning of the recombinant plasmid helps to find a new gene therapy for tumors.

    【Keywords】 survivin gene; RNA interfering; recombinant plasmid

    【摘要】 目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定. 方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer3.1H1hygro中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定. 结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列. 结论:Survivin靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,可利用所得的小RNA序列干扰survivin基因的mRNA转录,供抗肿瘤研究参考.

    【关键词】 survivin基因;RNA干扰;重组表达载体

    0引言

    RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近几年发展起来的新技术. 用小片段RNA二聚体(small interfering RNA, siRNA)对高等哺乳动物细胞进行转导,成功排除了长片段双链RNA (doublestranded RNA, dsRNA)在哺乳动物细胞内引起非特异性干扰的现象,但其主要障碍是长于30 nt的双链RNA将激活抗病毒机制,导致非特异性的RNA转录降解. 而体外合成21 nt的siRNA能够成功地特异性抑制哺乳动物的基因表达[1-3]. 本实验我们针对凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein, IAP)基因家族的survivin基因的短发夹结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)构建重组表达载体,为体外和体内抗肿瘤研究提供平台.

     1材料和方法

    1.1材料

    含有人H1启动子的pSilencer 3.1H1hygro质粒为美国Ambion公司产品,由西南医院皮肤科王继文博士赠送. 克隆用大肠杆菌DH5α由本校烧伤科实验室董征学硕士赠送. 限制性内切酶BamHⅠ,HindⅢ及T4 DNA连接酶、核酸分子质量标准λHindⅢ digest, DL2000均为TaKaRa公司产品. E.Z.N.AR质粒小量抽提试剂盒、E.Z.N.AR胶回收试剂盒均为美国Omega公司产品.

    1.2方法

    1.2.1Survivin基因干扰片段shRNA的设计与合成氯化钙法制备DH5α大肠杆菌感受态细胞冻存于-70℃备用;扩增和纯化质粒 pSilencer3.1H1hygro. 根据Genbank中报道的survivin基因核苷酸序列(No NM 001168),参考shRNA设计原则进行设计[4] ,最后选择出三条片段作为survivin基因干扰片段. 以间隔序列连接干扰片段正向和反向序列,两端加酶切位点,最后得到具有回文结构和发夹结构(hairpin siRNA)的干扰片段序列,并将其送北京赛百盛生物试剂公司合成.

    1.2.2pSilencer3.1H1hygrosiRNA表达载体的构建将每对要退火的两条片段分别取2 μL与46 μL退火缓冲液混合,利用PCR仪加热至95℃ 3 min,然后70℃水浴,自然冷却至室温. 用45 μL的无酶去离子水稀释5 μL的退火双链,使其终浓度为8 mg/L. 载体pSilencer3.1H1hygro经BamHⅠ和HindⅢ双酶切. 将退火片段与经酶切后的载体按摩尔比3∶1的比例进行连接反应,同时设立阴性对照和质粒pSilencer3.1H1hygro的阳性对照反应,置16℃过夜. 将连接产物各取4 μL分别接种于100 μL的DH5α感受态细胞中进行转化. 挑取单菌落扩增培养,E.Z.N.AR质粒小量抽提试剂盒进行质粒试抽提. 用限制性内切酶BglⅡ分别对重组质粒进行单酶切(此位点为目的序列所特有的酶切位点)鉴定. 得到的重组质粒分别命名为pSilencer3.1H1hygrosiRNA1, pSilencer3.1H1hygrosiRNA2,pSilencer3.1H1hygrosiRNA3.

    1.2.3重组质粒测序鉴定将鉴定证实后的三个重组质粒各取1管菌液送大连宝生物工程有限公司测序. 所用引物为M13+.

     2结果

    2.1载体双酶切鉴定回收酶切产物行12 g/L琼脂糖凝胶电泳后,可见环状质粒已被切开,大片段约为4.491 kb,小片段为61 bp因太小而无法检测(图1).

    2.2筛选重组质粒pSilencer3.1H1hygrosiRNA1,pSilencer 3.1H1hygrosiRNA2,pSilencer 3.1H1hygrosiRNA3培养板上均有细菌克隆长出,形态和大小基本一致;pSilencer3.1H1hygro质粒的阳性转化对照有大量细菌克隆长出;阴性对照培养板上无细菌克隆长出,连接转化可能成功.

    2.3单酶切鉴定重组质粒第2孔经BglⅡ单酶切的pSilencer3.1H1hygro,因该质粒无此酶切位点故仍保持环状结构;第4,6,8孔为经BglⅡ单酶切的三个重组质粒,因该重组质粒含有此酶切位点故可被酶切成线状结构(图2).

    2.4重组质粒测序鉴定测序结果均包含目的序列(图3).

     3讨论

    肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病,同时也是凋亡异常的疾病. 肿瘤中细胞凋亡现象很可能是机体对抗肿瘤的主动措施,因此细胞凋亡在肿瘤的发生发展及治疗中起着关键性的作用. 细胞凋亡(apoptosis)受多个基因的凋控,抑制凋亡的基因主要包括bcl2基因家族和IAP家族. 其中,survivin基因是IAP基因家族的新成员. 1997年Ambrosini等[5]利用效应细胞蛋白酶受体1(effector cell protease receptor1,EPR)cDNA在人类基因组文库中筛选克隆得到的新基因. Survivin N端含有一个杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列(BIR)分子,其中含有对抑制凋亡有重要作用的氨基酸残基Trp67,Pro33和Cys84,survivin通过这些氨基酸残基与Caspase3和Caspase7结合抑制Caspase的活性,在COOH端有一个由40个氨基酸组成的α螺旋结构,通过α螺旋结构与细胞分裂微管结合,从而抑制细胞凋亡. Survivin基因特异性表达于人和鼠的胚胎发育组织,在终末分化的成人组织中不表达,而在转化细胞株和人体内大多数恶性肿瘤组织中明显表达[6]. 它与细胞凋亡和增殖、肿瘤血管的生成密切相关,还参与细胞周期凋控,并影响着肿瘤的发生发展. 因此,以survivin为靶点的肿瘤基因治疗成为肿瘤治疗研究的重要方面.

    3.1H1hygrosiRNA3测序鉴定

    抑制基因表达的方法很多,目前研究使用较多的主要有反义RNA技术、RNA干扰技术、基因敲除等. 反义RNA技术的使用量较大,抑癌效率低. 而RNAi则具有选择余地大和扩增放大效应[7],只需微量特异的dsRNA即可产生明显的抑癌效果,具有抑制作用强、稳定性高、细胞摄取相对容易等优点. 除了技术方面的差别,两者的作用机制也不同. RNAi技术中siRNA序列选择余地大,21~23 nts中如果改变一个核苷酸,就可以使该siRNA序列不对靶向mRNA起作用,因此RNAi可以应用于单个核苷酸突变基因的抑制表达. 以质粒为载体将siRNA导入细胞内,所形成的siRNA专一作用于靶向基因的细胞系可用于较长时间的功能研究[8-9]. RNAi技术与基因敲除技术相比,后者往往需要较长时间才能了解所缺失功能基因后的生物学现象,而前者则在转染细胞48 h后即可了解抑制靶向基因表达后的生物学现象.

    质粒pSilencer3.1H1hygro包括一种人H1 RNA聚合酶Ⅲ启动子,利用相对单一的启动子和终止序列产生大量的小RNA. 同时,位于启动子下游的shRNA是为了在RNAi质粒进入宿主表达后,单链的RNA配对形成短的dsRNA,引发RNA干扰. 而且,该载体中含有可供筛选的潮霉素耐药基因和氨卞青霉素耐药基因,利于阳性重组子的克隆筛选. 因此,我们根据Genbank中报道的survivin基因核苷酸序列,参考shRNA设计原则设计出了三条阻断survivin基因表达的RNAi序列,并成功克隆至载体pSilencer3.1H1hygro,为进一步研究体内外抗肿瘤治疗提供新方法.

     【参考文献】

    [1] Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, et al. Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J].Nature, 2001, 411(6836): 494-498.

    [2] Caplen NJ, Parrish S, Imani F, et al. Specific inhibition of gene expression by small doublestranded RNAs in invertebrate systems[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(17):9742-9747.

    [3] Elbashir SM, Martinez J, Patkaniowska A, et al. Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate[J]. EMBO J, 2001, 20(23): 6877-6888.

    [4] Tuschl T, Zamore PD, Lehmann R,et al. Targeted mRNA degradation by doublestranded RNA in vitro[J]. Genes Dev, 1999, 13(24): 3191-3197.

    [5] Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel antiapoptosis gene, surviving, expressed in cancer and lymphoma[J]. Nat Med, 1997, 3(8): 917.

    [6] Adida C, Crotty PL, McGrath J, et al. Developmentally regulated expression of the novel cancer antiapoptosis gene surviving in human and mouse differentiation[J]. Am J Pathol, 1998, 152(1): 43.

    [7] Sui GH, Soohoo C, Shi Y, et al. A DNA vectorbased RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(8): 5515-5520.

    [8] Mello CC, Conte D Jr. Revealing the world of RNA interference[J]. Nature, 2004, 431(7006): 338-342.

    [9] Grishok A, Pasquinelli AE, Conte D, et al. Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small temporal RNAs that control C. elegans developmental timing [J]. Cell, 2001, 106(1):23-34.

    作者简介:石丛艳. 硕士生(导师郭德玉).Tel:(023)65398617Email:shizhe@fmmu.edu.cn

    (第三军医大学西南医院病理学研究所,重庆 400038)

    编辑许昌泰

    收稿日期:20051021, http://www.100md.com(石丛艳,郭德玉)