前列腺癌p21CIP1/WAF1 和PCNA的表达及相关性研究
关键词: 前列腺肿瘤;p21CIP1/WAF1 ;增殖细胞核抗原;免疫组织化学
摘 要:目的 研究p21CIP1/WAF1 及PCNA在人前列腺癌标本中的表达及相关性，阐述它们与前列腺癌病理分级及临床分期的关系. 方法 以36例确诊前列腺癌石蜡包埋存档标本作为研究对象，采用免疫组化SABC法对其p21CIP1/WAF1 及PCNA进行检测，并应用图像分析仪判定，统计学处理，对前列腺癌的病理分级及临床分期进行了对比分析及相关性研究. 结果 p21CIP1/WAF1 及PCNA的免疫组化阳性染色为棕黄色和/或棕褐色，定位于细胞质或细胞核.所得数据均经统计学处理.在不同病理分级及临床分期之间差异均有显著性，同时还发现PCNA与p21CIP1/WAF1 存在显著负相关性. 结论 p21CIP1/WAF1 表达与前列腺癌组织的病理分级及临床分期呈负相关性，在发病机制中可能涉及到p21CIP1/WAF1 和PCNA调节通路的异常.同时，作为一种检测方法，可用于判定前列腺癌恶性程度及进程的有价值的指标.
Expression and correlation of p21CIP1/WAF1 and PCNA in human prostate cancer
YANG Li-Jun SHAO Guo-Xing WANG He CHEN Bao-Qi QIN Rong-Liang LIU Rong-Fu
1 Department of Urology，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China，
2 Department of Urology，Tangdu Hospital，Fourth Military Medical University
Keywords:Prostatic neoplasms;p21
CIP1/WAF1 ;proliferating cell nuclear antigen;immunohistochemistry
Abstract:AIM To research the expression and correlation of p21CIP1/WAF1 and PCNA in human prostate cancer，for the purpose of illustrating their relations to the pathological grad-ing and clinical phases.METHODS Thirty six subjects were collected，which were the paraffin embedding samples that had been diagnosed as prostate cancer.p21CIP1/WAF1 and PCNA was tested by immunohistochemical SABC method.By using image pattern analyzer and through statistical methods，we did the comparative analysis and correlation research for the pathological grading and clinical phases of the prostate can┐cer.RESULTS The immunohistochemical positive staining of p21CIP1/WAF1 and PCNA was brown or dark brown，which were located in cytoplasm and nucleus.All data were treated through statistic analysis.As a result，the significant differ-ences were found in different pathological grading and clinical phases.Meanwhile，we also found there was negative corre-lation between PCNA and p21CIP1/WAF1 .CONCLUSION The above-mentioned research shows that p21CIP1/WAF1 is involved in the occurrence and development of prostate cancer.As for the pathological mechanism，it is related to the abnormal of p21CIP1/WAF1 and PCNA regulating path.Therefore，as a test-ing method，the research can be an index for estimating the level of malignant and progression of the prostate cancer，and expectedly，provide some references for diagnosis and treat-ments.
0 引言
随着前列腺癌在我国发病率的增高[1] ，对它的诊治已日益受到重视.PCNA是真核细胞DNA聚合酶δ的辅助蛋白，对DNA复制的调节起重要作用.p21CIP1/WAF1 是细胞周期中重要的调控因子，协调DNA的复制及修复，在细胞的生长分化和衰老中起重要的作用.我们采用免疫组织化学SABC法对前列腺癌标本PCNA及p21CIP1/WAF1 进行检测，旨在探讨它们在前列腺癌中的表达及其相互关系.
1 材料和方法
1.1 材料 1982/1999确诊前列腺癌石蜡包埋存档标本36例，年龄48～84岁，均为前列腺腺癌，病理分级采用Bǒcking(1982)的3级标准
[2] ，Ⅰ，Ⅱ及Ⅲ级各有13，9和14例.临床分期采用吴阶平主编的泌尿外科标准分为A，B，C，D4期.各有13，9，8和6例.全部标本均经40g·L-1 缓冲中性甲醛液固定，石蜡包埋，5μm连续切片2张，烤片后备染，1张行HE染色复诊，1张行免疫组化研究.鼠抗p21CIP1/WAF1 mAb(187)购自美国Santa Cruz Biotechnology，Inc，鼠抗PCNA(PC-10)mAb购自北京中山生物技术有限公司;工作浓度均为1∶100;SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程公司.羊抗鼠IgG及羊抗兔IgG为第四军医大学病理学教研室提供.
1.2 方法 采用免疫组织化学SABC法，各步骤按说明书进行，组织抗原修复采用Sanyo EM-715FW微波炉“慢速烹调、高火力档”15min，DAB显色，逐级脱水、透明、封片.用已知肝细胞肝癌阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作空白对照.实验数据均采用χ2 及方差检验处理.
2 结果
在日产OLYMPUS BH-2型显微镜下行双盲法阅片，p21CIP1/WAF1 蛋白主要定位于前列腺癌上皮细胞胞质中，呈现粗大的棕黄色颗粒状(Fig1).按染色强度分为 0级:染色阴性;1级:用×100倍放大可清晰辨认染色;2级:用×40倍放大可清晰辨认染色.又按染色数量分为 0级:细胞无染色;1级:染色细胞数少于1/3;2级:染色细胞数少于2/3;3级:染色细胞数多于2/3.将染色强度和染色数量的级数相加，大于4者为阳性染色[3] .按此方法将p21CIP1/WAF1 的前列腺癌组织切片分为阳性片和阴性片.PCNA为细胞核染成棕黄色或棕褐色者为阳性反应(Fig2)，采用MIAS--300型图像分析仪分析，普通光源照明，显微镜放大400倍，将图像输入高分辩图像监视器上，在每张切片中央及四周每隔45度扇面取视野，共9个.分析统计每个视野内PCNA阳性细胞数，将细胞数最多和最少的4个视野剔除，汇总出余下5个视野的阳性细胞均值，即为该例标本的PCNA阳性表达细胞数均值.表达情况详见Tab1.PCNA表达强度与病理分级及临床分期的Bartlett方差齐性检验P值分别为0.6993和0.1816.在PCNA与p21CIP1/WAF1 表达相互关系中P值分别为0.001，两两比较时的Bartlett方差齐性检验显示P=0.5678.
3 讨论
p21CIP1/WAF1 是一种潜在的、广谱的细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin Dependent Kinases，CDK)的抑 制因子[4，5] .定位于人6号染色体短臂的2带1区，它可对Cyclin-CDK复合物活性加以抑制，从而使细胞在Gl期处于停滞状态，DNA的复制及细胞的有丝分裂得以控制，受损的DNA得以修复或最终导致细胞的凋亡[6，7] .它的减少或缺失将引起相关的Cyclin和CDKs的过度表达，失去对肿瘤细胞增殖及分化的抑制作用，导致肿瘤的发生.有文献报道p21CIP1/WAF1 的缺失在前列腺癌的发生中起重要作用[8] .PCNA是反应细胞增殖的一种很好的标志物，是DNA多聚酶δ的一种辅酶，在细胞进入增殖周期时就开始出现，S期达到高峰，在G2期和M期下降，恶性肿瘤的特点就是分化受阻而增殖无限，因此，PCNA是研究肿瘤细胞动力学及评估某些肿瘤预后的较好指标[9] .在S期前发生的DNA损伤，p21CIP1/WAF1 可通过对Cyclin-CDK复合物活性的抑制，使Rb处于未磷酸化状态而使细胞停滞在G1期，直至受损的DNA得以修复，确保DNA下一轮复制时遗传物质的精确性[10，11] .在S期时发生的DNA损伤，p21CIP1/WAF1 则可通过PCNA直接抑制受损DNA的复制[12] .
图1 - 图2 略
表1 p21CIP1/WAF1 和PCNA在前列腺癌病理分级、临床分期中表达的关系 略
我们在前列腺癌组织切片上观测p21CIP1/WAF1 ，PCNA的表达及其相互关系，结果发现p21CIP1/WAF1 表达阳性率为52.8%(19/36).不同病理分级阳性表达不同，Ⅰ级阳性表达明显高于Ⅲ级，存在显著性差异(P=0.0416)，表明p21CIP1/WAF1 基因可能与前列腺癌细胞的分化过程有关，它在前列腺癌的细胞生长中起负性调控作用，它的缺失可能意味着肿瘤的迅速生长.同时p21CIP1/WAF1 蛋白的缺失可能是前列腺癌的晚期表现，它与前列腺癌的临床分期也有显著相关性，随分期的升高，阳性表达降低，A-B期的阳性表达率明显高于C-D期，存在显著性差异(P=0.0023).有学者在胃癌及肝细胞癌中得出了类似的结论[13，14] .我们使用的PC10是一种能与常规甲醛固定石蜡包埋组织起反应的PCNA mAb[15] .肿瘤分化程度越差，恶性程度就越高，本组研究与其相符，分化差的肿瘤细胞PCNA表达增多(P=0.0001)，低分化PCNA表达强度明显高于高分化，呈正相关性，这反映出肿瘤的分化程度与增殖活性的一般规律.还发现PCNA表达强度与前列腺癌的临床分期亦呈正相关性(P=0.0000)，可见PCNA与前列腺癌的病程有关，这与国外学者研究所得结论类似[16，17] .在正常前列腺组织中，PCNA表达弱而规律，而在前列腺癌细胞中表达明显增多，并呈不同程度的异质性分布，这表明癌细胞生长调节失控，DNA合成紊乱，也提示肿瘤增殖细胞群中并非所有细胞均同步增殖.在p21CIP1/WAF1 与PCNA的相互关系中，我们发现它们 之间呈现负相关性(P=0.001)，p21CIP1/WAF1 阳性表达标本的PCNA计数低于阴性表达标本，这一结果支持p21CIP1/WAF1 与PCNA在调节细胞周期活动中存在着相互作用.PCNA是正常细胞DNA复制所必须的，p21CIP1/WAF1 则是通过干扰DNA复制中PCNA功能来发挥作用的，在p21CIP1/WAF1 缺乏时，PCNA剌激纯化的聚合酶δ指导的DNA合成达10倍以上，而p21CIP1/WAF1 能明显抑制PCNA的作用[18] .p21CIP1/WAF1 阳性表达病例中DNA的复制受到抑制而致PCNA表达强度较阴性病例为弱.
综合本实验的观察可以推论，p21CIP1/WAF1 缺失及异常将使前列腺细胞趋向于恶性变，在恶性程度高和侵袭力强的肿瘤细胞中表现的更加明显，随即而来的是PCNA的高表达.肿瘤的生长调控很复杂，与癌基因、生长因子等的内在相互关系有关，有研究表明p16/MTS1，p21CIP1/WAF1 和p53等基因调节通路的异常导致前列腺癌的发生[19，20] ，p21CIP1/WAF1 基因和PC-NA调节通路的异常亦可能为前列腺癌发病的分子机制之一.
参考文献:
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作者简介: 杨力军(1969-)，男(汉族)，河北省雄县人.博士生(导师邵国兴).Tel.(029)3373668 Email.Lijuny25@263.net
1 第四军医大学西京医院泌尿外科，陕西西安710033，
2 第四军医大学唐都医院泌尿外科
编辑 袁天峰, 百拇医药(杨力军 邵国兴 王禾 陈宝琦 秦荣良 刘荣福)
摘 要:目的 研究p21CIP1/WAF1 及PCNA在人前列腺癌标本中的表达及相关性，阐述它们与前列腺癌病理分级及临床分期的关系. 方法 以36例确诊前列腺癌石蜡包埋存档标本作为研究对象，采用免疫组化SABC法对其p21CIP1/WAF1 及PCNA进行检测，并应用图像分析仪判定，统计学处理，对前列腺癌的病理分级及临床分期进行了对比分析及相关性研究. 结果 p21CIP1/WAF1 及PCNA的免疫组化阳性染色为棕黄色和/或棕褐色，定位于细胞质或细胞核.所得数据均经统计学处理.在不同病理分级及临床分期之间差异均有显著性，同时还发现PCNA与p21CIP1/WAF1 存在显著负相关性. 结论 p21CIP1/WAF1 表达与前列腺癌组织的病理分级及临床分期呈负相关性，在发病机制中可能涉及到p21CIP1/WAF1 和PCNA调节通路的异常.同时，作为一种检测方法，可用于判定前列腺癌恶性程度及进程的有价值的指标.
Expression and correlation of p21CIP1/WAF1 and PCNA in human prostate cancer
YANG Li-Jun SHAO Guo-Xing WANG He CHEN Bao-Qi QIN Rong-Liang LIU Rong-Fu
1 Department of Urology，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China，
2 Department of Urology，Tangdu Hospital，Fourth Military Medical University
Keywords:Prostatic neoplasms;p21
CIP1/WAF1 ;proliferating cell nuclear antigen;immunohistochemistry
Abstract:AIM To research the expression and correlation of p21CIP1/WAF1 and PCNA in human prostate cancer，for the purpose of illustrating their relations to the pathological grad-ing and clinical phases.METHODS Thirty six subjects were collected，which were the paraffin embedding samples that had been diagnosed as prostate cancer.p21CIP1/WAF1 and PCNA was tested by immunohistochemical SABC method.By using image pattern analyzer and through statistical methods，we did the comparative analysis and correlation research for the pathological grading and clinical phases of the prostate can┐cer.RESULTS The immunohistochemical positive staining of p21CIP1/WAF1 and PCNA was brown or dark brown，which were located in cytoplasm and nucleus.All data were treated through statistic analysis.As a result，the significant differ-ences were found in different pathological grading and clinical phases.Meanwhile，we also found there was negative corre-lation between PCNA and p21CIP1/WAF1 .CONCLUSION The above-mentioned research shows that p21CIP1/WAF1 is involved in the occurrence and development of prostate cancer.As for the pathological mechanism，it is related to the abnormal of p21CIP1/WAF1 and PCNA regulating path.Therefore，as a test-ing method，the research can be an index for estimating the level of malignant and progression of the prostate cancer，and expectedly，provide some references for diagnosis and treat-ments.
0 引言
随着前列腺癌在我国发病率的增高[1] ，对它的诊治已日益受到重视.PCNA是真核细胞DNA聚合酶δ的辅助蛋白，对DNA复制的调节起重要作用.p21CIP1/WAF1 是细胞周期中重要的调控因子，协调DNA的复制及修复，在细胞的生长分化和衰老中起重要的作用.我们采用免疫组织化学SABC法对前列腺癌标本PCNA及p21CIP1/WAF1 进行检测，旨在探讨它们在前列腺癌中的表达及其相互关系.
1 材料和方法
1.1 材料 1982/1999确诊前列腺癌石蜡包埋存档标本36例，年龄48～84岁，均为前列腺腺癌，病理分级采用Bǒcking(1982)的3级标准
[2] ，Ⅰ，Ⅱ及Ⅲ级各有13，9和14例.临床分期采用吴阶平主编的泌尿外科标准分为A，B，C，D4期.各有13，9，8和6例.全部标本均经40g·L-1 缓冲中性甲醛液固定，石蜡包埋，5μm连续切片2张，烤片后备染，1张行HE染色复诊，1张行免疫组化研究.鼠抗p21CIP1/WAF1 mAb(187)购自美国Santa Cruz Biotechnology，Inc，鼠抗PCNA(PC-10)mAb购自北京中山生物技术有限公司;工作浓度均为1∶100;SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程公司.羊抗鼠IgG及羊抗兔IgG为第四军医大学病理学教研室提供.
1.2 方法 采用免疫组织化学SABC法，各步骤按说明书进行，组织抗原修复采用Sanyo EM-715FW微波炉“慢速烹调、高火力档”15min，DAB显色，逐级脱水、透明、封片.用已知肝细胞肝癌阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作空白对照.实验数据均采用χ2 及方差检验处理.
2 结果
在日产OLYMPUS BH-2型显微镜下行双盲法阅片，p21CIP1/WAF1 蛋白主要定位于前列腺癌上皮细胞胞质中，呈现粗大的棕黄色颗粒状(Fig1).按染色强度分为 0级:染色阴性;1级:用×100倍放大可清晰辨认染色;2级:用×40倍放大可清晰辨认染色.又按染色数量分为 0级:细胞无染色;1级:染色细胞数少于1/3;2级:染色细胞数少于2/3;3级:染色细胞数多于2/3.将染色强度和染色数量的级数相加，大于4者为阳性染色[3] .按此方法将p21CIP1/WAF1 的前列腺癌组织切片分为阳性片和阴性片.PCNA为细胞核染成棕黄色或棕褐色者为阳性反应(Fig2)，采用MIAS--300型图像分析仪分析，普通光源照明，显微镜放大400倍，将图像输入高分辩图像监视器上，在每张切片中央及四周每隔45度扇面取视野，共9个.分析统计每个视野内PCNA阳性细胞数，将细胞数最多和最少的4个视野剔除，汇总出余下5个视野的阳性细胞均值，即为该例标本的PCNA阳性表达细胞数均值.表达情况详见Tab1.PCNA表达强度与病理分级及临床分期的Bartlett方差齐性检验P值分别为0.6993和0.1816.在PCNA与p21CIP1/WAF1 表达相互关系中P值分别为0.001，两两比较时的Bartlett方差齐性检验显示P=0.5678.
3 讨论
p21CIP1/WAF1 是一种潜在的、广谱的细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin Dependent Kinases，CDK)的抑 制因子[4，5] .定位于人6号染色体短臂的2带1区，它可对Cyclin-CDK复合物活性加以抑制，从而使细胞在Gl期处于停滞状态，DNA的复制及细胞的有丝分裂得以控制，受损的DNA得以修复或最终导致细胞的凋亡[6，7] .它的减少或缺失将引起相关的Cyclin和CDKs的过度表达，失去对肿瘤细胞增殖及分化的抑制作用，导致肿瘤的发生.有文献报道p21CIP1/WAF1 的缺失在前列腺癌的发生中起重要作用[8] .PCNA是反应细胞增殖的一种很好的标志物，是DNA多聚酶δ的一种辅酶，在细胞进入增殖周期时就开始出现，S期达到高峰，在G2期和M期下降，恶性肿瘤的特点就是分化受阻而增殖无限，因此，PCNA是研究肿瘤细胞动力学及评估某些肿瘤预后的较好指标[9] .在S期前发生的DNA损伤，p21CIP1/WAF1 可通过对Cyclin-CDK复合物活性的抑制，使Rb处于未磷酸化状态而使细胞停滞在G1期，直至受损的DNA得以修复，确保DNA下一轮复制时遗传物质的精确性[10，11] .在S期时发生的DNA损伤，p21CIP1/WAF1 则可通过PCNA直接抑制受损DNA的复制[12] .
图1 - 图2 略
表1 p21CIP1/WAF1 和PCNA在前列腺癌病理分级、临床分期中表达的关系 略
我们在前列腺癌组织切片上观测p21CIP1/WAF1 ，PCNA的表达及其相互关系，结果发现p21CIP1/WAF1 表达阳性率为52.8%(19/36).不同病理分级阳性表达不同，Ⅰ级阳性表达明显高于Ⅲ级，存在显著性差异(P=0.0416)，表明p21CIP1/WAF1 基因可能与前列腺癌细胞的分化过程有关，它在前列腺癌的细胞生长中起负性调控作用，它的缺失可能意味着肿瘤的迅速生长.同时p21CIP1/WAF1 蛋白的缺失可能是前列腺癌的晚期表现，它与前列腺癌的临床分期也有显著相关性，随分期的升高，阳性表达降低，A-B期的阳性表达率明显高于C-D期，存在显著性差异(P=0.0023).有学者在胃癌及肝细胞癌中得出了类似的结论[13，14] .我们使用的PC10是一种能与常规甲醛固定石蜡包埋组织起反应的PCNA mAb[15] .肿瘤分化程度越差，恶性程度就越高，本组研究与其相符，分化差的肿瘤细胞PCNA表达增多(P=0.0001)，低分化PCNA表达强度明显高于高分化，呈正相关性，这反映出肿瘤的分化程度与增殖活性的一般规律.还发现PCNA表达强度与前列腺癌的临床分期亦呈正相关性(P=0.0000)，可见PCNA与前列腺癌的病程有关，这与国外学者研究所得结论类似[16，17] .在正常前列腺组织中，PCNA表达弱而规律，而在前列腺癌细胞中表达明显增多，并呈不同程度的异质性分布，这表明癌细胞生长调节失控，DNA合成紊乱，也提示肿瘤增殖细胞群中并非所有细胞均同步增殖.在p21CIP1/WAF1 与PCNA的相互关系中，我们发现它们 之间呈现负相关性(P=0.001)，p21CIP1/WAF1 阳性表达标本的PCNA计数低于阴性表达标本，这一结果支持p21CIP1/WAF1 与PCNA在调节细胞周期活动中存在着相互作用.PCNA是正常细胞DNA复制所必须的，p21CIP1/WAF1 则是通过干扰DNA复制中PCNA功能来发挥作用的，在p21CIP1/WAF1 缺乏时，PCNA剌激纯化的聚合酶δ指导的DNA合成达10倍以上，而p21CIP1/WAF1 能明显抑制PCNA的作用[18] .p21CIP1/WAF1 阳性表达病例中DNA的复制受到抑制而致PCNA表达强度较阴性病例为弱.
综合本实验的观察可以推论，p21CIP1/WAF1 缺失及异常将使前列腺细胞趋向于恶性变，在恶性程度高和侵袭力强的肿瘤细胞中表现的更加明显，随即而来的是PCNA的高表达.肿瘤的生长调控很复杂，与癌基因、生长因子等的内在相互关系有关，有研究表明p16/MTS1，p21CIP1/WAF1 和p53等基因调节通路的异常导致前列腺癌的发生[19，20] ，p21CIP1/WAF1 基因和PC-NA调节通路的异常亦可能为前列腺癌发病的分子机制之一.
参考文献:
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作者简介: 杨力军(1969-)，男(汉族)，河北省雄县人.博士生(导师邵国兴).Tel.(029)3373668 Email.Lijuny25@263.net
1 第四军医大学西京医院泌尿外科，陕西西安710033，
2 第四军医大学唐都医院泌尿外科
编辑 袁天峰, 百拇医药(杨力军 邵国兴 王禾 陈宝琦 秦荣良 刘荣福)