神经生长因子对脊髓减压病神经损伤的修复作用研究
[摘要] 目的: 研究神经生长因子对脊髓减压病神经损伤的修复作用。 方法: SD大鼠随机分为正常对照组、安全减压组、生理盐水(NS)组、神经生长因子(NGF)治疗组、高压氧(HBO)暴露组、NGF与HBO联用组，建立大鼠脊髓减压病模型，采用酶联免疫实验(ELISA)定量检测比较各组大鼠出舱6、24、48、72h肿瘤坏死因子(TNF-α)的蛋白表达。 结果: NGF治疗组TNF-α浓度在6、24、48、72h均明显低于生理盐水组(P<0.05)，HBO治疗组TNF-α浓度在24、48、72h也明显低于生理盐水组(P<0.05)。NGF与HBO联用组TNF-α的浓度在24、48、72h均显著低于单纯NGF治疗组和HBO暴露组(P<0.05)。 结论: 神经生长因子和高压氧治疗可以抑制脊髓减压病大鼠TNF-α的蛋白表达，NGF与HBO联合治疗的效果明显优于单纯NGF治疗或HBO暴露。
[关键词] 脊髓减压病;神经生长因子;高压氧;肿瘤坏死因子
Protective effect of nerve growth factor on neuron injury in rat spinal cord decompression sickness
YIN Ming，ZHAO Min，ZHANG Jian-cheng，et al
(Naval Medical Research Institute，Shanghai 200433，China)
Abstract:Objective:To study the protective effect of nerve growth factor(NGF)on neuron injury in rat spinal cord decom-pression sickness.Methods:Rats were randomly divided into6groups:the control group;the safe decompression group;the normal saline(NS)group;the NGF group;the HBO group;and the NGF plus HBO therapeutic group.Then，an animal model of spinal cord decompression sickness was developed，and the expression of TNF-α(tumor necrosis factor-α)in each animal group was mea-sured by ELISA at surface time，6，24，48and72h respectively.Results:TNF-αof the NGF group is obviously lower than that of the NS group at6，24，48and72h(P<0.05).The same is true for the HBO Group at24，48and72h(P<0.05).TNF-αin the NGF plus HBO therapeutic group is also significantly lower than those of the NGF group or the HBO group at24，48and72h(P<0.05).Conclusion:Both NGF and HBO can inhibit the expression of TNF-αin rats with spinal cord decompression sickness(P<0.05).NGF treatment plus HBO therapy can produce better effect than that of simple NGF treatment or HBO exposure(P<0.05).
Key words:spinal cord decompression sickness;nerve growth factor(NGF);HBO;tumor necrosis
脊髓减压病是潜水医学研究领域的热点，在气压性损伤中，脊髓减压病一直是救治的难题，尤其是在没有及时救治条件的情况下，往往是致命的 [1] 。
许多研究发现，NGF对机械性脊髓损伤有一定的保护作用，而且对于其他神经系统疾病的临床试验研究也证明了它的有效性，但未见有应用NGF治疗脊髓减压病神经损伤的文献报道。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
健康雄性SD大鼠，体重200～250g，由第二军医大学实验动物中心提供。随机分组:①正常对照组4只;②安全减压组4只;③生理盐水(NS)组16只;④神经生长因子(NGF)治疗组16只;⑤高压氧(HBO)暴露组16只;⑥NGF与HBO联用组16只。
1.2 动物模型制作
将③～⑥组大鼠进行高气压暴露，经30s空气加压至1MPa，停留5.5min，50s减至常压出舱，于出舱后6、24、48、72h各取4只动物取材。安全减压组大鼠采用动物安全减压方案减到常压。
1.3 NGF治疗
取大鼠背部正中切口，在4、5腰椎间隙通过蛛网膜下腔给予NS或NGF(0.28g/l)，于出舱即刻、10、30、60、120min各注入20μl，NGF为海军医学研究所新药中心提取纯化，以Sig-ma公司标准品标定浓度。
1.4 HBO暴露
大鼠出舱后5h，置于垫有新鲜钠石灰的动物加压舱内，用纯氧(浓度>99.2%)洗舱10min，使舱内氧浓度>98.0%，以0.1MPa/min的速度加压至0.25MPa，高压下停留60min，期间每15min用纯氧通风10min，使舱内氧浓度维持在96.3%以上，停留结束后用10min匀速减压出舱。
1.5 脊髓匀浆上清制备和酶联免疫吸附实验(ELISA) 0.3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，取脊髓胸腰段，称重，加入0.1mol/L PBS缓冲液1ml，匀浆，离心15min(2000r/min)，取上清液于-20℃保存。标本备齐后，按照TNF-αELISA试剂盒(购自Biosource公司)标示的实验步骤操作。
1.6 统计学处理
实验数据用均数±标准差表示，组间差异采用方差分析进行比较，应用SPSS12.0统计软件进行数据分析。
2 结 果
ELISA检测结果:对照组和安全减压组大鼠脊髓组织TNF-α的浓度分别为(18.2±22.2)pg/g、(14.4±24.3)pg/g。NS组、NGF治疗组、HBO暴露组、NGF与HBO联用组大鼠快速减压后6h，TNF-α的浓度均高于对照组和安全减压组，24h TNF-α浓度较6h明显增加，48h达到高峰，72h浓度有所下降，但仍高于正常水平。NGF治疗组TNF-α浓度在6、24、48、72h均明显低于NS组(P<0.05)，HBO暴露组TNF-α浓度在24、48、72h也明显低于NS组(P<0.05)，但NGF治疗组和HBO暴露组之间的浓度没有显著性差异(P>0.05)。NGF与HBO联用组TNF-α的浓度在24、48、72h均显著低于单纯NGF治疗组或HBO暴露组(P<0.05)，联合应用NGF和HBO存在协同作用(见表1)。表1 在不同出舱时间用ELISA实验定量检测到的各组大鼠脊髓组织TNF-α的浓度(略)
3 讨 论
神经生长因子是神经系统最重要的生物活性分子之一，也是促进神经系统损伤修复的重要因素，它与某些难以治愈的神经系统疾患密切相关 [2] ，如早老性痴呆(AD)、亨廷顿舞蹈病(HD)、帕金森氏病(PS)等;而TNF作为一种炎性介质，对神经元具有毒性作用，它可以刺激自由基形成并诱导细胞凋亡。本实验结果显示，应用外源性NGF，可以抑制脊髓减压病大鼠TNF-α的表达，TNF-α的蛋白表达是神经细胞凋亡的一条通路，而调控TNF-α的表达可以减轻对神经细胞的毒性作用和血脑屏障的破坏，抑制TNF-α相关蛋白所触发的细胞凋亡信号的激活和转导，不仅可以减轻继发性脊髓损害，调控免疫和炎症反应，而且对于促进损伤脊髓的功能修复也将产生积极作用 [3] ，NGF和TNF-α分别是脊髓减压病发生后重要的保护因素和损害因素。NGF为神经再生提供了良好的微环境，加强损伤激活的再生修复反应。但目前认为NGF不是直接作用于神经细胞，而是经过膜受体形成复合物后经逆行运输发挥作用，然后经第二信使启动一系列级联反应，对靶细胞的基因表达进行调控从而发挥生物学效应 [4，5] 。
对于脊髓型减压病，常规的疗法是及早合理的再加压，及时再加压可以将体内气泡消除，属于病因治疗，但目前由于地域条件和医疗保障条件限制，尤其是边远地区，大多还不具备加压治疗的条件，病员转送体系也不健全，往往从发病到治疗间隔时间较长，一般在5h以上。延误一段时间后加压治疗即便能使患者体内气泡消除，但损伤组织的修复，尤其是神经组织的修复仍需一个过程。实验结果发现，延迟性高压氧治疗仍然可以抑制TNF-α的蛋白表达，对于脊髓损伤的修复有一定作用，因此，即使患者已经延误一定的时间，也要不失时机进行治疗以争取救治机会。高压氧不仅能提高机体组织的血氧含量，扩大氧在组织中的弥散半径，而且具有加强机体的应激反应，对脊髓缺血、水肿的纠正有一定效果。WORKMAN研究发现，高压氧可以加强对氧自由基的清除而起到抗氧化作用，减轻减压后组织损伤的程度 [6] 。采取NGF与HBO联合应用的方法效果明显优于单纯NGF治疗或HBO暴露。NGF的修复作用主要是减轻继发损伤，HBO则可以直接消除引起神经损伤的因素———气泡，从而减轻一系列继发损伤，抑制神经细胞凋亡，同时HBO也可以改善缺血缺氧状态以减轻继发损伤。从发病机制和修复作用看，联合应用NGF和HBO存在协同作用。因此，发生脊髓减压病后应尽可能采取多种有效措施进行综合治疗，以获得最佳的康复效果。
如何提高中枢神经保护治疗效果和扩大有效治疗时间窗是目前面临的2个主要问题 [7] 。重要原因之一是血脑屏障的阻碍作用，NGF不易通过血脑屏障，而脑脊液作为神经细胞外液，是一条潜在的、可突破血脑屏障的给药途径，本实验即通过蛛网膜下腔给药的方式使NGF直接进入脑脊液以保证较高的利用效率;另一重要原因是神经细胞对缺血缺氧极其敏感，超过6h就可能发生不可逆损害，应用神经保护剂是扩大有效治疗时间窗的方法之一。目前 通过蛛网膜下腔给药的方式直接导入脑脊液是神经保护剂的最佳给药途径，经脑脊液注射给药可以明显提高神经保护剂的治疗效果;再加压与高压氧治疗是治疗脊髓减压病的主要方法，但是有些情况下往往没有立即加压救治的条件，NGF则可以在一定程度上扩大再加压与高压氧有效治疗时间窗。近年来提出的“神经元凋亡治疗机会窗”的概念为在有效时间内综合治疗中枢神经损伤提供了新的思路。脊髓减压病导致大量神经细胞凋亡，细胞凋亡存在加以调控的可能性，抑制脊髓损伤后细胞凋亡有助于保护更多的神经细胞免遭死亡，调控TNF-α蛋白表达，在细胞凋亡高峰期之前有效控制细胞凋亡，是治疗脊髓减压病的新思路，配合高压氧联合治疗，可能会收到更好的效果。
[参考文献]
[1] AHARON-PERETZ J，ADIR Y.Spinal cord decompression sickness in sport diving[J].Arch Neurol，1993，50(7):753-756.
[2] NAGATSU T，MOGI M，ICHINOSE H，et al.Cytokines in Parkinson's disease[J].J Neural Transm Suppl，2000，(58):143-151.
[3] LEE R，KERMANI P，TENG K K，et al.Regulation of cell survival by secreted proneurotrophins[J].Science，2001，294 (5548):1945-1948.
[4] CHADA S R，HOLLENBECK P J.Nerve growth factor signal-ing regulates motility and docking of axonal mitochondria[J].Curr Biol，2004，14(14):1272-1276.
[5] BRUNCLLO N，RCYNOLDS M，WRATHALL J R，et al.In-creased nerve growth factor mRNA in contused rat spinal cord [J].Neurosci Lett，1990，118(2):238-240.
[6] VAN L U.Clinical aspects，pathophysiology and therapy of de-compression sickness[J].Ther Umsch，1993，50(4):252-257.
[7] TANG X Q，CAI J，NELSON K D，et al.Functional repair af-ter dorsal root rhizotomy using nerve conduits and neurotrophic molecules[J].Eur J Neurosci，2004，20(5):1211-1218.
[基金项目] 总后卫生部面上项目(98M050)
(海军医学研究所，上海 200433)
(本文编辑:王映红), 百拇医药(殷明，赵敏，章建程，陈锐勇，方以群，王文波)
[关键词] 脊髓减压病;神经生长因子;高压氧;肿瘤坏死因子
Protective effect of nerve growth factor on neuron injury in rat spinal cord decompression sickness
YIN Ming，ZHAO Min，ZHANG Jian-cheng，et al
(Naval Medical Research Institute，Shanghai 200433，China)
Abstract:Objective:To study the protective effect of nerve growth factor(NGF)on neuron injury in rat spinal cord decom-pression sickness.Methods:Rats were randomly divided into6groups:the control group;the safe decompression group;the normal saline(NS)group;the NGF group;the HBO group;and the NGF plus HBO therapeutic group.Then，an animal model of spinal cord decompression sickness was developed，and the expression of TNF-α(tumor necrosis factor-α)in each animal group was mea-sured by ELISA at surface time，6，24，48and72h respectively.Results:TNF-αof the NGF group is obviously lower than that of the NS group at6，24，48and72h(P<0.05).The same is true for the HBO Group at24，48and72h(P<0.05).TNF-αin the NGF plus HBO therapeutic group is also significantly lower than those of the NGF group or the HBO group at24，48and72h(P<0.05).Conclusion:Both NGF and HBO can inhibit the expression of TNF-αin rats with spinal cord decompression sickness(P<0.05).NGF treatment plus HBO therapy can produce better effect than that of simple NGF treatment or HBO exposure(P<0.05).
Key words:spinal cord decompression sickness;nerve growth factor(NGF);HBO;tumor necrosis
脊髓减压病是潜水医学研究领域的热点，在气压性损伤中，脊髓减压病一直是救治的难题，尤其是在没有及时救治条件的情况下，往往是致命的 [1] 。
许多研究发现，NGF对机械性脊髓损伤有一定的保护作用，而且对于其他神经系统疾病的临床试验研究也证明了它的有效性，但未见有应用NGF治疗脊髓减压病神经损伤的文献报道。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
健康雄性SD大鼠，体重200～250g，由第二军医大学实验动物中心提供。随机分组:①正常对照组4只;②安全减压组4只;③生理盐水(NS)组16只;④神经生长因子(NGF)治疗组16只;⑤高压氧(HBO)暴露组16只;⑥NGF与HBO联用组16只。
1.2 动物模型制作
将③～⑥组大鼠进行高气压暴露，经30s空气加压至1MPa，停留5.5min，50s减至常压出舱，于出舱后6、24、48、72h各取4只动物取材。安全减压组大鼠采用动物安全减压方案减到常压。
1.3 NGF治疗
取大鼠背部正中切口，在4、5腰椎间隙通过蛛网膜下腔给予NS或NGF(0.28g/l)，于出舱即刻、10、30、60、120min各注入20μl，NGF为海军医学研究所新药中心提取纯化，以Sig-ma公司标准品标定浓度。
1.4 HBO暴露
大鼠出舱后5h，置于垫有新鲜钠石灰的动物加压舱内，用纯氧(浓度>99.2%)洗舱10min，使舱内氧浓度>98.0%，以0.1MPa/min的速度加压至0.25MPa，高压下停留60min，期间每15min用纯氧通风10min，使舱内氧浓度维持在96.3%以上，停留结束后用10min匀速减压出舱。
1.5 脊髓匀浆上清制备和酶联免疫吸附实验(ELISA) 0.3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，取脊髓胸腰段，称重，加入0.1mol/L PBS缓冲液1ml，匀浆，离心15min(2000r/min)，取上清液于-20℃保存。标本备齐后，按照TNF-αELISA试剂盒(购自Biosource公司)标示的实验步骤操作。
1.6 统计学处理
实验数据用均数±标准差表示，组间差异采用方差分析进行比较，应用SPSS12.0统计软件进行数据分析。
2 结 果
ELISA检测结果:对照组和安全减压组大鼠脊髓组织TNF-α的浓度分别为(18.2±22.2)pg/g、(14.4±24.3)pg/g。NS组、NGF治疗组、HBO暴露组、NGF与HBO联用组大鼠快速减压后6h，TNF-α的浓度均高于对照组和安全减压组，24h TNF-α浓度较6h明显增加，48h达到高峰，72h浓度有所下降，但仍高于正常水平。NGF治疗组TNF-α浓度在6、24、48、72h均明显低于NS组(P<0.05)，HBO暴露组TNF-α浓度在24、48、72h也明显低于NS组(P<0.05)，但NGF治疗组和HBO暴露组之间的浓度没有显著性差异(P>0.05)。NGF与HBO联用组TNF-α的浓度在24、48、72h均显著低于单纯NGF治疗组或HBO暴露组(P<0.05)，联合应用NGF和HBO存在协同作用(见表1)。表1 在不同出舱时间用ELISA实验定量检测到的各组大鼠脊髓组织TNF-α的浓度(略)
3 讨 论
神经生长因子是神经系统最重要的生物活性分子之一，也是促进神经系统损伤修复的重要因素，它与某些难以治愈的神经系统疾患密切相关 [2] ，如早老性痴呆(AD)、亨廷顿舞蹈病(HD)、帕金森氏病(PS)等;而TNF作为一种炎性介质，对神经元具有毒性作用，它可以刺激自由基形成并诱导细胞凋亡。本实验结果显示，应用外源性NGF，可以抑制脊髓减压病大鼠TNF-α的表达，TNF-α的蛋白表达是神经细胞凋亡的一条通路，而调控TNF-α的表达可以减轻对神经细胞的毒性作用和血脑屏障的破坏，抑制TNF-α相关蛋白所触发的细胞凋亡信号的激活和转导，不仅可以减轻继发性脊髓损害，调控免疫和炎症反应，而且对于促进损伤脊髓的功能修复也将产生积极作用 [3] ，NGF和TNF-α分别是脊髓减压病发生后重要的保护因素和损害因素。NGF为神经再生提供了良好的微环境，加强损伤激活的再生修复反应。但目前认为NGF不是直接作用于神经细胞，而是经过膜受体形成复合物后经逆行运输发挥作用，然后经第二信使启动一系列级联反应，对靶细胞的基因表达进行调控从而发挥生物学效应 [4，5] 。
对于脊髓型减压病，常规的疗法是及早合理的再加压，及时再加压可以将体内气泡消除，属于病因治疗，但目前由于地域条件和医疗保障条件限制，尤其是边远地区，大多还不具备加压治疗的条件，病员转送体系也不健全，往往从发病到治疗间隔时间较长，一般在5h以上。延误一段时间后加压治疗即便能使患者体内气泡消除，但损伤组织的修复，尤其是神经组织的修复仍需一个过程。实验结果发现，延迟性高压氧治疗仍然可以抑制TNF-α的蛋白表达，对于脊髓损伤的修复有一定作用，因此，即使患者已经延误一定的时间，也要不失时机进行治疗以争取救治机会。高压氧不仅能提高机体组织的血氧含量，扩大氧在组织中的弥散半径，而且具有加强机体的应激反应，对脊髓缺血、水肿的纠正有一定效果。WORKMAN研究发现，高压氧可以加强对氧自由基的清除而起到抗氧化作用，减轻减压后组织损伤的程度 [6] 。采取NGF与HBO联合应用的方法效果明显优于单纯NGF治疗或HBO暴露。NGF的修复作用主要是减轻继发损伤，HBO则可以直接消除引起神经损伤的因素———气泡，从而减轻一系列继发损伤，抑制神经细胞凋亡，同时HBO也可以改善缺血缺氧状态以减轻继发损伤。从发病机制和修复作用看，联合应用NGF和HBO存在协同作用。因此，发生脊髓减压病后应尽可能采取多种有效措施进行综合治疗，以获得最佳的康复效果。
如何提高中枢神经保护治疗效果和扩大有效治疗时间窗是目前面临的2个主要问题 [7] 。重要原因之一是血脑屏障的阻碍作用，NGF不易通过血脑屏障，而脑脊液作为神经细胞外液，是一条潜在的、可突破血脑屏障的给药途径，本实验即通过蛛网膜下腔给药的方式使NGF直接进入脑脊液以保证较高的利用效率;另一重要原因是神经细胞对缺血缺氧极其敏感，超过6h就可能发生不可逆损害，应用神经保护剂是扩大有效治疗时间窗的方法之一。目前 通过蛛网膜下腔给药的方式直接导入脑脊液是神经保护剂的最佳给药途径，经脑脊液注射给药可以明显提高神经保护剂的治疗效果;再加压与高压氧治疗是治疗脊髓减压病的主要方法，但是有些情况下往往没有立即加压救治的条件，NGF则可以在一定程度上扩大再加压与高压氧有效治疗时间窗。近年来提出的“神经元凋亡治疗机会窗”的概念为在有效时间内综合治疗中枢神经损伤提供了新的思路。脊髓减压病导致大量神经细胞凋亡，细胞凋亡存在加以调控的可能性，抑制脊髓损伤后细胞凋亡有助于保护更多的神经细胞免遭死亡，调控TNF-α蛋白表达，在细胞凋亡高峰期之前有效控制细胞凋亡，是治疗脊髓减压病的新思路，配合高压氧联合治疗，可能会收到更好的效果。
[参考文献]
[1] AHARON-PERETZ J，ADIR Y.Spinal cord decompression sickness in sport diving[J].Arch Neurol，1993，50(7):753-756.
[2] NAGATSU T，MOGI M，ICHINOSE H，et al.Cytokines in Parkinson's disease[J].J Neural Transm Suppl，2000，(58):143-151.
[3] LEE R，KERMANI P，TENG K K，et al.Regulation of cell survival by secreted proneurotrophins[J].Science，2001，294 (5548):1945-1948.
[4] CHADA S R，HOLLENBECK P J.Nerve growth factor signal-ing regulates motility and docking of axonal mitochondria[J].Curr Biol，2004，14(14):1272-1276.
[5] BRUNCLLO N，RCYNOLDS M，WRATHALL J R，et al.In-creased nerve growth factor mRNA in contused rat spinal cord [J].Neurosci Lett，1990，118(2):238-240.
[6] VAN L U.Clinical aspects，pathophysiology and therapy of de-compression sickness[J].Ther Umsch，1993，50(4):252-257.
[7] TANG X Q，CAI J，NELSON K D，et al.Functional repair af-ter dorsal root rhizotomy using nerve conduits and neurotrophic molecules[J].Eur J Neurosci，2004，20(5):1211-1218.
[基金项目] 总后卫生部面上项目(98M050)
(海军医学研究所，上海 200433)
(本文编辑:王映红), 百拇医药(殷明，赵敏，章建程，陈锐勇，方以群，王文波)