胶质细胞系源性神经营养因子保护帕金森模型大鼠黑质多巴胺能神经元机制的研究
摘要 :目的 探讨胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)在保护黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元过程中，钙结合蛋白D28K(calbindin28K，CB)和星形胶质细胞的可能作用。 方法 采用大鼠右侧纹状体内注射6-羟多巴胺(6-OHDA)制备帕金森病(Parkinson disease，PD)模型。注射后第7天，根据行为学分析筛选模型鼠，将模型鼠随机分为3组:空白对照组，PBS组(右侧黑质注射PBS)和GDNF组(右侧黑质注射GDNF)。空白对照组动物分别于6-OHDA注射后第7天、14天、21天和28天时，PBS组和GDNF组动物分别于6-OHDA注射后第14天、21天和28天时，行黑质节段连续冠状石蜡切片，以酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)、CB和胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrous acid protein，GFAP)免疫组织化学染色，分别显示DA能神经元、含CB神经元和星形胶质细胞，光镜观察以及细胞计数，统计学处理。 结果 ①TH免疫组织化学染色结果:6-OHDA注射后第28天，GDNF组大鼠右侧黑质TH表达阳性神经元数量显著多于空白对照组和PBS组;②CB免疫组织化学染色结果:6-OHDA注射后第7天，空白对照组大鼠右侧黑质尚可观察到CB表达阳性神经元，之后的时间点空白对照组和PBS组均观察不到，而GDNF组大鼠右册黑质处在所检测的各时间点均可观察到CB表达阳性神经元;③GFAP免疫组织化学染色结果:空白对照组在6-OHDA注射后第7天时有少量的GFAP表达阳性细胞，于注射后第14天时GFAP表达阳性细胞数达高峰，之后逐渐减少，注射后第28天时已基本检测不到;PBS组GFAP表达阳性细胞数量与空白对照组的表现一致，而GDNF组大鼠黑质在所检测的各时间点均可观察到大量反应性增生的星形胶质细胞。 结论 CB和(或)星形胶质细胞可能参与GDNF保护并促进PD模型大鼠黑质DA能神经元存活的过程。
关键词 :多巴胺能神经元;胶质细胞系源性神经营养因子;星形胶质细胞;钙结合蛋白D28K
The protective mechanism of GDNF on dopaminergic neurons in substantia nigra of Parkinson disease rats
DING Yan-xia，LIU Hong-mei，WANG Hong-jun，et al
(Department of Neurobiology，Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu221002，China)
Abstract:Objective To explore the possible roles of astrocytes and calbindin D28K(CB)in the process for glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)to protect dopaminergic neurons(DA neurons)in rat substantia nigra(SN)against6-hydroxydopamine(6-OHDA)neurotoxicity.Methods Rat model of Parkinson disease(PD)was established by ster-eotaxical injection of6-OHDA into the right striatum，with the qualified models screened by passing the behavioral tests.The model rats were randomly divided into three groups:PD control，PBS treatment control and GDNF treatment groups，to undergo varied treatments.The animals were decapitated1-4weeks after6-OHDA injection to proceed with the histologic study on the continuous coronal sections of the rat midbrain by means of immunohistochemistry using tha antibodies against tyrosine hydroxy-lase(TH)，CB and glial fibrillary acidic protein(GFAP)to detect the DA neurons，CB-containing neurons and astrocytes re-spectively.Results (1)The density of TH positive cells was significantly higher in the GDNF treatment group than that in the control groups.(2)The CB positive neurons could only be seen on the7th day after6-OHDA injection in the control groups，but they persisted in the GDNF treatment group through the whole28-day course of experiment.(3)In the two control groups，the GFAP positive cells emerged on the7th day after6-OHDA injection，reached the climax staining and desity on the14th day，began to decline on the21th day and almost disapeared on the28th day.However，in the GDNF treatment group，the phe-nomenon of activation of astrocytes could be evidenced throughout the experimental course.Conclusion CB and.or astrocytes may be involved in the mechanism for GDNF to protect DA neurons against6-OHDA neurotoxicity.
Key words:dopaminergic neuron;glial cell line-derived neurotrophic factor;astrocyte;calbindin D28k
帕金森病(Parkinson disease，PD)特征性病理改变为中脑黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元的进行性变性死亡。神经保护治疗致力于阻断或延缓神经元退化过程，促进残存神经元的恢复和修复。对PD患者脑的回顾性分析显示，黑质处有相当多的DA能神经元仍处于存活状态[1] ，从而为神经保护治疗提供了一个理论基础。胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GD-NF)是迄今为止所鉴定出的对中脑DA能神经元神经营养作用最强的因子之一。大量的研究表明，GDNF能够阻止或逆转PD动物模型中黑质纹状体DA系统的进行性退变[2] ，为PD神经保护治疗的首选神经营养因子。然而，在体GDNF是如何保护并促进DA能神经元存活的，至今研究甚少。钙结合蛋白D28K(calbindin D28K，CB)是钙结合蛋白家族中的一个重要成员，由于可以结合细胞内的钙离子，使细胞免受钙离子过高产生的毒性作用，从而具有细胞保护作用[3] 。本研究采用免疫组织化学染色方法，检测GDNF在保护DA能神经元过程中，CB和星形胶质细胞的标志物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达情况，以探讨在GDNF保护黑质DA能神经元过程中，CB和星形胶质细胞的可能作用，从而为进一步深入探讨GDNF保护DA能神经元的机制提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 动物及试剂 成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重200～250g，由徐州医学院实验动物中心提供。人重组GDNF、6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)、小鼠抗大鼠TH单克隆抗体、小鼠抗大鼠CB单克隆抗体、兔抗大鼠GFAP单克隆抗体和ABC试剂盒(Sigma公司);立体定位仪(KOPF，日本);封闭用羊血清原液(北京中山公司)。
1.2 脑立体定位注射 大鼠腹腔内注射戊巴比妥纳(50mg.kg)进行麻醉，麻醉前5～10min腹腔内注射阿托品(0.1mg.kg)以利于术中动物的呼吸。按照Paxinos and Watson(1986)图谱选择坐标。大鼠右侧纹状体内注射6-OHDA:6-OHDA溶液以无菌的生理盐水(含0.02%的抗坏血酸)配制，其终浓度为3g.L，共4μl。坐标为(mm):P(前囟前)+1.6;L(旁开)1.5;V(硬膜下)4.8和5.6。注射后第7天根据行为学检测筛选出PD模型鼠50只，随机分为3组:空白对照组(n=20)，实验对照组(同侧黑质处注射PBS，n=15)和实验组(同侧黑质处注射GDNF，n=15)。右侧黑质内立体定位注射:GDNF溶液以无菌的0.01mol.L PBS配制，其终浓度为5mg.L，共2μl，实验对照组注射相同体积的无菌0.01mol.L PBS。坐标为(mm):P，-4.9;L，1.8;V，8.1。用5μl的Hamiton微量注射器抽取液体，注射速度为0.5μl.min，注毕留针5min，并以1mm.min的速度缓慢退出。
1.3 行为学检测
1.3.1 姿势不对称 根据Chiang等[4] 所描述，提起鼠尾将大鼠悬空于实验台上方约10cm处，观察大鼠头或身体转动的方向，连续做20次，其中向左侧转动所占的频率作为评价指标。
1.3.2 前肢始动不能 根据Olsson等[5] 以及Lind-ner等[6] 所描述，将大鼠身体的后半部分托起，并使大鼠身体重量仅由一侧前肢支撑，记录10s内大鼠这一前肢走步的次数，然后用同样的方法测量另一侧前肢的情况。右侧肢体不对称性分值作为评价指标，计算公式如下:(右侧步数-左侧步数).两侧总步数。
1.4 取材切片 空白对照组动物分别于6-OHDA注射后第7天、14天、21天和28天时，PBS组和GD-NF组动物分别于6-OHDA注射后第14天、21天和28天时(每时间点n=5)，用4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经左心室升主动脉插管，4%多聚甲醛灌注固定，取脑后固定于同样固定液中24h。常规脱水、透明、浸蜡、包埋。做黑质区段连续冠状切片，片厚6μm，切片分组收集。
1.5 免疫组织化学染色 石蜡切片常规脱蜡至水，3%H 2 O 2 去除内源性过氧化物酶，微波修复，5%正常羊血清封闭，37℃，1h。之后分别滴加小鼠抗大鼠TH单克隆抗体(1∶3000)或小鼠抗大鼠CB单克隆抗体或兔抗大鼠GFAP单克隆抗体，置湿盒内4℃过夜;滴加相应的生物素化的二抗(1∶50)，置湿盒内4℃过夜;辣根过氧化酶标记的链霉卵白素，37℃，2h。DAB-H 2 O 2 显色2～10min。各步骤间均用0.01mol.L的PBS(pH7.4)洗5min×3次。对照实验用PBS代替一抗，其余步骤相同，显色之后常规脱水透明，中性树脂封片。
1.6 细胞计数 6-OHDA纹状体内注射的坐标点相当于黑质嘴侧1.3～2.3多巴胺能神经元的纹状体投射区，根据Paxinos and Watson(1986)图谱，选择距前囟点-4.7mm～-5.2mm之间作为阳性细胞计数区，在40倍物镜下进行阳性细胞计数。
1.7 统计学处理 使用单因素方差分析程序，分别对均数两两间进行比较和显著性检验，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 动物模型的制备 经典的研究PD的动物模型———黑质内给予6-OHDA所制备的PD模型损毁为急性(24h内)过程，黑质损伤较彻底，不适于对PD的研究。纹状体内给予6-OHDA所制备的PD模型中，黑质DA能神经元的死亡是缓慢进行性的[7-8] ，与PD病理变化较接近，从而为人们提供了理想的研究PD的动物模型。因此本研究采用纹状 体内给予6-OHDA制备大鼠PD模型。研究表明，该模型在纹状体内给予6-OHDA第5天时，纹状体TH表达阳性纤维的丧失达高峰[9] ，第7天时，纹状体[3 H]氟苯咪吲哚标记的DA摄入减少达最大[10] 。因此损毁后第7天时模型鼠已表现出显著的症状，根据行为学分析可以筛选出PD模型大鼠。
大鼠单侧纹状体内注射6-OHDA第7天时，使用行为学分析筛选出50只PD模型大鼠:姿势不对称分值在62.9%以上，以及前肢始动不能分值在-0.276以下的大鼠。
2.2 GDNF的保护作用 右侧纹状体内注射6-OHDA后第28天，同侧黑质TH表达阳性神经元数统计分析结果显示，空白对照组为212.5±12.5976、PBS组为130.1667±15.7787和GDNF组为107.1667±7.6004，其中空白对照组和PBS组相比无统计学意义，空白对照组和GDNF组相比以及PBS组和GDNF组相比差异均有统计学意义(图1)。
图1 大鼠右侧纹状体内给予6-OHDA后第28天，各组动物同侧黑质TH免疫组织化学染色及TH表达阳性神经元数的比较(略)
A、B、C分别代表空白对照组、PBS组和GDNF组(DAB法，×400)
2.3 CB的表达情况 大鼠右侧纹状体内注射6-OHDA后第7天时，空白对照组大鼠同侧黑质仍可观察到CB表达阳性细胞(图2A)，第14天、第21天及第28天时，则观察不到CB表达阳性细胞(图2B，C，D)。PBS组大鼠在注射6-OHDA后第14天时、第21天及第28天时CB的表达情况与空白对照组相应时间点相同。而GDNF组大鼠在注射6-OHDA后第14天时、第21天及第28天时在同侧黑质均可观察到着色较深的CB表达阳性细胞(图3)。
图2 空白对照组大鼠在右侧纹状体内给予6-OHDA后不同时间点，同侧黑质处CB免疫组织化学染色(略)
A、B、C和D分别代表纹状体内给予6-OHDA后的第7、14、21和28天(DAB法，×400)
2.4 星行胶质细胞反应性增生情况 右侧纹状体内注射6-OHDA第7天时，空白对照组大鼠同侧黑质开始有较弱的反应性星形胶质细胞的出现(图4A)，注射后第14天出现强烈的星形胶质细胞的反应性增生，表现为胞体变大，突起变粗、数量增加(图4B)。注射后第21天时，突起明显变细，变短，数量显著减少(图4C)。注射后第28天时，几乎检测不到星形胶质细胞(图4D)。PBS组大鼠损伤侧黑质在6-OHDA注射后第14天、第21天及第28天时的表现与空白对照组相应时间点基本相同。GDNF组大鼠在6-OHDA注射后第14天、第21天及第28天时均可观察到强烈的星形胶质细胞的反应性增生(图5)。我们进行了各组大鼠右侧黑质处GFAP表达阳性细胞数在不同时间点的比较，结果显示:在6-OHDA注射后第21天及第28天时，GDNF组GFAP表达阳性细胞数均高于空白对照组和PBS组，差异有统计学意义。另外，GDNF组在6-OHDA注射后第14天、第21天及第28天时GFAP表达阳性细胞数无显著差异(图6)。
图3 GDNF组大鼠在右侧纹状体内给予6-OHDA后不同时间点，同侧黑质处CB免疫组织化学染色(略)
A、B和C分别代表纹状体内给予6-OHDA后的第14、21和28天(DAB法，×400)
图4 空白对照组大鼠在右侧纹状体内给予6-OHDA后不同时间点，同侧黑质处GFAP免疫组织化学染色(略)
A、B、C和D分别代表纹状体内给予6-OHDA后的第7、14、21和28天(DAB法，×400)
图5 GDNF组大鼠在右侧纹状体内给予6-OHDA后不同时间点，同侧黑质处GFAP免疫组织化学染色(略)
A、B和C分别代表纹状体内给予6-OHDA后的第14、21和28天(DAB法，×400)
图6 各组大鼠在纹状体内给予6-OHDA后的不同时间点右侧黑质GFAP表达阳性细胞数的比较(略)
3 讨论
有研究显示，纹状体内给予6-OHDA1个月后，黑质内单次给予GDNF，能够上调受损DA能神经元TH的表达、挽救黑质的DA能神经元[11] 。本研究的结果与之一致。不同的是，本实验在损伤1周时就给予GDNF，虽然使用的GDNF剂量小于上述研究中所使用的剂量，GDNF仍阻断了DA能神经元的死亡。
GDNF能够阻止或逆转PD动物模型中DA能神经元的进行性退变已被大量的研究所证实。然而，关于在体GDNF是如何保护并促进DA能神经元存活的，则研究甚少。有研究显示，中脑内含CB的DA能神经元具有很强的抗变性能力[12] 。那么，GD-NF是否可通过促进CB表达而保护DA能神经元呢?Meyer等[13] 在体外培养实验中观察到，GDNF能够促进DA能神经元CB的表达。我们的研究进一步发现，在6-OHDA损伤的PD模型中，GDNF能够阻断DA能神经元的死亡，同时还能促进CB的表达，说明GDNF通过促进CB表达而保护DA能神经元的可能性很大。至于GDNF是如何促进DA能神经元CB的表达?有待于进一步深入研究。
有研究显示，大鼠单侧纹状体内给予6-OHDA制备的PD模型在6-OHDA注射第7天时，注射侧黑质处开始出现星形胶质细胞的反应性增生，一直持续到6-OHDA注射后第21天[14] 。我们的结果与之一致。本实验首次观察6-OHDA注射第28天时黑质处星形胶质细胞反应性增生的情况，发现此时已无星形胶质细胞反应性增生的迹象。而单侧纹状体内给予6-OHDA后第7天同侧黑质内又给予 GDNF，在6-OHDA注射后第14天、第21天和第28天时黑质处一直有明显的星形胶质细胞的反应性增生，说明GDNF能够促进星形胶质细胞的持续反应性增生。研究表明，星形胶质细胞反应性增生后，可分泌一些神经营养因子，如GDNF、BDNF、CNF以及FGF-2等，这些因子都是已知的能够促进DA能神经元存活的因子[15] 。星形胶质细胞反应性增生后还可通过表达谷胱甘肽过氧化物酶或上调谷胱甘肽的合成而保护神经元免受氧化应激损害[16] 。另外，培养条件下，从腹侧中脑分离的Ⅰ型星形胶质细胞能够促进DA能神经元的存活[17] 。由此，在体GDNF有可能通过促进星形胶质细胞的持续反应性增生，而发挥其长期的保护作用。虽然，1993年Lin等[18] 发现，中脑培养物中加入GDNF后，星形胶质细胞的密度并没有增加，其GFAP的表达也没有增加，但是我们的结果与之并不矛盾。因为一方面，离体并不能完全等同于在体的情况;另一方面，在我们的实验中，黑质内给予GDNF时，此处已开始出现星形胶质细胞的反应性增生，有可能GDNF只作用于已增生的星形胶质细胞，使之持续增生，而不能够使原本静止的星形胶质细胞增生活化。
参考文献 :
[1] Javoy-Agid F，Hirsch EC，Dumas S，et al.Decreased tyrosine hydroxylase messenger RNA in the surviving dopamine neurons of the substsntia nigra in Parkinson′s disease:an in situ hybridization study[J].Neuroscience，1990，38(1):245-253.
[2] Grondin R，Gash DM.Glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF):a drug candidate for the treatment of Parkinson′s disease [J].J Neurol，1998，245(11Suppl3):35-42.
[3] Inception AM，Quintero ME，Miller EK.Calbindin-D28k:a poten-tial neuroprotective protein[J].Neurodegeneration，1994，3:1-6.
[4] Chiang YH，Lin SZ，Borlongan CV，et al.Transplantation of fetal kidney tissue reduces cerebral infarction induced by middle cerebral artery ligation[J].J Cereb Blood Flow Metab，1999，19(12):1329-1335.
[5] Olsson M，Nikkhah G，Bentlage C，et al.Forelimb akinesia in the rat Parkinson model:differential effects of dopamine agonists and nigral transplants as assessed by a new stepping test[J].J Neurosci，1995，15(5Pt2):3863-3875.
[6] Lindner MD，Plone MA，Francis JM，et al.Rats with partial striatal dopamine depletions exhibit robust and long-lasting behavioral deficits in a simple fixed-ratio bar-pressing task[J].Behav Brain Res，1997，86(1):25-40.
[7] Sauer H，Oertel WH.Progressive degeneration of nigrostriatal dopam-ine neurons following intrastriatal terminal lesions with6-hydroxydo-pamine:a combined retrograde tracing and immunocytochemical study in the rat[J].Neuroscience，1994，59(2):401-415.
[8] Lee CS，Sauer H，Bjorklund A.Dopaminergic neuronal degeneration and motor impairments following axon terminal lesion by intrastriatal6-hydroxydopamine in the rat[J].Neuroscience，1996，72(3):641-653.
[9] Jenkins R，O'Shea R，Thomas KL，et al.C-jun expression in sub-stantia nigra neurons following striatal6-hydroxydopamine lesions in the rat[J].Neuroscience，1993，53(2):447-455.
[10] Przedborski S，Levivier M，Jiang H，et al.Dose-dependent lesions of the dopaminergic nigrostriatal pathway induced by intrastriatal in-jection of6-hydroxydopamine[J].Neuroscience，1995，67(3):631-647.
[11] Bowenkamp KE，Hoffman AF，Gerhardt GA，et al.Glial cell line-derived neurotrophic factor supports survival of injured midbrain do-paminergic neurons[J].J Comp Neurol，1995，355(4):479-489.
[12] Yamada T，McGeer PL，Baimbridge KG，et al.Relative sparing in Parkinson′s disease of substantia nigra dopamine neurons containing calbindin-D28K[J].Brain Res，1990，526(2):303-307.
[13] Meyer M，Zimmer J，Seiler RW，et al.GDNF increases the density of cells containing calbindin but not of cells containing calretinin in cultured rat and human fetal nigral tissue[J].Cell Transplant，1999，8(1):25-36.
[14] Gomide VC，Silveira GA，Chadi G.Transient and widespread astro-glial activation in the brain after a striatal6-OHDA-induced partial lesion of the nigrostriatal system[J].Int J Neurosci，2005，115(1):99-117.
[15] Siegel GJ，Chauhan NB.Neurotrophic factors in Alzheimer′s disease and Parkinson′s disease brain[J].Brain Res Brain Res Rev，2000，33(2-3):199-227.
[16] Damier P，Hirsch EC，Zhang P，et al.Glutathione peroxidase，glial cells and Parkinson′s disease[J].Neuroscience，1993，52(1):1-6.
[17] Takeshima T，Johnston JM，Commissiong JW.Mesencephalic type1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation[J].J Neurosci，1994，14(8):4769-4779.
[18] Lin LF，Doherty DH，Lile JD，et al.GDNF:a glial cell line-de-rived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurones[J].Sci-ence，1993，260(5111):1130-1132.
本文编辑 :程春开
(徐州医学院神经生物学教研室，江苏徐州221002), 百拇医药(丁艳霞，刘洪梅，王红军，王炎强，高殿帅)
关键词 :多巴胺能神经元;胶质细胞系源性神经营养因子;星形胶质细胞;钙结合蛋白D28K
The protective mechanism of GDNF on dopaminergic neurons in substantia nigra of Parkinson disease rats
DING Yan-xia，LIU Hong-mei，WANG Hong-jun，et al
(Department of Neurobiology，Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu221002，China)
Abstract:Objective To explore the possible roles of astrocytes and calbindin D28K(CB)in the process for glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)to protect dopaminergic neurons(DA neurons)in rat substantia nigra(SN)against6-hydroxydopamine(6-OHDA)neurotoxicity.Methods Rat model of Parkinson disease(PD)was established by ster-eotaxical injection of6-OHDA into the right striatum，with the qualified models screened by passing the behavioral tests.The model rats were randomly divided into three groups:PD control，PBS treatment control and GDNF treatment groups，to undergo varied treatments.The animals were decapitated1-4weeks after6-OHDA injection to proceed with the histologic study on the continuous coronal sections of the rat midbrain by means of immunohistochemistry using tha antibodies against tyrosine hydroxy-lase(TH)，CB and glial fibrillary acidic protein(GFAP)to detect the DA neurons，CB-containing neurons and astrocytes re-spectively.Results (1)The density of TH positive cells was significantly higher in the GDNF treatment group than that in the control groups.(2)The CB positive neurons could only be seen on the7th day after6-OHDA injection in the control groups，but they persisted in the GDNF treatment group through the whole28-day course of experiment.(3)In the two control groups，the GFAP positive cells emerged on the7th day after6-OHDA injection，reached the climax staining and desity on the14th day，began to decline on the21th day and almost disapeared on the28th day.However，in the GDNF treatment group，the phe-nomenon of activation of astrocytes could be evidenced throughout the experimental course.Conclusion CB and.or astrocytes may be involved in the mechanism for GDNF to protect DA neurons against6-OHDA neurotoxicity.
Key words:dopaminergic neuron;glial cell line-derived neurotrophic factor;astrocyte;calbindin D28k
帕金森病(Parkinson disease，PD)特征性病理改变为中脑黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元的进行性变性死亡。神经保护治疗致力于阻断或延缓神经元退化过程，促进残存神经元的恢复和修复。对PD患者脑的回顾性分析显示，黑质处有相当多的DA能神经元仍处于存活状态[1] ，从而为神经保护治疗提供了一个理论基础。胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GD-NF)是迄今为止所鉴定出的对中脑DA能神经元神经营养作用最强的因子之一。大量的研究表明，GDNF能够阻止或逆转PD动物模型中黑质纹状体DA系统的进行性退变[2] ，为PD神经保护治疗的首选神经营养因子。然而，在体GDNF是如何保护并促进DA能神经元存活的，至今研究甚少。钙结合蛋白D28K(calbindin D28K，CB)是钙结合蛋白家族中的一个重要成员，由于可以结合细胞内的钙离子，使细胞免受钙离子过高产生的毒性作用，从而具有细胞保护作用[3] 。本研究采用免疫组织化学染色方法，检测GDNF在保护DA能神经元过程中，CB和星形胶质细胞的标志物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达情况，以探讨在GDNF保护黑质DA能神经元过程中，CB和星形胶质细胞的可能作用，从而为进一步深入探讨GDNF保护DA能神经元的机制提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 动物及试剂 成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重200～250g，由徐州医学院实验动物中心提供。人重组GDNF、6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)、小鼠抗大鼠TH单克隆抗体、小鼠抗大鼠CB单克隆抗体、兔抗大鼠GFAP单克隆抗体和ABC试剂盒(Sigma公司);立体定位仪(KOPF，日本);封闭用羊血清原液(北京中山公司)。
1.2 脑立体定位注射 大鼠腹腔内注射戊巴比妥纳(50mg.kg)进行麻醉，麻醉前5～10min腹腔内注射阿托品(0.1mg.kg)以利于术中动物的呼吸。按照Paxinos and Watson(1986)图谱选择坐标。大鼠右侧纹状体内注射6-OHDA:6-OHDA溶液以无菌的生理盐水(含0.02%的抗坏血酸)配制，其终浓度为3g.L，共4μl。坐标为(mm):P(前囟前)+1.6;L(旁开)1.5;V(硬膜下)4.8和5.6。注射后第7天根据行为学检测筛选出PD模型鼠50只，随机分为3组:空白对照组(n=20)，实验对照组(同侧黑质处注射PBS，n=15)和实验组(同侧黑质处注射GDNF，n=15)。右侧黑质内立体定位注射:GDNF溶液以无菌的0.01mol.L PBS配制，其终浓度为5mg.L，共2μl，实验对照组注射相同体积的无菌0.01mol.L PBS。坐标为(mm):P，-4.9;L，1.8;V，8.1。用5μl的Hamiton微量注射器抽取液体，注射速度为0.5μl.min，注毕留针5min，并以1mm.min的速度缓慢退出。
1.3 行为学检测
1.3.1 姿势不对称 根据Chiang等[4] 所描述，提起鼠尾将大鼠悬空于实验台上方约10cm处，观察大鼠头或身体转动的方向，连续做20次，其中向左侧转动所占的频率作为评价指标。
1.3.2 前肢始动不能 根据Olsson等[5] 以及Lind-ner等[6] 所描述，将大鼠身体的后半部分托起，并使大鼠身体重量仅由一侧前肢支撑，记录10s内大鼠这一前肢走步的次数，然后用同样的方法测量另一侧前肢的情况。右侧肢体不对称性分值作为评价指标，计算公式如下:(右侧步数-左侧步数).两侧总步数。
1.4 取材切片 空白对照组动物分别于6-OHDA注射后第7天、14天、21天和28天时，PBS组和GD-NF组动物分别于6-OHDA注射后第14天、21天和28天时(每时间点n=5)，用4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经左心室升主动脉插管，4%多聚甲醛灌注固定，取脑后固定于同样固定液中24h。常规脱水、透明、浸蜡、包埋。做黑质区段连续冠状切片，片厚6μm，切片分组收集。
1.5 免疫组织化学染色 石蜡切片常规脱蜡至水，3%H 2 O 2 去除内源性过氧化物酶，微波修复，5%正常羊血清封闭，37℃，1h。之后分别滴加小鼠抗大鼠TH单克隆抗体(1∶3000)或小鼠抗大鼠CB单克隆抗体或兔抗大鼠GFAP单克隆抗体，置湿盒内4℃过夜;滴加相应的生物素化的二抗(1∶50)，置湿盒内4℃过夜;辣根过氧化酶标记的链霉卵白素，37℃，2h。DAB-H 2 O 2 显色2～10min。各步骤间均用0.01mol.L的PBS(pH7.4)洗5min×3次。对照实验用PBS代替一抗，其余步骤相同，显色之后常规脱水透明，中性树脂封片。
1.6 细胞计数 6-OHDA纹状体内注射的坐标点相当于黑质嘴侧1.3～2.3多巴胺能神经元的纹状体投射区，根据Paxinos and Watson(1986)图谱，选择距前囟点-4.7mm～-5.2mm之间作为阳性细胞计数区，在40倍物镜下进行阳性细胞计数。
1.7 统计学处理 使用单因素方差分析程序，分别对均数两两间进行比较和显著性检验，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 动物模型的制备 经典的研究PD的动物模型———黑质内给予6-OHDA所制备的PD模型损毁为急性(24h内)过程，黑质损伤较彻底，不适于对PD的研究。纹状体内给予6-OHDA所制备的PD模型中，黑质DA能神经元的死亡是缓慢进行性的[7-8] ，与PD病理变化较接近，从而为人们提供了理想的研究PD的动物模型。因此本研究采用纹状 体内给予6-OHDA制备大鼠PD模型。研究表明，该模型在纹状体内给予6-OHDA第5天时，纹状体TH表达阳性纤维的丧失达高峰[9] ，第7天时，纹状体[3 H]氟苯咪吲哚标记的DA摄入减少达最大[10] 。因此损毁后第7天时模型鼠已表现出显著的症状，根据行为学分析可以筛选出PD模型大鼠。
大鼠单侧纹状体内注射6-OHDA第7天时，使用行为学分析筛选出50只PD模型大鼠:姿势不对称分值在62.9%以上，以及前肢始动不能分值在-0.276以下的大鼠。
2.2 GDNF的保护作用 右侧纹状体内注射6-OHDA后第28天，同侧黑质TH表达阳性神经元数统计分析结果显示，空白对照组为212.5±12.5976、PBS组为130.1667±15.7787和GDNF组为107.1667±7.6004，其中空白对照组和PBS组相比无统计学意义，空白对照组和GDNF组相比以及PBS组和GDNF组相比差异均有统计学意义(图1)。
图1 大鼠右侧纹状体内给予6-OHDA后第28天，各组动物同侧黑质TH免疫组织化学染色及TH表达阳性神经元数的比较(略)
A、B、C分别代表空白对照组、PBS组和GDNF组(DAB法，×400)
2.3 CB的表达情况 大鼠右侧纹状体内注射6-OHDA后第7天时，空白对照组大鼠同侧黑质仍可观察到CB表达阳性细胞(图2A)，第14天、第21天及第28天时，则观察不到CB表达阳性细胞(图2B，C，D)。PBS组大鼠在注射6-OHDA后第14天时、第21天及第28天时CB的表达情况与空白对照组相应时间点相同。而GDNF组大鼠在注射6-OHDA后第14天时、第21天及第28天时在同侧黑质均可观察到着色较深的CB表达阳性细胞(图3)。
图2 空白对照组大鼠在右侧纹状体内给予6-OHDA后不同时间点，同侧黑质处CB免疫组织化学染色(略)
A、B、C和D分别代表纹状体内给予6-OHDA后的第7、14、21和28天(DAB法，×400)
2.4 星行胶质细胞反应性增生情况 右侧纹状体内注射6-OHDA第7天时，空白对照组大鼠同侧黑质开始有较弱的反应性星形胶质细胞的出现(图4A)，注射后第14天出现强烈的星形胶质细胞的反应性增生，表现为胞体变大，突起变粗、数量增加(图4B)。注射后第21天时，突起明显变细，变短，数量显著减少(图4C)。注射后第28天时，几乎检测不到星形胶质细胞(图4D)。PBS组大鼠损伤侧黑质在6-OHDA注射后第14天、第21天及第28天时的表现与空白对照组相应时间点基本相同。GDNF组大鼠在6-OHDA注射后第14天、第21天及第28天时均可观察到强烈的星形胶质细胞的反应性增生(图5)。我们进行了各组大鼠右侧黑质处GFAP表达阳性细胞数在不同时间点的比较，结果显示:在6-OHDA注射后第21天及第28天时，GDNF组GFAP表达阳性细胞数均高于空白对照组和PBS组，差异有统计学意义。另外，GDNF组在6-OHDA注射后第14天、第21天及第28天时GFAP表达阳性细胞数无显著差异(图6)。
图3 GDNF组大鼠在右侧纹状体内给予6-OHDA后不同时间点，同侧黑质处CB免疫组织化学染色(略)
A、B和C分别代表纹状体内给予6-OHDA后的第14、21和28天(DAB法，×400)
图4 空白对照组大鼠在右侧纹状体内给予6-OHDA后不同时间点，同侧黑质处GFAP免疫组织化学染色(略)
A、B、C和D分别代表纹状体内给予6-OHDA后的第7、14、21和28天(DAB法，×400)
图5 GDNF组大鼠在右侧纹状体内给予6-OHDA后不同时间点，同侧黑质处GFAP免疫组织化学染色(略)
A、B和C分别代表纹状体内给予6-OHDA后的第14、21和28天(DAB法，×400)
图6 各组大鼠在纹状体内给予6-OHDA后的不同时间点右侧黑质GFAP表达阳性细胞数的比较(略)
3 讨论
有研究显示，纹状体内给予6-OHDA1个月后，黑质内单次给予GDNF，能够上调受损DA能神经元TH的表达、挽救黑质的DA能神经元[11] 。本研究的结果与之一致。不同的是，本实验在损伤1周时就给予GDNF，虽然使用的GDNF剂量小于上述研究中所使用的剂量，GDNF仍阻断了DA能神经元的死亡。
GDNF能够阻止或逆转PD动物模型中DA能神经元的进行性退变已被大量的研究所证实。然而，关于在体GDNF是如何保护并促进DA能神经元存活的，则研究甚少。有研究显示，中脑内含CB的DA能神经元具有很强的抗变性能力[12] 。那么，GD-NF是否可通过促进CB表达而保护DA能神经元呢?Meyer等[13] 在体外培养实验中观察到，GDNF能够促进DA能神经元CB的表达。我们的研究进一步发现，在6-OHDA损伤的PD模型中，GDNF能够阻断DA能神经元的死亡，同时还能促进CB的表达，说明GDNF通过促进CB表达而保护DA能神经元的可能性很大。至于GDNF是如何促进DA能神经元CB的表达?有待于进一步深入研究。
有研究显示，大鼠单侧纹状体内给予6-OHDA制备的PD模型在6-OHDA注射第7天时，注射侧黑质处开始出现星形胶质细胞的反应性增生，一直持续到6-OHDA注射后第21天[14] 。我们的结果与之一致。本实验首次观察6-OHDA注射第28天时黑质处星形胶质细胞反应性增生的情况，发现此时已无星形胶质细胞反应性增生的迹象。而单侧纹状体内给予6-OHDA后第7天同侧黑质内又给予 GDNF，在6-OHDA注射后第14天、第21天和第28天时黑质处一直有明显的星形胶质细胞的反应性增生，说明GDNF能够促进星形胶质细胞的持续反应性增生。研究表明，星形胶质细胞反应性增生后，可分泌一些神经营养因子，如GDNF、BDNF、CNF以及FGF-2等，这些因子都是已知的能够促进DA能神经元存活的因子[15] 。星形胶质细胞反应性增生后还可通过表达谷胱甘肽过氧化物酶或上调谷胱甘肽的合成而保护神经元免受氧化应激损害[16] 。另外，培养条件下，从腹侧中脑分离的Ⅰ型星形胶质细胞能够促进DA能神经元的存活[17] 。由此，在体GDNF有可能通过促进星形胶质细胞的持续反应性增生，而发挥其长期的保护作用。虽然，1993年Lin等[18] 发现，中脑培养物中加入GDNF后，星形胶质细胞的密度并没有增加，其GFAP的表达也没有增加，但是我们的结果与之并不矛盾。因为一方面，离体并不能完全等同于在体的情况;另一方面，在我们的实验中，黑质内给予GDNF时，此处已开始出现星形胶质细胞的反应性增生，有可能GDNF只作用于已增生的星形胶质细胞，使之持续增生，而不能够使原本静止的星形胶质细胞增生活化。
参考文献 :
[1] Javoy-Agid F，Hirsch EC，Dumas S，et al.Decreased tyrosine hydroxylase messenger RNA in the surviving dopamine neurons of the substsntia nigra in Parkinson′s disease:an in situ hybridization study[J].Neuroscience，1990，38(1):245-253.
[2] Grondin R，Gash DM.Glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF):a drug candidate for the treatment of Parkinson′s disease [J].J Neurol，1998，245(11Suppl3):35-42.
[3] Inception AM，Quintero ME，Miller EK.Calbindin-D28k:a poten-tial neuroprotective protein[J].Neurodegeneration，1994，3:1-6.
[4] Chiang YH，Lin SZ，Borlongan CV，et al.Transplantation of fetal kidney tissue reduces cerebral infarction induced by middle cerebral artery ligation[J].J Cereb Blood Flow Metab，1999，19(12):1329-1335.
[5] Olsson M，Nikkhah G，Bentlage C，et al.Forelimb akinesia in the rat Parkinson model:differential effects of dopamine agonists and nigral transplants as assessed by a new stepping test[J].J Neurosci，1995，15(5Pt2):3863-3875.
[6] Lindner MD，Plone MA，Francis JM，et al.Rats with partial striatal dopamine depletions exhibit robust and long-lasting behavioral deficits in a simple fixed-ratio bar-pressing task[J].Behav Brain Res，1997，86(1):25-40.
[7] Sauer H，Oertel WH.Progressive degeneration of nigrostriatal dopam-ine neurons following intrastriatal terminal lesions with6-hydroxydo-pamine:a combined retrograde tracing and immunocytochemical study in the rat[J].Neuroscience，1994，59(2):401-415.
[8] Lee CS，Sauer H，Bjorklund A.Dopaminergic neuronal degeneration and motor impairments following axon terminal lesion by intrastriatal6-hydroxydopamine in the rat[J].Neuroscience，1996，72(3):641-653.
[9] Jenkins R，O'Shea R，Thomas KL，et al.C-jun expression in sub-stantia nigra neurons following striatal6-hydroxydopamine lesions in the rat[J].Neuroscience，1993，53(2):447-455.
[10] Przedborski S，Levivier M，Jiang H，et al.Dose-dependent lesions of the dopaminergic nigrostriatal pathway induced by intrastriatal in-jection of6-hydroxydopamine[J].Neuroscience，1995，67(3):631-647.
[11] Bowenkamp KE，Hoffman AF，Gerhardt GA，et al.Glial cell line-derived neurotrophic factor supports survival of injured midbrain do-paminergic neurons[J].J Comp Neurol，1995，355(4):479-489.
[12] Yamada T，McGeer PL，Baimbridge KG，et al.Relative sparing in Parkinson′s disease of substantia nigra dopamine neurons containing calbindin-D28K[J].Brain Res，1990，526(2):303-307.
[13] Meyer M，Zimmer J，Seiler RW，et al.GDNF increases the density of cells containing calbindin but not of cells containing calretinin in cultured rat and human fetal nigral tissue[J].Cell Transplant，1999，8(1):25-36.
[14] Gomide VC，Silveira GA，Chadi G.Transient and widespread astro-glial activation in the brain after a striatal6-OHDA-induced partial lesion of the nigrostriatal system[J].Int J Neurosci，2005，115(1):99-117.
[15] Siegel GJ，Chauhan NB.Neurotrophic factors in Alzheimer′s disease and Parkinson′s disease brain[J].Brain Res Brain Res Rev，2000，33(2-3):199-227.
[16] Damier P，Hirsch EC，Zhang P，et al.Glutathione peroxidase，glial cells and Parkinson′s disease[J].Neuroscience，1993，52(1):1-6.
[17] Takeshima T，Johnston JM，Commissiong JW.Mesencephalic type1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation[J].J Neurosci，1994，14(8):4769-4779.
[18] Lin LF，Doherty DH，Lile JD，et al.GDNF:a glial cell line-de-rived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurones[J].Sci-ence，1993，260(5111):1130-1132.
本文编辑 :程春开
(徐州医学院神经生物学教研室，江苏徐州221002), 百拇医药(丁艳霞，刘洪梅，王红军，王炎强，高殿帅)