苏合香的鉴别及其肉桂酸的含量测定
摘 要 目的：用HPLC和TLC法定性测定炮制前后的苏合香油,并用反相高效液相色谱法测定苏合香中肉桂酸的含量。方法：HPLC在适当的条件下，采用色谱峰检出法，TLC采用硅胶GF254薄层板,ψ(石油醚∶正己烷∶甲酸乙酯∶甲酸)=10∶30∶15∶1为展开剂,荧光及硫酸乙醇喷雾两次检出; 定量采用ODS C18色谱柱(4.6 mm×150 mm×5μm),流动相：ψ(甲醇∶水∶乙酸)=58∶42∶0.3，检测波长271 nm，流速：1 mL/min。结果：HPLC给出了分离良好的色谱指纹图谱；炮制前后苏合香也有明显的相同和不同的TLC斑点。定量时,肉桂酸在ρ=0.0025~0.06 mg/mL 范围内与峰面积有良好的线性关系(r=0.9990)；加样回收率为10097%，RSD=0.67%(n=5)。结论：本法操作简便，结果准确，可作为制定质量控制方法的参考。
关键词 苏合香； 肉桂酸； 薄层鉴别； HPLC； 含量测定
The identification of storax and determination of cassia acid in
storax by HPLC
ZHOU Hongbing,XU Shufeng,YAO Haiyan，ZHOU Yuanxiong
(1.Department of Pharmacy,Guang dong College of Pharmacy，Guangzhou,Guangdong,510224；2.Guagzhou Chenliji Pharmaceuticel Factry，Guangzhou,Guangdong 510180)
Abstract To establish a method for the identification of storax and the determination of cassia acid in storax by HPLC. Methods: TLC and HPLC were applied. The determination was carried out using ODS C18 column,with mobile phase consisted of ψ(methanol∶water∶acetic acid)=58∶42∶0.3,and detective wavelength of 271 nm . Results: The linear range of paracetamol was 0.0025~0.06 mg/mL . The average recovery of loading sample was 100.97%,RSD=0.67% (n=5) .Conclusion: The method is convenient for a good resolution and can be used for the quality control of storax .
Key words storax; cassia acid; identification by TLC; HPLC; determination
苏合香为金色缕梅科植物苏合香树Liquidambar orientalis Mill. 的树干渗出的香树脂，经加工精制而成。本品具有开窍、破秽、止痛的功效，可用于中风、痰厥、卒然昏倒，胸腹冷痛，惊痫和温症。近年来有报道苏合香有抗血小板聚集和提高血小板内CAMP含量，从而发挥抗血栓的作用。在含苏合香的一些中成药中，也有采用炮制过的苏合香入药。苏合香的鉴别药典采用化学法和TLC法，以肉桂酸作对照；定量采用容量法[1]，也有文章报道采用紫外法、HPLC法[2]和毛细管电泳法[3]。为控制苏合香的质量,本实验参考相关文献，采用HPLC和TLC法鉴别并比较了炮制前后苏合香薄层斑点的异同，同时采用高效液相色谱法测定了苏合香中游离肉桂酸和总肉桂酸的含量。该结果可作为苏合香质量控制的参考。
1 仪器与试药
1.1 仪器
日本SHIMADZU LC-10AT 高效液相色谱仪，ODS C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,天津凯德公司)，WDL-95色谱工作站(Ver3.10)，FA1104电子分析天平，6010紫外分光光度计(上海分析仪器一厂)。
1.2 试药、试剂
苏合香、肉桂酸和桂皮醛对照品(中国药品生物制品检定所)；苏合香原料(B.E.DANIELS LTD,批号：59442~59446)，炮制苏合香原料(H.K.CLJSLET提供)；乙醚(A.R批号20020520)、乙醇 (C.P批号20021009)、甲醇(A.R批号20020920) 汕头市光华化学厂；乙酸 (C.P 广州乐红化工厂，批号20020820)。
2 实验与结果
2.1 溶液配制
2.1.1 对照溶液
分别取肉桂酸、桂皮醛约25 mg，精密称定，分置25 mL容量瓶，乙醇溶液溶解并稀释至刻度(1 mg/mL)作为对照品溶液(称溶液A1、A2)。苏合香药材对照溶液，同前配制(溶液B)。
2.1.2 苏合香样品溶液
2.1.2.1 定性用溶液
取苏合香油适量，同“2.1.1”项下配制(溶液C)。
2.1.2.2 游离肉桂酸定量用溶液
精密称取苏合香油约0.5 g，置带塞试管中，加乙醚5 mL溶解，用5%NaCO3溶液10 mL萃取3次,合并萃取液,加盐酸调至pH4,用乙醚10 mL萃取3次,合并乙醚层并回收乙醚,残渣用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中,精密吸取1 mL于10 mL容量瓶中,甲醇定容,冷藏备用(溶液D)[2]。
2.1.2.3 总肉桂酸定量用溶液
称取样品0.5 g,置烧瓶中，加0.5 mol/L 醇制KOH 25 mL,水浴中回流1 h,回收乙醇,残渣加热水50 mL,使分散均匀,冷却,加水80 mL与硫酸镁溶液(1.5→50)50 mL,混匀,静置10 min,过滤,滤渣用20 mL蒸馏水洗涤,合并洗液和滤液,加HCl成酸性(pH4),乙醚萃取2次,分取并合并醚层,回收乙醚,残渣甲醇溶解,定容25 mL,精密取1 mL于25 mL容量瓶中,甲醇定容,冷藏备用(溶液E)。
2.1.2.4 炮制后的苏合香溶液
原料样品经多次加热、红外灯照射等制成无水苏合香样品，精密称取05 g，置带塞试管中，加乙醚5 mL溶解。其余步骤同“21.1”项进行样品处理(溶液F)。
2.2 定性比较
2.2.1 薄层色谱条件
硅胶GF254板(15 mm×10 mm,青岛海洋化工厂),展开剂:ψ(石油醚∶正己烷∶甲酸一酯∶甲酸)10∶30∶15∶1，将溶液A1、A2、C、F点样展开后，先用荧光检出,后喷硫酸乙醇显色。结果见图1、2。
2.2.2 HPLC法定性
色谱条件：C18色谱柱，甲醇-水-乙酸系统为流动相，取溶液A1+A2、B、C分别进样5μL，每样45 min，色谱图见图3、4、5。
2.3.1 HPLC条件
色谱柱C18(4.6 mm×150 mm×5μm)，柱温：室温，流动相：ψ(甲醇∶水∶乙酸)=58∶42∶0.3，流速:1 mL/min，检测波长：271 nm,进样量：5μL。
2.3.2 线性关系
广东药学院学报(ACAD J GCP) 2003，19(3)第3期 周宏兵，等：苏合香的鉴别及其肉桂酸的含量测定取肉桂酸对照液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 mL置10 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,再取出1.0 mL,置10 mL量瓶中,用甲醇定容。按上述色谱条件,5μL进样2次,求峰面积平均值,以其为纵坐标,进样量(μg/mL)为横坐标,绘制标准曲线,回归得线性方程:
Y=17484 ρ-16155, r=0.9990
结果表明肉桂酸在ρ=2.5~30.0μg/mL范围内与峰面积有良好的线性关系。对照品样品色谱图见图6、7。
2.4 精密度试验
按上述色谱条件，取浓度为2.5、10.0、30.0μg/mL的对照品溶液,分别连续重复进样5次，测定峰面积，计算得RSD分别为2.86%、1.95%、1.26%。
2.5 回收率试验
按上述色谱条件，取样品约0.5 g,精密称定，加标准品(1 mg/mL)0.5 mL,同样品溶液配制方法处理,甲醇定容。连续重复进样每次5μL,按样品测定项下的方法测定,计算回收率,结果见表1。表1 加样回收率(略)
取游离及总肉桂酸样品溶液,各进样5μL,得肉桂酸含量,结果见表2图4。
表2 肉桂酸含量测定结果(略)
3 讨论
3.1 苏合香为含多成分的混合物,药典采用TLC法进行鉴别,以肉桂酸为对照,很不完善。本文用HPLC指纹图对照，专属性强,而且简单、快捷，能较好的鉴别其真伪和优劣，见图3、4、5。
3.2 由于有的中成药采用炮制过的苏合香入药,为鉴别和监控质量,将炮制前后的原料药与10年前的炮制物采用TLC法比较,结果前后相隔10年的炮制物展开斑点基本一致。说明TLC法可用于鉴别苏合香炮制物，见图1、2。
3.3 药典中规定的苏合香中香脂酸含量测定方法采用容量法，操作繁琐，且所测出的是总有机酸含量，专属性不高。本文以肉桂酸为对照品，采用高效液相色谱法测定苏合香油中游离肉桂酸和总肉桂酸含量，方法简便，回收率、重现性均较好。但结果与药典规定有出入,可能药典用氢氧化钾皂化后容量法测得为总有机酸含量,而本法则测得为乙醚提取纯肉桂酸含量。
3.4 通过肉桂酸标准品溶液的UV检测，测得其最大吸收为271 nm，所以HPLC法测定波长为271 nm，见图8。
3.5 本实验同时测定了炮制前后苏合香中肉桂酸的量，发现炮制后肉桂酸含量已很低，在指纹图上已不再见到271 nm处有吸收，此时色谱图为一条直线。
3.6 通过对几组流动相系统进行选择，表明以ψ(甲醇∶水∶乙酸)=58∶42∶0.3为定量最佳实验条件。并且达到了药典系统适用性要求，肉桂酸峰形对称性f=0.95,与相邻峰之间的分离度R=5.12，以肉桂酸峰计，理论塔板数n=3600。
参考文献
[1]中国药典(2000年版一部)[S].389.
[2]郭安,邹云,王新宏,等.麝香保心丸中苏合香脂的含量测定方法[J].中成药，2000，22(7)：479.
[3]李蓓,车镇涛.胶束电动毛细管电泳色谱法测定苏合香和枫香脂中总桂皮酸的含量[J].上海医科大学学报，1999,26(5)：380.
[4]罗光明,杨武亮,赖学文,等.苏合香质量控制方法的比较研究[J].药物分析杂志，1996，16(5)：339.
1.广东药学院药学系，广东 广州 510224;
2.广州陈李济制药厂，广东 广州 510180, http://www.100md.com(周宏兵 徐淑峰 姚海燕 周远雄)
关键词 苏合香； 肉桂酸； 薄层鉴别； HPLC； 含量测定
The identification of storax and determination of cassia acid in
storax by HPLC
ZHOU Hongbing,XU Shufeng,YAO Haiyan，ZHOU Yuanxiong
(1.Department of Pharmacy,Guang dong College of Pharmacy，Guangzhou,Guangdong,510224；2.Guagzhou Chenliji Pharmaceuticel Factry，Guangzhou,Guangdong 510180)
Abstract To establish a method for the identification of storax and the determination of cassia acid in storax by HPLC. Methods: TLC and HPLC were applied. The determination was carried out using ODS C18 column,with mobile phase consisted of ψ(methanol∶water∶acetic acid)=58∶42∶0.3,and detective wavelength of 271 nm . Results: The linear range of paracetamol was 0.0025~0.06 mg/mL . The average recovery of loading sample was 100.97%,RSD=0.67% (n=5) .Conclusion: The method is convenient for a good resolution and can be used for the quality control of storax .
Key words storax; cassia acid; identification by TLC; HPLC; determination
苏合香为金色缕梅科植物苏合香树Liquidambar orientalis Mill. 的树干渗出的香树脂，经加工精制而成。本品具有开窍、破秽、止痛的功效，可用于中风、痰厥、卒然昏倒，胸腹冷痛，惊痫和温症。近年来有报道苏合香有抗血小板聚集和提高血小板内CAMP含量，从而发挥抗血栓的作用。在含苏合香的一些中成药中，也有采用炮制过的苏合香入药。苏合香的鉴别药典采用化学法和TLC法，以肉桂酸作对照；定量采用容量法[1]，也有文章报道采用紫外法、HPLC法[2]和毛细管电泳法[3]。为控制苏合香的质量,本实验参考相关文献，采用HPLC和TLC法鉴别并比较了炮制前后苏合香薄层斑点的异同，同时采用高效液相色谱法测定了苏合香中游离肉桂酸和总肉桂酸的含量。该结果可作为苏合香质量控制的参考。
1 仪器与试药
1.1 仪器
日本SHIMADZU LC-10AT 高效液相色谱仪，ODS C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,天津凯德公司)，WDL-95色谱工作站(Ver3.10)，FA1104电子分析天平，6010紫外分光光度计(上海分析仪器一厂)。
1.2 试药、试剂
苏合香、肉桂酸和桂皮醛对照品(中国药品生物制品检定所)；苏合香原料(B.E.DANIELS LTD,批号：59442~59446)，炮制苏合香原料(H.K.CLJSLET提供)；乙醚(A.R批号20020520)、乙醇 (C.P批号20021009)、甲醇(A.R批号20020920) 汕头市光华化学厂；乙酸 (C.P 广州乐红化工厂，批号20020820)。
2 实验与结果
2.1 溶液配制
2.1.1 对照溶液
分别取肉桂酸、桂皮醛约25 mg，精密称定，分置25 mL容量瓶，乙醇溶液溶解并稀释至刻度(1 mg/mL)作为对照品溶液(称溶液A1、A2)。苏合香药材对照溶液，同前配制(溶液B)。
2.1.2 苏合香样品溶液
2.1.2.1 定性用溶液
取苏合香油适量，同“2.1.1”项下配制(溶液C)。
2.1.2.2 游离肉桂酸定量用溶液
精密称取苏合香油约0.5 g，置带塞试管中，加乙醚5 mL溶解，用5%NaCO3溶液10 mL萃取3次,合并萃取液,加盐酸调至pH4,用乙醚10 mL萃取3次,合并乙醚层并回收乙醚,残渣用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中,精密吸取1 mL于10 mL容量瓶中,甲醇定容,冷藏备用(溶液D)[2]。
2.1.2.3 总肉桂酸定量用溶液
称取样品0.5 g,置烧瓶中，加0.5 mol/L 醇制KOH 25 mL,水浴中回流1 h,回收乙醇,残渣加热水50 mL,使分散均匀,冷却,加水80 mL与硫酸镁溶液(1.5→50)50 mL,混匀,静置10 min,过滤,滤渣用20 mL蒸馏水洗涤,合并洗液和滤液,加HCl成酸性(pH4),乙醚萃取2次,分取并合并醚层,回收乙醚,残渣甲醇溶解,定容25 mL,精密取1 mL于25 mL容量瓶中,甲醇定容,冷藏备用(溶液E)。
2.1.2.4 炮制后的苏合香溶液
原料样品经多次加热、红外灯照射等制成无水苏合香样品，精密称取05 g，置带塞试管中，加乙醚5 mL溶解。其余步骤同“21.1”项进行样品处理(溶液F)。
2.2 定性比较
2.2.1 薄层色谱条件
硅胶GF254板(15 mm×10 mm,青岛海洋化工厂),展开剂:ψ(石油醚∶正己烷∶甲酸一酯∶甲酸)10∶30∶15∶1，将溶液A1、A2、C、F点样展开后，先用荧光检出,后喷硫酸乙醇显色。结果见图1、2。
2.2.2 HPLC法定性
色谱条件：C18色谱柱，甲醇-水-乙酸系统为流动相，取溶液A1+A2、B、C分别进样5μL，每样45 min，色谱图见图3、4、5。
2.3.1 HPLC条件
色谱柱C18(4.6 mm×150 mm×5μm)，柱温：室温，流动相：ψ(甲醇∶水∶乙酸)=58∶42∶0.3，流速:1 mL/min，检测波长：271 nm,进样量：5μL。
2.3.2 线性关系
广东药学院学报(ACAD J GCP) 2003，19(3)第3期 周宏兵，等：苏合香的鉴别及其肉桂酸的含量测定取肉桂酸对照液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 mL置10 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,再取出1.0 mL,置10 mL量瓶中,用甲醇定容。按上述色谱条件,5μL进样2次,求峰面积平均值,以其为纵坐标,进样量(μg/mL)为横坐标,绘制标准曲线,回归得线性方程:
Y=17484 ρ-16155, r=0.9990
结果表明肉桂酸在ρ=2.5~30.0μg/mL范围内与峰面积有良好的线性关系。对照品样品色谱图见图6、7。
2.4 精密度试验
按上述色谱条件，取浓度为2.5、10.0、30.0μg/mL的对照品溶液,分别连续重复进样5次，测定峰面积，计算得RSD分别为2.86%、1.95%、1.26%。
2.5 回收率试验
按上述色谱条件，取样品约0.5 g,精密称定，加标准品(1 mg/mL)0.5 mL,同样品溶液配制方法处理,甲醇定容。连续重复进样每次5μL,按样品测定项下的方法测定,计算回收率,结果见表1。表1 加样回收率(略)
取游离及总肉桂酸样品溶液,各进样5μL,得肉桂酸含量,结果见表2图4。
表2 肉桂酸含量测定结果(略)
3 讨论
3.1 苏合香为含多成分的混合物,药典采用TLC法进行鉴别,以肉桂酸为对照,很不完善。本文用HPLC指纹图对照，专属性强,而且简单、快捷，能较好的鉴别其真伪和优劣，见图3、4、5。
3.2 由于有的中成药采用炮制过的苏合香入药,为鉴别和监控质量,将炮制前后的原料药与10年前的炮制物采用TLC法比较,结果前后相隔10年的炮制物展开斑点基本一致。说明TLC法可用于鉴别苏合香炮制物，见图1、2。
3.3 药典中规定的苏合香中香脂酸含量测定方法采用容量法，操作繁琐，且所测出的是总有机酸含量，专属性不高。本文以肉桂酸为对照品，采用高效液相色谱法测定苏合香油中游离肉桂酸和总肉桂酸含量，方法简便，回收率、重现性均较好。但结果与药典规定有出入,可能药典用氢氧化钾皂化后容量法测得为总有机酸含量,而本法则测得为乙醚提取纯肉桂酸含量。
3.4 通过肉桂酸标准品溶液的UV检测，测得其最大吸收为271 nm，所以HPLC法测定波长为271 nm，见图8。
3.5 本实验同时测定了炮制前后苏合香中肉桂酸的量，发现炮制后肉桂酸含量已很低，在指纹图上已不再见到271 nm处有吸收，此时色谱图为一条直线。
3.6 通过对几组流动相系统进行选择，表明以ψ(甲醇∶水∶乙酸)=58∶42∶0.3为定量最佳实验条件。并且达到了药典系统适用性要求，肉桂酸峰形对称性f=0.95,与相邻峰之间的分离度R=5.12，以肉桂酸峰计，理论塔板数n=3600。
参考文献
[1]中国药典(2000年版一部)[S].389.
[2]郭安,邹云,王新宏,等.麝香保心丸中苏合香脂的含量测定方法[J].中成药，2000，22(7)：479.
[3]李蓓,车镇涛.胶束电动毛细管电泳色谱法测定苏合香和枫香脂中总桂皮酸的含量[J].上海医科大学学报，1999,26(5)：380.
[4]罗光明,杨武亮,赖学文,等.苏合香质量控制方法的比较研究[J].药物分析杂志，1996，16(5)：339.
1.广东药学院药学系，广东 广州 510224;
2.广州陈李济制药厂，广东 广州 510180, http://www.100md.com(周宏兵 徐淑峰 姚海燕 周远雄)
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