荞麦花叶总黄酮对大鼠急性压力负荷cfos蛋白表达的影响
Effect of total flavones of buckwheat flower and leaf on cfos protein expression in course of acute pressure overload in rats
YAO WenJuan,HAN ShuYing,SONG HuiShuang
Department of Pharmacology, North China Coal Medical College, Tangshan 063000, China, Department of Neurosurgery, Central Hospital,China Petroleum Natural Gas Conglomerate, Langfang 065000, China
【Abstract】 AIM: To explore the effect of total flavones of buckwheat flower and leaf (TFBFL) on the expression of cfos protein in the course of acute pressure overload of the left ventricle in rats. METHODS: The rat models of myocardial hypertrophy caused by abdominal aortic banding were given ig TFBFL 0.1, 0.2 and 0.4 g/(kg/d)or captopril 60 mg/(kg/d) before operation. At 1, 3 and 12 h after operation,the expression of cfos was detected by immunohistochemistry following the sacrification of all rats. RESULTS: The expression of cfos in the left ventricular had a significant increase after 1 h of abdominal aortic banding and reached a peak at 3 h, decreased at 12 h. Compared with the models of myocardial hypertrophy, TFBFL 0.4, 0.2 and 0.1 g/(kg/d) reduced the expression of cfos by 21.41% (P<0.01), 14.52% (P<0.05) and 10.36% after 3 h of abdominal aortic banding. CONCLUSION: TFBFL can decrease the expression of cfos in the course of acute pressure overload of the left ventricle in rats.
【Keywords】 myocardial hypertrophy; total flavones; pressure overload; buckwheat; cfos protein
【摘要】 目的：观察荞麦花叶提取的总黄酮(TFBFL)对大鼠急性压力负荷左心室cfos蛋白表达的影响. 方法：通过腹主动脉狭窄建立心肌肥厚模型,术前给予TFBFL 0.1, 0.2和0.4 g/(kg/d)，卡托普利 60 mg/(kg/d). 分别于狭窄后1，3和12 h处死动物取材. 用免疫组化方法检测左室心肌cfos蛋白的表达. 结果：正常大鼠心肌没有或仅有少量cfos表达，腹主动脉狭窄后1 h, cfos表达明显增加，3 h达高峰，较对照组升高约3倍，12 h开始下降. 腹主动脉狭窄后3 h, TFBFL 0.4, 0.2和0.1 g/(kg/d)与心肌肥厚组相比, cfos表达分别降低21.41%(P<0.01)，14.52%(P<0.05)和10.36%. 结论：TFBFL可明显降低cfos蛋白的表达.
【关键词】 心肌肥厚; 总黄酮; 压力负荷; 荞麦; cfos蛋白
0引言
心肌肥厚是多种心血管疾病的共同病理过程，也是心衰的结构基础，主要表现为心肌重构、心脏的顺应性和循环泵功能降低. 关于心肌肥厚的发生机制至今还没有一个明确的结论，多年来一直是心血管疾病研究的热点. 荞麦花叶总黄酮(total flavones of buckwheat flower and leaf,TFBFL)是从蓼科植物甜荞麦花叶中提取的活性成分. 华北煤炭医学院药理学教研室前期研究发现TFBFL具有抗氧化和影响血管活性及对心肌肥厚具有保护等作用[1-3]. 为探讨TFBFL对心肌肥厚的影响及作用机制,我们采用大鼠腹主动脉狭窄建立心肌肥厚模型，旨在观察TFBFL对左心室cfos蛋白表达的影响及其可能机制.
1材料和方法
1.1材料荞麦花叶(来自内蒙古库伦旗)为秋冬季因霜冻未结果而自然干燥的甜荞麦花叶. 用10倍量700 mL/L乙醇回流提取3次，合并提取液，用旋转蒸发器回收乙醇并浓缩原液量的1/2，提取液趁热过滤去除不溶性沉淀，加分离剂冷却析出淡黄色结晶，离心，沉淀物经70℃烤干即为TFBFL. 经中国科学院药物研究所鉴定为黄酮类，TFBFL含量为980 g/kg. 一抗为多克隆兔抗鼠cfos抗体，SP免疫组化试剂盒(均购自美国Santa cruz公司). MP200A型电子天平(上海第二天平仪器厂). SD大鼠108只，雄性，体质量(200±20) g，由北京中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号SCXK 11 01 0006.
1.2方法
1.2.1大鼠心肌肥厚模型建立大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/kg)后，行腹部正中切口，在双侧肾动脉上方游离一段腹主动脉，沿腹主动脉平行置一直径为0.7 mm的小圆棒(7号针头磨制)，用0号丝线绕腹主动脉和小圆棒一起结扎，随后抽出小圆棒，则使腹主动脉部分狭窄. 假手术组除不用丝线结扎外，其余操作步骤相同.
1.2.2实验动物分组取心电图(ECG)正常的健康大鼠108只，按随机数字表法随机分为6组，即假手术组，肥厚模型组，TFBFL高、中和低剂量干预组及阳性药物卡托普利对照组，每组动物再随机分为1，3和12 h，3个时间点. TFBFL干预组于术前分别给予0.4, 0.2和0.1 g/(kg/d)灌胃(ig)，卡托普利组ig 60 mg/(kg/d)共3 d. 末次给药后2 h进行手术.
1.3检测指标取左心室心尖部组织用40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋、切片. 切片脱蜡至水，0.3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，热修复抗原后,100 mL/L正常山羊血清封闭非特异性抗原，滴加一抗(1∶100稀释，兔抗鼠多克隆抗体) 4℃过夜;滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30 min；滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片. 以PBS代替一抗作阴性对照. 应用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对免疫组化图片进行图像分析，结果用积分光密度值表示，间接反映cfos蛋白的相对含量.
统计学处理:实验数据用计算机instat软件处理,所有数据以x±s表示，组间差别采用方差分析检验，P<0.05认为差异有统计学意义.
2结果
2.1cfos蛋白表达的时间进程正常大鼠左心室肌仅有少量cfos阳性细胞表达, 阳性细胞胞核着棕黄色(图1A). 压力超负荷后不同时间点cfos阳性细胞不同程度地表达(表1),阴性对照组未见cfos阳性细胞表达(图1B),由表1可见腹主动脉狭窄后1 h大鼠左心室cfos表达明显升高，3 h达高峰(图1C)，较对照组升高约3倍，12 h已经开始下降.
2.2TFBFL对cfos蛋白表达的影响由表1及图1D可见阳性药物卡托普利可明显抑制cfos的表达，TFBFL可抑制左心室cfos的表达,高剂量优于中低剂量(图1E~F). 以腹主动脉狭窄后3 h大鼠左心室cfos表达为例，TFBFL高、中、低剂量与心肌肥厚组相比,积分光密度分别降低21.41%(P<0.01)，14.52%(P<0.05)和10.36%.
A: 假手术组3 h cfos的表达 ×400; B: 阴性对照组cfos的表达 ×400; C: 肥厚组3 h cfos的表达 ×400; D: 卡托普利组3 h cfos的表达 ×400; E: TFBFL高剂量组3 h cfos的表达 ×400; F: TFBFL中剂量组3 h cfos的表达 ×400.
图1心肌cfos蛋白免疫组化染色(略)
表1TFBFL对cfos蛋白表达的影响(积分光密度值)(略)
bP<0.01 vs假手术组; cP<0.05, dP<0.01 vs肥厚模型组.
3讨论
本实验通过部分结扎腹主动脉的方法造成大鼠急性压力负荷心肌肥厚模型，观察cfos蛋白表达情况，并用药物TFBFL进行干预. 结果显示阳性药物卡托普利可明显抑制cfos的表达, 与文献报道[4]结果一致，说明动物模型复制成功，同时得出TFBFL对急性压力负荷心肌肥厚早期cfos表达有明显的抑制作用，并有明显的剂量效应关系. Cfos是立即早期基因之一，压力负荷cfos表达增加的直接刺激因素主要可能是由于腹主动脉狭窄后血压升高，对心肌的机械牵张增强. 有研究表明[5]，心肌细胞牵张刺激可直接增加心肌细胞内蛋白的合成. 其次也与继发性肾血流量减少，使肾素血管紧张素系统激活，AngⅡ分泌增加，以及应激、压力感受器兴奋使交感神经系统活性增强，儿茶酚胺含量增高等神经、体液因素有关. Cfos的核内蛋白质表达产物构成转录因子，后者可作用于次级反应基因(如肌肉收缩蛋白基因等)5′端的一些调控序列，改变与心肌肥厚有关的蛋白质表达，从而导致心肌组织中蛋白合成增加，蛋白表型向胚胎型转化等心肌肥厚特征性变化. 因此TFBFL可能通过降低原癌基因cfos从而抑制心肌肥厚. 黄酮类化合物主要成分之一槲皮素对心肌肥厚有一定的逆转作用，秦泰春等采用不同方法复制心肌肥厚动物模型，给予槲皮素后, 心肌Ca2+与动脉Ca2+含量下降， SOD活性增加,使心肌肥厚受到抑制. 同时秦泰春等[6]从细胞水平证实槲皮素可抑制血管紧张素Ⅱ致培养乳鼠心肌细胞肥大，该作用与抑制蛋白激酶C及酪氨酸蛋白激酶活性有关. 本课题组前期研究发现TFBFL具有抑制肥厚心肌AngⅡ生成的作用[2]，故推测TFBFL或其中某些成分通过抑制原癌基因cfos表达从而抑制心肌肥厚，也可能是通过调节ACE或[Ca2+]来影响cfos的表达的，其确切机制我们将进一步研究.
【参考文献】
[1] 韩淑英,吕华,朱丽莎,等.荞麦种子总黄酮降血脂、血糖及抗脂质过氧化作用的研究[J].中国药理学通报,2001,17(6):694-696.
[2] 韩淑英,张军,王志路，等.荞麦花总黄酮对大鼠心肌肥厚的保护作用[J]. 第四军医大学学报，2004，25(14)：1338-1340.
[3] 刘淑梅,韩淑英,崔国金,等.甜荞麦叶总黄酮降糖、降脂作用及机制[J].第四军医大学学报,2003，24(19):1815-1817.
[4] 魏蕾,欧阳静萍,汪长华，等. 实验性心肌肥厚大鼠左室cfos表达及卡托普利的作用[J]. 中国应用生理学杂志,2001,17(1)101-102.
[5] 席雨涛,马爱群,白晓君,等.培养心肌细胞牵张刺激装置的建立及应用[J].第四军医大学学报,2003，24(3):285-286.
[6] 秦泰春,陈玲，俞丽霞，等. 槲皮素对血管紧张素Ⅱ致培养乳鼠心肌细胞肥大的抑制作用[J].中国药理学报,2001,22(12):1103-1106.
编辑杨湘华
基金项目：唐山市科委重点实验室基金(04362001B2)
(华北煤炭医学院药理学教研室，河北 唐山 063000， 中国石油天然气集团中心医院神经外科，河北 廊坊 065000), http://www.100md.com(姚文娟，韩淑英，宋会双)
YAO WenJuan,HAN ShuYing,SONG HuiShuang
Department of Pharmacology, North China Coal Medical College, Tangshan 063000, China, Department of Neurosurgery, Central Hospital,China Petroleum Natural Gas Conglomerate, Langfang 065000, China
【Abstract】 AIM: To explore the effect of total flavones of buckwheat flower and leaf (TFBFL) on the expression of cfos protein in the course of acute pressure overload of the left ventricle in rats. METHODS: The rat models of myocardial hypertrophy caused by abdominal aortic banding were given ig TFBFL 0.1, 0.2 and 0.4 g/(kg/d)or captopril 60 mg/(kg/d) before operation. At 1, 3 and 12 h after operation,the expression of cfos was detected by immunohistochemistry following the sacrification of all rats. RESULTS: The expression of cfos in the left ventricular had a significant increase after 1 h of abdominal aortic banding and reached a peak at 3 h, decreased at 12 h. Compared with the models of myocardial hypertrophy, TFBFL 0.4, 0.2 and 0.1 g/(kg/d) reduced the expression of cfos by 21.41% (P<0.01), 14.52% (P<0.05) and 10.36% after 3 h of abdominal aortic banding. CONCLUSION: TFBFL can decrease the expression of cfos in the course of acute pressure overload of the left ventricle in rats.
【Keywords】 myocardial hypertrophy; total flavones; pressure overload; buckwheat; cfos protein
【摘要】 目的：观察荞麦花叶提取的总黄酮(TFBFL)对大鼠急性压力负荷左心室cfos蛋白表达的影响. 方法：通过腹主动脉狭窄建立心肌肥厚模型,术前给予TFBFL 0.1, 0.2和0.4 g/(kg/d)，卡托普利 60 mg/(kg/d). 分别于狭窄后1，3和12 h处死动物取材. 用免疫组化方法检测左室心肌cfos蛋白的表达. 结果：正常大鼠心肌没有或仅有少量cfos表达，腹主动脉狭窄后1 h, cfos表达明显增加，3 h达高峰，较对照组升高约3倍，12 h开始下降. 腹主动脉狭窄后3 h, TFBFL 0.4, 0.2和0.1 g/(kg/d)与心肌肥厚组相比, cfos表达分别降低21.41%(P<0.01)，14.52%(P<0.05)和10.36%. 结论：TFBFL可明显降低cfos蛋白的表达.
【关键词】 心肌肥厚; 总黄酮; 压力负荷; 荞麦; cfos蛋白
0引言
心肌肥厚是多种心血管疾病的共同病理过程，也是心衰的结构基础，主要表现为心肌重构、心脏的顺应性和循环泵功能降低. 关于心肌肥厚的发生机制至今还没有一个明确的结论，多年来一直是心血管疾病研究的热点. 荞麦花叶总黄酮(total flavones of buckwheat flower and leaf,TFBFL)是从蓼科植物甜荞麦花叶中提取的活性成分. 华北煤炭医学院药理学教研室前期研究发现TFBFL具有抗氧化和影响血管活性及对心肌肥厚具有保护等作用[1-3]. 为探讨TFBFL对心肌肥厚的影响及作用机制,我们采用大鼠腹主动脉狭窄建立心肌肥厚模型，旨在观察TFBFL对左心室cfos蛋白表达的影响及其可能机制.
1材料和方法
1.1材料荞麦花叶(来自内蒙古库伦旗)为秋冬季因霜冻未结果而自然干燥的甜荞麦花叶. 用10倍量700 mL/L乙醇回流提取3次，合并提取液，用旋转蒸发器回收乙醇并浓缩原液量的1/2，提取液趁热过滤去除不溶性沉淀，加分离剂冷却析出淡黄色结晶，离心，沉淀物经70℃烤干即为TFBFL. 经中国科学院药物研究所鉴定为黄酮类，TFBFL含量为980 g/kg. 一抗为多克隆兔抗鼠cfos抗体，SP免疫组化试剂盒(均购自美国Santa cruz公司). MP200A型电子天平(上海第二天平仪器厂). SD大鼠108只，雄性，体质量(200±20) g，由北京中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号SCXK 11 01 0006.
1.2方法
1.2.1大鼠心肌肥厚模型建立大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/kg)后，行腹部正中切口，在双侧肾动脉上方游离一段腹主动脉，沿腹主动脉平行置一直径为0.7 mm的小圆棒(7号针头磨制)，用0号丝线绕腹主动脉和小圆棒一起结扎，随后抽出小圆棒，则使腹主动脉部分狭窄. 假手术组除不用丝线结扎外，其余操作步骤相同.
1.2.2实验动物分组取心电图(ECG)正常的健康大鼠108只，按随机数字表法随机分为6组，即假手术组，肥厚模型组，TFBFL高、中和低剂量干预组及阳性药物卡托普利对照组，每组动物再随机分为1，3和12 h，3个时间点. TFBFL干预组于术前分别给予0.4, 0.2和0.1 g/(kg/d)灌胃(ig)，卡托普利组ig 60 mg/(kg/d)共3 d. 末次给药后2 h进行手术.
1.3检测指标取左心室心尖部组织用40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋、切片. 切片脱蜡至水，0.3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，热修复抗原后,100 mL/L正常山羊血清封闭非特异性抗原，滴加一抗(1∶100稀释，兔抗鼠多克隆抗体) 4℃过夜;滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30 min；滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片. 以PBS代替一抗作阴性对照. 应用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对免疫组化图片进行图像分析，结果用积分光密度值表示，间接反映cfos蛋白的相对含量.
统计学处理:实验数据用计算机instat软件处理,所有数据以x±s表示，组间差别采用方差分析检验，P<0.05认为差异有统计学意义.
2结果
2.1cfos蛋白表达的时间进程正常大鼠左心室肌仅有少量cfos阳性细胞表达, 阳性细胞胞核着棕黄色(图1A). 压力超负荷后不同时间点cfos阳性细胞不同程度地表达(表1),阴性对照组未见cfos阳性细胞表达(图1B),由表1可见腹主动脉狭窄后1 h大鼠左心室cfos表达明显升高，3 h达高峰(图1C)，较对照组升高约3倍，12 h已经开始下降.
2.2TFBFL对cfos蛋白表达的影响由表1及图1D可见阳性药物卡托普利可明显抑制cfos的表达，TFBFL可抑制左心室cfos的表达,高剂量优于中低剂量(图1E~F). 以腹主动脉狭窄后3 h大鼠左心室cfos表达为例，TFBFL高、中、低剂量与心肌肥厚组相比,积分光密度分别降低21.41%(P<0.01)，14.52%(P<0.05)和10.36%.
A: 假手术组3 h cfos的表达 ×400; B: 阴性对照组cfos的表达 ×400; C: 肥厚组3 h cfos的表达 ×400; D: 卡托普利组3 h cfos的表达 ×400; E: TFBFL高剂量组3 h cfos的表达 ×400; F: TFBFL中剂量组3 h cfos的表达 ×400.
图1心肌cfos蛋白免疫组化染色(略)
表1TFBFL对cfos蛋白表达的影响(积分光密度值)(略)
bP<0.01 vs假手术组; cP<0.05, dP<0.01 vs肥厚模型组.
3讨论
本实验通过部分结扎腹主动脉的方法造成大鼠急性压力负荷心肌肥厚模型，观察cfos蛋白表达情况，并用药物TFBFL进行干预. 结果显示阳性药物卡托普利可明显抑制cfos的表达, 与文献报道[4]结果一致，说明动物模型复制成功，同时得出TFBFL对急性压力负荷心肌肥厚早期cfos表达有明显的抑制作用，并有明显的剂量效应关系. Cfos是立即早期基因之一，压力负荷cfos表达增加的直接刺激因素主要可能是由于腹主动脉狭窄后血压升高，对心肌的机械牵张增强. 有研究表明[5]，心肌细胞牵张刺激可直接增加心肌细胞内蛋白的合成. 其次也与继发性肾血流量减少，使肾素血管紧张素系统激活，AngⅡ分泌增加，以及应激、压力感受器兴奋使交感神经系统活性增强，儿茶酚胺含量增高等神经、体液因素有关. Cfos的核内蛋白质表达产物构成转录因子，后者可作用于次级反应基因(如肌肉收缩蛋白基因等)5′端的一些调控序列，改变与心肌肥厚有关的蛋白质表达，从而导致心肌组织中蛋白合成增加，蛋白表型向胚胎型转化等心肌肥厚特征性变化. 因此TFBFL可能通过降低原癌基因cfos从而抑制心肌肥厚. 黄酮类化合物主要成分之一槲皮素对心肌肥厚有一定的逆转作用，秦泰春等采用不同方法复制心肌肥厚动物模型，给予槲皮素后, 心肌Ca2+与动脉Ca2+含量下降， SOD活性增加,使心肌肥厚受到抑制. 同时秦泰春等[6]从细胞水平证实槲皮素可抑制血管紧张素Ⅱ致培养乳鼠心肌细胞肥大，该作用与抑制蛋白激酶C及酪氨酸蛋白激酶活性有关. 本课题组前期研究发现TFBFL具有抑制肥厚心肌AngⅡ生成的作用[2]，故推测TFBFL或其中某些成分通过抑制原癌基因cfos表达从而抑制心肌肥厚，也可能是通过调节ACE或[Ca2+]来影响cfos的表达的，其确切机制我们将进一步研究.
【参考文献】
[1] 韩淑英,吕华,朱丽莎,等.荞麦种子总黄酮降血脂、血糖及抗脂质过氧化作用的研究[J].中国药理学通报,2001,17(6):694-696.
[2] 韩淑英,张军,王志路，等.荞麦花总黄酮对大鼠心肌肥厚的保护作用[J]. 第四军医大学学报，2004，25(14)：1338-1340.
[3] 刘淑梅,韩淑英,崔国金,等.甜荞麦叶总黄酮降糖、降脂作用及机制[J].第四军医大学学报,2003，24(19):1815-1817.
[4] 魏蕾,欧阳静萍,汪长华，等. 实验性心肌肥厚大鼠左室cfos表达及卡托普利的作用[J]. 中国应用生理学杂志,2001,17(1)101-102.
[5] 席雨涛,马爱群,白晓君,等.培养心肌细胞牵张刺激装置的建立及应用[J].第四军医大学学报,2003，24(3):285-286.
[6] 秦泰春,陈玲，俞丽霞，等. 槲皮素对血管紧张素Ⅱ致培养乳鼠心肌细胞肥大的抑制作用[J].中国药理学报,2001,22(12):1103-1106.
编辑杨湘华
基金项目：唐山市科委重点实验室基金(04362001B2)
(华北煤炭医学院药理学教研室，河北 唐山 063000， 中国石油天然气集团中心医院神经外科，河北 廊坊 065000), http://www.100md.com(姚文娟，韩淑英，宋会双)