甲泼尼龙和神经节苷脂对大鼠损伤脊髓CD95表达的影响
[摘要]
目的：研究甲泼尼龙(MP)加神经节苷脂(GM1)对大鼠脊髓损伤(SCI)的疗效。方法：采用Allen’s法制备SCI大鼠模型。将模型大鼠随机分为4组，A组为生理盐水对照组，B组为MP治疗组，C组为GM1治疗组，D组为MP加GM1联合治疗组。大鼠存活不同时间后分别行行为学观察再处死，取伤段脊髓作石蜡切片，行HE染色和CD95单克隆抗体免疫组化检测。结果：HE染色显示脊髓组织病理学改变B、C、D组明显轻于A组，而D组较B、C组轻。伤后2周行为学指标优差依次为DCBA(P<0.05)。免疫组化检测表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在8 h达到高峰，在白质中48 h时达到高峰，而D组虽有高峰，但明显少于A组(P<0.01)，D组也少于B、C组(P<0.01)。结论：MP与GM1联合应用可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用并可促进神经功能的恢复。
[关键词]甲泼尼龙；神经节苷脂；脊髓损伤；大鼠
[中图分类号]R651.2
Influence of methylprednisolone and ganglioside on the CD95 expression of rats’injured spinal cord
HUANG Jianhua1， WU Xiaotao2 ，YANG Qing 1 , MA Chuanxue1， FENG Qiang1, XU Ronghua1
(1. Department of Orthopaedics, Xuzhou Hospital Affiliated to the Medical College， Southeast University， Xuzhou 221009， China ; 2. Department of Orthopaedics， Zhongda Hospital， Southeast University， Nanjing 210009， China )
Abstract：Objective To investigate the curative effect of methylprednisolone (MP)and ganglioside(GM1) on rats’ spinal cord injury. Methods Preparing rats with spinal cord injury by resorting to Allen’s mode and then dividing them into four groups at random: group A (control), group B ( with MP )， group C (with GM1 ) and Group D ( with MP and GM1 ). After different periods of surviving time, behavior of different rat was observed respectively and detected by Hemetoxylin staining and CD95 monoclonal antibody immunohistochemistry. Results In injured spinal cord，the pathological changes of group B, C and D were less obvious than that of group A, while group D was less obvious than group B and C. After two weeks of the injury, the order from superiority to inferiority of the behavioral index was DCBA (P<0.05,respectively). The immunohistochemical studies showed that in group A, the number of the CD95 immunostained positive cells in gray matter peaked after 8 hours, and in white matter it peaked after 48 hours. However, although group D had its peak, it was obviously less than group A (P<0.01), and also less than group B and C (P<0.01). Conclusion The combined application of MP and GM1 can stop the apoptosis of nerve cells, provide adequate protection for injured spinal cord and enhance the recovery of nerve functions.
Key words：methylprednisolone; ganglioside; spinal cord injury; rats
脊髓损伤(SCI)的病理机制非常复杂，分为原发性损伤和继发性损伤。继发性损伤中，血管痉挛、血栓形成、微循环障碍、水肿、自由基形成、兴奋性氨基酸生成、Ca2+内流超载等因素的综合作用导致了细胞的死亡。目前认为细胞调亡可能是细胞死亡的另外一种重要形式[1]。CD95是一种跨膜糖蛋白，它可与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)样配体结合诱导细胞凋亡，在SCI早期就有表达，伤后30min在脊髓后角的神经元上有阳性表达，而且特异性强，正常脊髓没有发现CD95免疫组化的阳性表达[2]。本实验旨在观察SCI后应用甲泼尼龙(methylprednisolone,MP)加神经节苷脂(ganglioside,GM1)对CD95表达的影响，从而了解MP联合GM1用药的疗效。
1 材料与方法
1.1 材料
SD大鼠185只，体重200～300g，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供。CD95单克隆抗体(兔抗大鼠)购于北京中杉生物技术有限公司，MP购于法玛西亚普强有限公司，GM1购于齐鲁制药有限公司，其他辅助用溶剂均来源于徐州医学院病理实验室。
1.2 方法
1.2.1 SCI动物模型的制作与分组
大鼠用0.3%戊巴比妥1ml·(100mg)-1腹腔内注射麻醉，消毒，手术显露T9～11脊髓,在骨窗上将5mm×3mm×1mm的硬质塑料片平放在脊髓上作为打击垫片，用直径为2mm、重量为10g的钢棒沿带有刻度的玻璃导管从50mm高度垂直自由下落，造成SCI模型，打击后迅速移开打击钢棒，立即可观察到大鼠尾巴痉挛性左右摆动，即视为造模成功。将模型大鼠随机分为4组：A组(对照组,n=45)术后15 min给生理盐水1ml；B组(MP治疗组,n=45)予MP 30mg·kg-1 腹腔内注射,1h后按5.4mg·(kg·h)-1计算23 h药量，分3次给药；C组(GM1治疗组,n=45)予GM1 10mg·kg-1 腹腔内注射；D组(MP加GM1治疗组,n=45) MP和GM1剂量同B、C组。在SCI后1、4、8、12、24、48、72h及1、2周9个时间点分别观察斜板试验角度，随后处死大鼠，取伤段脊髓，放入10%中性甲醛溶液中固定24h，经脱水、石蜡包埋后切成4μm厚的切片，进行病理学观察。
1.2.2 HE染色
(1)将做好的切片按以下顺序脱蜡：二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)；脱过蜡的切片再按以下顺序用乙醇洗去二甲苯：无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→80%乙醇→蒸馏水。(2)苏木素中浸泡5min，用蒸馏水冲洗，放入盐酸乙醇中浸泡20s，用蒸馏水冲洗，再放入蒸馏水中浸泡15min。(3)伊红染色1min，依次在75%、80%、95%及无水乙醇中浸泡1min。(4)用中性树脂封片，晾干。
1.2.3 免疫组化检测(PV9000通用型二步法)
将切片放入二甲苯中脱蜡；在无水、95%、80%乙醇中依次浸泡1min。用3%H2O2室温孵育5min，消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水洗3遍，浸入0.01mol·L-1 PBS缓冲液(pH 7.2)中2～3min；将切片浸入PBS缓冲液中，放入医用微波炉中加热，210s 后液体即可沸腾，间断微波加热，使温度维持在90℃以上，持续20min，再室温冷却30min，使其有充足时间进行抗原修复；滴加CD95(1∶50)，室温保温盒中作用120min，PBS液洗涤3次，每次2min。滴加第二抗体(poly peroxidaseantimouse IgG,)，室温保温盒中作用30min，PBS液荡洗3次，每次2min；DAB显色；苏木素复染。阳性对照采用扁桃体组织。
1.2.4 行为学检测
(1)斜板试验[3]：以Molt斜板测量动物在斜板上维持5s不下滑的最大角度。(2)Gale评分：0分，双后肢肌力为0级，感觉消失；1分，针刺有保护反应，有感觉存在，但无自主运动；2分，双后肢有轻微运动，但无功能，不能负重；3分，双后肢明显运动，但不能负重行走；4分，能负重行走数步，但不稳定，不持久；5分，能缓慢行走，但有一定缺陷，不灵活；6分，可正常行走[4]。
1.3 统计学处理
采用数字图像处理软件系统统计阳性细胞数。所有数据均为计量资料(±s),从每个实验动物损伤区的切片中随机选取3个部分,记录阳性细胞在灰白质中的总数，求出平均数。依次记录不同时间点切片的CD95阳性细胞数，阳性细胞数在各组的差异采用q检验，统计分析使用SPSS 11.5 for Windows 统计软件，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 行为学检测(斜板试验)结果
选5只正常大鼠，测得其斜板最大角度为(60.80±2.28)°，各组SCI后不同时间斜板最大角度的比较见表1。
2.2 Gale 评分结果
见表2。
表1 各组SCI后不同时间斜板最大角度(略)
表2 各时间段Gale 评分结果(略)
元变性；8h时B组白质中有出血灶，但结构清晰，C组灰质中神经元结构完整，胞核清晰；12～24h时两组灰质中虽有出血灶，但周边神经元结构完整，核及胞浆清晰；3～14d时两组灰质中可见增生胶质细胞，灰质边缘有神经元细胞，结构完整,但B组灰质中神经元轻度变性。D组：1～4h时灰质中央有点状出血，神经元数目较多，形态尚完整，胞核清晰(图3)；8h时神经元胞膜完整，核固缩，白质结构相对清晰；12～24h时灰质边缘神经元结构完整，核仁清晰；2～14d时神经元结构完整，胞核清晰，胶质细胞增生。
图1 A组SCI后 1h HE×400(略)
Fig 1 The photomicrograph of group A showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图2 C组SCI后1h HE×400(略)
Fig 2 The photomicrograph of group C showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图3 D组SCI后1h HE×400(略)
Fig 4 The photomicrograph of group D showing pathological change 1 hour
after SCI (HE×400)
2.4 免疫组化检测CD95表达情况
免疫组化检测显示，在阴性对照组(假手术组)没有发现CD95的阳性表达。SCI 1h，在脊髓灰质前、后角的神经元和胶质细胞上有阳性表达(细胞膜和细胞浆可见棕黄色)，但在白质中未见阳性表达；SCI 4h在灰质中可见强阳性表达，白质中有少量阳性细胞的表达(图4)；SCI 8h灰质中神经元细胞和胶质细胞CD95阳性表达明显增加，白质中胶质细胞CD95阳性表达也增加，并且达到最高峰(图5)；SCI 24～72h CD95阳性表达细胞为圆形有致密黑核的胶质细胞；SCI 1周后灰质中CD95阳性表达细胞甚少，CD95阳性表达细胞主要集中在白质中；SCI 2周后白质中CD95阳性表达很少。联合应用MP与GM1后CD95阳性表达细胞在各个时间点都比A组明显减少(图6)；在SCI 8h后虽然CD95阳性表达细胞数达到高峰，但较A组明显降低(P<0.01)；D组CD95阳性表达细胞数较B、C两组亦有减少(P<0.01)；在SCI 48h后白质中CD95阳性表达细胞数达到高峰，以胶质细胞为主，而阳性表达的神经元逐渐减少；SCI 2周时灰白质阳性表达细胞数基本消失。见表3。
图4 A组SCI后4h 免疫组化×200(略)
Fig 4 The photomicrograph of group Ashowing immunohistochemical expression of CD95 4 hour after SCI (×200)
图5 A组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 5 The photomicrograph of group A showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI (×200)
图6 D组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 6 The photomicrograph of group D showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI(×200)
3 讨论
SCI分为原发性损伤与继发性损伤。原发性损伤包括机械压迫、出血；继发性损害包括水肿、炎症反应、局部缺血、谷氨酸受体过度激活、钙离子溢出及过氧化作用等。在原发性损伤后较长一段时间内起作用的是一种细胞和分子水平的主动调节过程，具有可逆性。继发性损害可加重原发损伤，造成脊髓功能障碍，致机体全瘫或不全瘫[5]。众所周知，严重的SCI能触发一系列生化和代谢改变，它们从灰质向白质放射状展开，常引起不可逆转的损害。我们通过HE染色切片可见，SCI后病理改变从开始的灰质中出现出血灶及神经元细胞的变性到白质中出现出血灶及胶质细胞的增生、空泡的形成，与以上观点是吻合的。细胞死亡方式有两种，即坏死和凋亡。凋亡在SCI中的作用已被证明[6]。近年来，SCI后细胞凋亡所起的作用逐渐被认识，凋亡可以促进损伤区的继发性变性，可以使损伤区的传导束脱髓鞘。到目前为止，对原发性SCI尚无有效的治疗方法，仅依靠外科手术是不够的。继发性损害可加重原发性损伤，那么，对细胞凋亡进行积极控制有可能成为减轻SCI的有效途径之一。据认为，CD95分子在SCI后呈特异性表达，是反映SCI的客观指标之一。我们的实验表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在SCI后8h达到高峰，在白质中48h达到高峰，而D组的细胞凋亡数一直处于较低水平，虽然在SCI后8 h及48h有高峰，但较A 组明显减少(P<0.01)。通过实验可见细胞凋亡数由开始的灰质中出现到增多，而后白质中出现到增多，同时灰质中减少。最后灰白质中完全消失，这与中心性脊髓坏死的发展相一致。Gale评分及斜板试验表明D组神经功能有明显改善，切片HE染色可见灰质中央点状出血灶，神经元胞核清晰，较A组的病理变化明显减轻；CD95阳性表达细胞数亦较A组少；由此可见SCI后脊髓组织病理变化轻和细胞凋亡的减少及神经功能的恢复相一致。
激素类制剂在20世纪60年代开始应用于SCI的治疗，主要是因为激素能减轻SCI后的继发水肿。近年来研究认为，MP具有多方面的神经保护作用：(1)改善微循环，抑制脂质过氧化反应，减轻外伤后神经细胞的变性[7]；(2)减少细胞钙内流[8]；(3)维持神经元的兴奋性。
表3 大鼠SCI后不同时程CD95免疫反应阳性细胞数(略)
GM1是目前公认的一种谷氨酸受体拮抗剂[9]。其作用机制包括：(1)抗神经毒性作用，通过抑制谷氨酸NMDA受体介导的大量钙离子内流，从而防止细胞内钙离子超载所继发的一系列病理生理过程[10]；(2)神经营养作用，神经生长因子能维持神经元的存活和功能，对神经元具有营养作用，能够阻断神经元病理损害过程，明显促进神经组织再生[11]；(3)维持神经细胞膜线粒体的结构和功能，改善神经组织缺血缺氧，调节神经递质，改善神经传导速度[12]。
MP与GM1联合治疗SCI的可能机制是：(1)减轻组织细胞水肿。水肿是细胞损害后较早出现的一种表现，有效控制水肿对阻止病情发展意义重大。MP能拮抗抗利尿激素，减少远曲小管和集合管对水的重吸收，促使水的排出，从而减轻组织水肿。GM1 是通过恢复和活跃细胞膜Na+ K+ATP酶的活性，把大量的细胞内Na+逆浓度差转运出细胞膜外，减少钠水潴溜，从而减少细胞内水的含量，有效减轻细胞内水肿。本实验表明，在光镜下见D组SCI有轻度水肿，由此可见，联合用药能明显减轻组织细胞水肿。(2)抑制钙离子内流。由于细胞内的钙离子超载可导致神经细胞的损伤，促使细胞凋亡，因此，联合用药有利于阻止钙离子内流。(3)修复损伤的神经细胞。GM1是位于细胞膜表面的糖鞘脂，在中枢神经尤为丰富。动物试验表明GM1能通过血脑屏障，在神经损伤区含量最高，与损伤区的神经组织和神经细胞有高度的亲和力，并通过稳定膜结构与功能发挥作用[13]。因此，联合应用MP与GM1能有效阻止神经细胞的凋亡并促使损伤神经细胞的恢复。
本实验表明，A组凋亡发生早，且在SCI后8h及48h，CD95阳性细胞数达到高峰，而D组CD95阳性细胞数一直处于较低的水平，虽然在SCI后8h及48h亦有高峰，但较A组明显减少，可见MP加GM1治疗SCI具有较好的疗效，说明在SCI早期应用MP加GM1治疗，可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用，并能促进神经功能的恢复。
[参考文献]
[1] RINK A， FUNG K M， TROJANOWSKI J Q， et al. Evidences of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injure in the rat [J]. Am J Pathol， 1995， 147: 15751583.
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[收稿日期]20051008
东南大学医学院附属徐州医院骨科，江苏 徐州 221009
东南大学附属中大医院骨科，江苏 南京 210009
[基金项目]江苏省卫生厅奥赛康科研基金资助项目(P200503)
[摘要]
目的：研究甲泼尼龙(MP)加神经节苷脂(GM1)对大鼠脊髓损伤(SCI)的疗效。方法：采用Allen’s法制备SCI大鼠模型。将模型大鼠随机分为4组，A组为生理盐水对照组，B组为MP治疗组，C组为GM1治疗组，D组为MP加GM1联合治疗组。大鼠存活不同时间后分别行行为学观察再处死，取伤段脊髓作石蜡切片，行HE染色和CD95单克隆抗体免疫组化检测。结果：HE染色显示脊髓组织病理学改变B、C、D组明显轻于A组，而D组较B、C组轻。伤后2周行为学指标优差依次为DCBA(P<0.05)。免疫组化检测表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在8 h达到高峰，在白质中48 h时达到高峰，而D组虽有高峰，但明显少于A组(P<0.01)，D组也少于B、C组(P<0.01)。结论：MP与GM1联合应用可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用并可促进神经功能的恢复。
[关键词]甲泼尼龙；神经节苷脂；脊髓损伤；大鼠
[中图分类号]R651.2
Influence of methylprednisolone and ganglioside on the CD95 expression of rats’injured spinal cord
HUANG Jianhua1， WU Xiaotao2 ，YANG Qing 1 , MA Chuanxue1， FENG Qiang1, XU Ronghua1
(1. Department of Orthopaedics, Xuzhou Hospital Affiliated to the Medical College， Southeast University， Xuzhou 221009， China ; 2. Department of Orthopaedics， Zhongda Hospital， Southeast University， Nanjing 210009， China )
Abstract：Objective To investigate the curative effect of methylprednisolone (MP)and ganglioside(GM1) on rats’ spinal cord injury. Methods Preparing rats with spinal cord injury by resorting to Allen’s mode and then dividing them into four groups at random: group A (control), group B ( with MP )， group C (with GM1 ) and Group D ( with MP and GM1 ). After different periods of surviving time, behavior of different rat was observed respectively and detected by Hemetoxylin staining and CD95 monoclonal antibody immunohistochemistry. Results In injured spinal cord，the pathological changes of group B, C and D were less obvious than that of group A, while group D was less obvious than group B and C. After two weeks of the injury, the order from superiority to inferiority of the behavioral index was DCBA (P<0.05,respectively). The immunohistochemical studies showed that in group A, the number of the CD95 immunostained positive cells in gray matter peaked after 8 hours, and in white matter it peaked after 48 hours. However, although group D had its peak, it was obviously less than group A (P<0.01), and also less than group B and C (P<0.01). Conclusion The combined application of MP and GM1 can stop the apoptosis of nerve cells, provide adequate protection for injured spinal cord and enhance the recovery of nerve functions.
Key words：methylprednisolone; ganglioside; spinal cord injury; rats
脊髓损伤(SCI)的病理机制非常复杂，分为原发性损伤和继发性损伤。继发性损伤中，血管痉挛、血栓形成、微循环障碍、水肿、自由基形成、兴奋性氨基酸生成、Ca2+内流超载等因素的综合作用导致了细胞的死亡。目前认为细胞调亡可能是细胞死亡的另外一种重要形式[1]。CD95是一种跨膜糖蛋白，它可与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)样配体结合诱导细胞凋亡，在SCI早期就有表达，伤后30min在脊髓后角的神经元上有阳性表达，而且特异性强，正常脊髓没有发现CD95免疫组化的阳性表达[2]。本实验旨在观察SCI后应用甲泼尼龙(methylprednisolone,MP)加神经节苷脂(ganglioside,GM1)对CD95表达的影响，从而了解MP联合GM1用药的疗效。
1 材料与方法
1.1 材料
SD大鼠185只，体重200～300g，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供。CD95单克隆抗体(兔抗大鼠)购于北京中杉生物技术有限公司，MP购于法玛西亚普强有限公司，GM1购于齐鲁制药有限公司，其他辅助用溶剂均来源于徐州医学院病理实验室。
1.2 方法
1.2.1 SCI动物模型的制作与分组
大鼠用0.3%戊巴比妥1ml·(100mg)-1腹腔内注射麻醉，消毒，手术显露T9～11脊髓,在骨窗上将5mm×3mm×1mm的硬质塑料片平放在脊髓上作为打击垫片，用直径为2mm、重量为10g的钢棒沿带有刻度的玻璃导管从50mm高度垂直自由下落，造成SCI模型，打击后迅速移开打击钢棒，立即可观察到大鼠尾巴痉挛性左右摆动，即视为造模成功。将模型大鼠随机分为4组：A组(对照组,n=45)术后15 min给生理盐水1ml；B组(MP治疗组,n=45)予MP 30mg·kg-1 腹腔内注射,1h后按5.4mg·(kg·h)-1计算23 h药量，分3次给药；C组(GM1治疗组,n=45)予GM1 10mg·kg-1 腹腔内注射；D组(MP加GM1治疗组,n=45) MP和GM1剂量同B、C组。在SCI后1、4、8、12、24、48、72h及1、2周9个时间点分别观察斜板试验角度，随后处死大鼠，取伤段脊髓，放入10%中性甲醛溶液中固定24h，经脱水、石蜡包埋后切成4μm厚的切片，进行病理学观察。
1.2.2 HE染色
(1)将做好的切片按以下顺序脱蜡：二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)；脱过蜡的切片再按以下顺序用乙醇洗去二甲苯：无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→80%乙醇→蒸馏水。(2)苏木素中浸泡5min，用蒸馏水冲洗，放入盐酸乙醇中浸泡20s，用蒸馏水冲洗，再放入蒸馏水中浸泡15min。(3)伊红染色1min，依次在75%、80%、95%及无水乙醇中浸泡1min。(4)用中性树脂封片，晾干。
1.2.3 免疫组化检测(PV9000通用型二步法)
将切片放入二甲苯中脱蜡；在无水、95%、80%乙醇中依次浸泡1min。用3%H2O2室温孵育5min，消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水洗3遍，浸入0.01mol·L-1 PBS缓冲液(pH 7.2)中2～3min；将切片浸入PBS缓冲液中，放入医用微波炉中加热，210s 后液体即可沸腾，间断微波加热，使温度维持在90℃以上，持续20min，再室温冷却30min，使其有充足时间进行抗原修复；滴加CD95(1∶50)，室温保温盒中作用120min，PBS液洗涤3次，每次2min。滴加第二抗体(poly peroxidaseantimouse IgG,)，室温保温盒中作用30min，PBS液荡洗3次，每次2min；DAB显色；苏木素复染。阳性对照采用扁桃体组织。
1.2.4 行为学检测
(1)斜板试验[3]：以Molt斜板测量动物在斜板上维持5s不下滑的最大角度。(2)Gale评分：0分，双后肢肌力为0级，感觉消失；1分，针刺有保护反应，有感觉存在，但无自主运动；2分，双后肢有轻微运动，但无功能，不能负重；3分，双后肢明显运动，但不能负重行走；4分，能负重行走数步，但不稳定，不持久；5分，能缓慢行走，但有一定缺陷，不灵活；6分，可正常行走[4]。
1.3 统计学处理
采用数字图像处理软件系统统计阳性细胞数。所有数据均为计量资料(±s),从每个实验动物损伤区的切片中随机选取3个部分,记录阳性细胞在灰白质中的总数，求出平均数。依次记录不同时间点切片的CD95阳性细胞数，阳性细胞数在各组的差异采用q检验，统计分析使用SPSS 11.5 for Windows 统计软件，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 行为学检测(斜板试验)结果
选5只正常大鼠，测得其斜板最大角度为(60.80±2.28)°，各组SCI后不同时间斜板最大角度的比较见表1。
2.2 Gale 评分结果
见表2。
表1 各组SCI后不同时间斜板最大角度(略)
表2 各时间段Gale 评分结果(略)
元变性；8h时B组白质中有出血灶，但结构清晰，C组灰质中神经元结构完整，胞核清晰；12～24h时两组灰质中虽有出血灶，但周边神经元结构完整，核及胞浆清晰；3～14d时两组灰质中可见增生胶质细胞，灰质边缘有神经元细胞，结构完整,但B组灰质中神经元轻度变性。D组：1～4h时灰质中央有点状出血，神经元数目较多，形态尚完整，胞核清晰(图3)；8h时神经元胞膜完整，核固缩，白质结构相对清晰；12～24h时灰质边缘神经元结构完整，核仁清晰；2～14d时神经元结构完整，胞核清晰，胶质细胞增生。
图1 A组SCI后 1h HE×400(略)
Fig 1 The photomicrograph of group A showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图2 C组SCI后1h HE×400(略)
Fig 2 The photomicrograph of group C showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图3 D组SCI后1h HE×400(略)
Fig 4 The photomicrograph of group D showing pathological change 1 hour
after SCI (HE×400)
2.4 免疫组化检测CD95表达情况
免疫组化检测显示，在阴性对照组(假手术组)没有发现CD95的阳性表达。SCI 1h，在脊髓灰质前、后角的神经元和胶质细胞上有阳性表达(细胞膜和细胞浆可见棕黄色)，但在白质中未见阳性表达；SCI 4h在灰质中可见强阳性表达，白质中有少量阳性细胞的表达(图4)；SCI 8h灰质中神经元细胞和胶质细胞CD95阳性表达明显增加，白质中胶质细胞CD95阳性表达也增加，并且达到最高峰(图5)；SCI 24～72h CD95阳性表达细胞为圆形有致密黑核的胶质细胞；SCI 1周后灰质中CD95阳性表达细胞甚少，CD95阳性表达细胞主要集中在白质中；SCI 2周后白质中CD95阳性表达很少。联合应用MP与GM1后CD95阳性表达细胞在各个时间点都比A组明显减少(图6)；在SCI 8h后虽然CD95阳性表达细胞数达到高峰，但较A组明显降低(P<0.01)；D组CD95阳性表达细胞数较B、C两组亦有减少(P<0.01)；在SCI 48h后白质中CD95阳性表达细胞数达到高峰，以胶质细胞为主，而阳性表达的神经元逐渐减少；SCI 2周时灰白质阳性表达细胞数基本消失。见表3。
图4 A组SCI后4h 免疫组化×200(略)
Fig 4 The photomicrograph of group Ashowing immunohistochemical expression of CD95 4 hour after SCI (×200)
图5 A组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 5 The photomicrograph of group A showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI (×200)
图6 D组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 6 The photomicrograph of group D showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI(×200)
3 讨论
SCI分为原发性损伤与继发性损伤。原发性损伤包括机械压迫、出血；继发性损害包括水肿、炎症反应、局部缺血、谷氨酸受体过度激活、钙离子溢出及过氧化作用等。在原发性损伤后较长一段时间内起作用的是一种细胞和分子水平的主动调节过程，具有可逆性。继发性损害可加重原发损伤，造成脊髓功能障碍，致机体全瘫或不全瘫[5]。众所周知，严重的SCI能触发一系列生化和代谢改变，它们从灰质向白质放射状展开，常引起不可逆转的损害。我们通过HE染色切片可见，SCI后病理改变从开始的灰质中出现出血灶及神经元细胞的变性到白质中出现出血灶及胶质细胞的增生、空泡的形成，与以上观点是吻合的。细胞死亡方式有两种，即坏死和凋亡。凋亡在SCI中的作用已被证明[6]。近年来，SCI后细胞凋亡所起的作用逐渐被认识，凋亡可以促进损伤区的继发性变性，可以使损伤区的传导束脱髓鞘。到目前为止，对原发性SCI尚无有效的治疗方法，仅依靠外科手术是不够的。继发性损害可加重原发性损伤，那么，对细胞凋亡进行积极控制有可能成为减轻SCI的有效途径之一。据认为，CD95分子在SCI后呈特异性表达，是反映SCI的客观指标之一。我们的实验表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在SCI后8h达到高峰，在白质中48h达到高峰，而D组的细胞凋亡数一直处于较低水平，虽然在SCI后8 h及48h有高峰，但较A 组明显减少(P<0.01)。通过实验可见细胞凋亡数由开始的灰质中出现到增多，而后白质中出现到增多，同时灰质中减少。最后灰白质中完全消失，这与中心性脊髓坏死的发展相一致。Gale评分及斜板试验表明D组神经功能有明显改善，切片HE染色可见灰质中央点状出血灶，神经元胞核清晰，较A组的病理变化明显减轻；CD95阳性表达细胞数亦较A组少；由此可见SCI后脊髓组织病理变化轻和细胞凋亡的减少及神经功能的恢复相一致。
激素类制剂在20世纪60年代开始应用于SCI的治疗，主要是因为激素能减轻SCI后的继发水肿。近年来研究认为，MP具有多方面的神经保护作用：(1)改善微循环，抑制脂质过氧化反应，减轻外伤后神经细胞的变性[7]；(2)减少细胞钙内流[8]；(3)维持神经元的兴奋性。
表3 大鼠SCI后不同时程CD95免疫反应阳性细胞数(略)
GM1是目前公认的一种谷氨酸受体拮抗剂[9]。其作用机制包括：(1)抗神经毒性作用，通过抑制谷氨酸NMDA受体介导的大量钙离子内流，从而防止细胞内钙离子超载所继发的一系列病理生理过程[10]；(2)神经营养作用，神经生长因子能维持神经元的存活和功能，对神经元具有营养作用，能够阻断神经元病理损害过程，明显促进神经组织再生[11]；(3)维持神经细胞膜线粒体的结构和功能，改善神经组织缺血缺氧，调节神经递质，改善神经传导速度[12]。
MP与GM1联合治疗SCI的可能机制是：(1)减轻组织细胞水肿。水肿是细胞损害后较早出现的一种表现，有效控制水肿对阻止病情发展意义重大。MP能拮抗抗利尿激素，减少远曲小管和集合管对水的重吸收，促使水的排出，从而减轻组织水肿。GM1 是通过恢复和活跃细胞膜Na+ K+ATP酶的活性，把大量的细胞内Na+逆浓度差转运出细胞膜外，减少钠水潴溜，从而减少细胞内水的含量，有效减轻细胞内水肿。本实验表明，在光镜下见D组SCI有轻度水肿，由此可见，联合用药能明显减轻组织细胞水肿。(2)抑制钙离子内流。由于细胞内的钙离子超载可导致神经细胞的损伤，促使细胞凋亡，因此，联合用药有利于阻止钙离子内流。(3)修复损伤的神经细胞。GM1是位于细胞膜表面的糖鞘脂，在中枢神经尤为丰富。动物试验表明GM1能通过血脑屏障，在神经损伤区含量最高，与损伤区的神经组织和神经细胞有高度的亲和力，并通过稳定膜结构与功能发挥作用[13]。因此，联合应用MP与GM1能有效阻止神经细胞的凋亡并促使损伤神经细胞的恢复。
本实验表明，A组凋亡发生早，且在SCI后8h及48h，CD95阳性细胞数达到高峰，而D组CD95阳性细胞数一直处于较低的水平，虽然在SCI后8h及48h亦有高峰，但较A组明显减少，可见MP加GM1治疗SCI具有较好的疗效，说明在SCI早期应用MP加GM1治疗，可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用，并能促进神经功能的恢复。
[参考文献]
[1] RINK A， FUNG K M， TROJANOWSKI J Q， et al. Evidences of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injure in the rat [J]. Am J Pathol， 1995， 147: 15751583.
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[4]廖经武，宋跃明.大剂量维生素C与小剂量甲基强的松龙联合治疗大鼠急性脊髓损伤初步研究[J].中国脊柱脊髓杂志，2004，14(5)：287289.
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[8]YOUNG W， FLAMM E S. Effect of highdose corticosteroid therapy on blood flow, evoked potentials， and extracellular calcium in experiment spinal injury [J]. J Neurosurg， 1982,57(5): 667673.
[9]GERNDT S J, RODRIGUEZ J L, PAWLI J W, et al. Consequences of highdose steroid therapy for acute spinal cord injury [J]. J Trauma, 1997, 42: 22792284.
[10]MANEV H， COSTA E， WROBLEWSKI J T, et al. Abusive stimulation of excitatory amino acid receptors， a strategy to limit neurotoxicity [J].FASEB J， 1990， 4(10): 27892797.
[11]BAUMGARTNER W A， REDMOND J M, ZEHR K J, et al. The role of the monosialoganglioside, GM1 as a neuroprotectant in an experimental model of cardiopulmonary bypass and hypothermic circulatory arrest [J]. Ann N Y Acad Sci，1998，845: 382390.
[12]姚一，黄民权，陈长才.谷氨酸受体过度激活拮抗剂神经节苷脂GM1[J]. 国外医学脑血管病分册，2001，9(1)：3637.
[13]WEIRICH S D, COTLER H B, NARAYANA P A, et al. Histopathologic correlation of magnetic resonance imaging signal patterns in spinal cord injury model [J]. Spine,1990， 15(7):630638.
[收稿日期]20051008
东南大学医学院附属徐州医院骨科，江苏 徐州 221009
东南大学附属中大医院骨科，江苏 南京 210009
[基金项目]江苏省卫生厅奥赛康科研基金资助项目(P200503)
[摘要]
目的：研究甲泼尼龙(MP)加神经节苷脂(GM1)对大鼠脊髓损伤(SCI)的疗效。方法：采用Allen’s法制备SCI大鼠模型。将模型大鼠随机分为4组，A组为生理盐水对照组，B组为MP治疗组，C组为GM1治疗组，D组为MP加GM1联合治疗组。大鼠存活不同时间后分别行行为学观察再处死，取伤段脊髓作石蜡切片，行HE染色和CD95单克隆抗体免疫组化检测。结果：HE染色显示脊髓组织病理学改变B、C、D组明显轻于A组，而D组较B、C组轻。伤后2周行为学指标优差依次为DCBA(P<0.05)。免疫组化检测表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在8 h达到高峰，在白质中48 h时达到高峰，而D组虽有高峰，但明显少于A组(P<0.01)，D组也少于B、C组(P<0.01)。结论：MP与GM1联合应用可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用并可促进神经功能的恢复。
[关键词]甲泼尼龙；神经节苷脂；脊髓损伤；大鼠
[中图分类号]R651.2
Influence of methylprednisolone and ganglioside on the CD95 expression of rats’injured spinal cord
HUANG Jianhua1， WU Xiaotao2 ，YANG Qing 1 , MA Chuanxue1， FENG Qiang1, XU Ronghua1
(1. Department of Orthopaedics, Xuzhou Hospital Affiliated to the Medical College， Southeast University， Xuzhou 221009， China ; 2. Department of Orthopaedics， Zhongda Hospital， Southeast University， Nanjing 210009， China )
Abstract：Objective To investigate the curative effect of methylprednisolone (MP)and ganglioside(GM1) on rats’ spinal cord injury. Methods Preparing rats with spinal cord injury by resorting to Allen’s mode and then dividing them into four groups at random: group A (control), group B ( with MP )， group C (with GM1 ) and Group D ( with MP and GM1 ). After different periods of surviving time, behavior of different rat was observed respectively and detected by Hemetoxylin staining and CD95 monoclonal antibody immunohistochemistry. Results In injured spinal cord，the pathological changes of group B, C and D were less obvious than that of group A, while group D was less obvious than group B and C. After two weeks of the injury, the order from superiority to inferiority of the behavioral index was DCBA (P<0.05,respectively). The immunohistochemical studies showed that in group A, the number of the CD95 immunostained positive cells in gray matter peaked after 8 hours, and in white matter it peaked after 48 hours. However, although group D had its peak, it was obviously less than group A (P<0.01), and also less than group B and C (P<0.01). Conclusion The combined application of MP and GM1 can stop the apoptosis of nerve cells, provide adequate protection for injured spinal cord and enhance the recovery of nerve functions.
Key words：methylprednisolone; ganglioside; spinal cord injury; rats
脊髓损伤(SCI)的病理机制非常复杂，分为原发性损伤和继发性损伤。继发性损伤中，血管痉挛、血栓形成、微循环障碍、水肿、自由基形成、兴奋性氨基酸生成、Ca2+内流超载等因素的综合作用导致了细胞的死亡。目前认为细胞调亡可能是细胞死亡的另外一种重要形式[1]。CD95是一种跨膜糖蛋白，它可与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)样配体结合诱导细胞凋亡，在SCI早期就有表达，伤后30min在脊髓后角的神经元上有阳性表达，而且特异性强，正常脊髓没有发现CD95免疫组化的阳性表达[2]。本实验旨在观察SCI后应用甲泼尼龙(methylprednisolone,MP)加神经节苷脂(ganglioside,GM1)对CD95表达的影响，从而了解MP联合GM1用药的疗效。
1 材料与方法
1.1 材料
SD大鼠185只，体重200～300g，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供。CD95单克隆抗体(兔抗大鼠)购于北京中杉生物技术有限公司，MP购于法玛西亚普强有限公司，GM1购于齐鲁制药有限公司，其他辅助用溶剂均来源于徐州医学院病理实验室。
1.2 方法
1.2.1 SCI动物模型的制作与分组
大鼠用0.3%戊巴比妥1ml·(100mg)-1腹腔内注射麻醉，消毒，手术显露T9～11脊髓,在骨窗上将5mm×3mm×1mm的硬质塑料片平放在脊髓上作为打击垫片，用直径为2mm、重量为10g的钢棒沿带有刻度的玻璃导管从50mm高度垂直自由下落，造成SCI模型，打击后迅速移开打击钢棒，立即可观察到大鼠尾巴痉挛性左右摆动，即视为造模成功。将模型大鼠随机分为4组：A组(对照组,n=45)术后15 min给生理盐水1ml；B组(MP治疗组,n=45)予MP 30mg·kg-1 腹腔内注射,1h后按5.4mg·(kg·h)-1计算23 h药量，分3次给药；C组(GM1治疗组,n=45)予GM1 10mg·kg-1 腹腔内注射；D组(MP加GM1治疗组,n=45) MP和GM1剂量同B、C组。在SCI后1、4、8、12、24、48、72h及1、2周9个时间点分别观察斜板试验角度，随后处死大鼠，取伤段脊髓，放入10%中性甲醛溶液中固定24h，经脱水、石蜡包埋后切成4μm厚的切片，进行病理学观察。
1.2.2 HE染色
(1)将做好的切片按以下顺序脱蜡：二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)；脱过蜡的切片再按以下顺序用乙醇洗去二甲苯：无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→80%乙醇→蒸馏水。(2)苏木素中浸泡5min，用蒸馏水冲洗，放入盐酸乙醇中浸泡20s，用蒸馏水冲洗，再放入蒸馏水中浸泡15min。(3)伊红染色1min，依次在75%、80%、95%及无水乙醇中浸泡1min。(4)用中性树脂封片，晾干。
1.2.3 免疫组化检测(PV9000通用型二步法)
将切片放入二甲苯中脱蜡；在无水、95%、80%乙醇中依次浸泡1min。用3%H2O2室温孵育5min，消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水洗3遍，浸入0.01mol·L-1 PBS缓冲液(pH 7.2)中2～3min；将切片浸入PBS缓冲液中，放入医用微波炉中加热，210s 后液体即可沸腾，间断微波加热，使温度维持在90℃以上，持续20min，再室温冷却30min，使其有充足时间进行抗原修复；滴加CD95(1∶50)，室温保温盒中作用120min，PBS液洗涤3次，每次2min。滴加第二抗体(poly peroxidaseantimouse IgG,)，室温保温盒中作用30min，PBS液荡洗3次，每次2min；DAB显色；苏木素复染。阳性对照采用扁桃体组织。
1.2.4 行为学检测
(1)斜板试验[3]：以Molt斜板测量动物在斜板上维持5s不下滑的最大角度。(2)Gale评分：0分，双后肢肌力为0级，感觉消失；1分，针刺有保护反应，有感觉存在，但无自主运动；2分，双后肢有轻微运动，但无功能，不能负重；3分，双后肢明显运动，但不能负重行走；4分，能负重行走数步，但不稳定，不持久；5分，能缓慢行走，但有一定缺陷，不灵活；6分，可正常行走[4]。
1.3 统计学处理
采用数字图像处理软件系统统计阳性细胞数。所有数据均为计量资料(±s),从每个实验动物损伤区的切片中随机选取3个部分,记录阳性细胞在灰白质中的总数，求出平均数。依次记录不同时间点切片的CD95阳性细胞数，阳性细胞数在各组的差异采用q检验，统计分析使用SPSS 11.5 for Windows 统计软件，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 行为学检测(斜板试验)结果
选5只正常大鼠，测得其斜板最大角度为(60.80±2.28)°，各组SCI后不同时间斜板最大角度的比较见表1。
2.2 Gale 评分结果
见表2。
表1 各组SCI后不同时间斜板最大角度(略)
表2 各时间段Gale 评分结果(略)
元变性；8h时B组白质中有出血灶，但结构清晰，C组灰质中神经元结构完整，胞核清晰；12～24h时两组灰质中虽有出血灶，但周边神经元结构完整，核及胞浆清晰；3～14d时两组灰质中可见增生胶质细胞，灰质边缘有神经元细胞，结构完整,但B组灰质中神经元轻度变性。D组：1～4h时灰质中央有点状出血，神经元数目较多，形态尚完整，胞核清晰(图3)；8h时神经元胞膜完整，核固缩，白质结构相对清晰；12～24h时灰质边缘神经元结构完整，核仁清晰；2～14d时神经元结构完整，胞核清晰，胶质细胞增生。
图1 A组SCI后 1h HE×400(略)
Fig 1 The photomicrograph of group A showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图2 C组SCI后1h HE×400(略)
Fig 2 The photomicrograph of group C showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图3 D组SCI后1h HE×400(略)
Fig 4 The photomicrograph of group D showing pathological change 1 hour
after SCI (HE×400)
2.4 免疫组化检测CD95表达情况
免疫组化检测显示，在阴性对照组(假手术组)没有发现CD95的阳性表达。SCI 1h，在脊髓灰质前、后角的神经元和胶质细胞上有阳性表达(细胞膜和细胞浆可见棕黄色)，但在白质中未见阳性表达；SCI 4h在灰质中可见强阳性表达，白质中有少量阳性细胞的表达(图4)；SCI 8h灰质中神经元细胞和胶质细胞CD95阳性表达明显增加，白质中胶质细胞CD95阳性表达也增加，并且达到最高峰(图5)；SCI 24～72h CD95阳性表达细胞为圆形有致密黑核的胶质细胞；SCI 1周后灰质中CD95阳性表达细胞甚少，CD95阳性表达细胞主要集中在白质中；SCI 2周后白质中CD95阳性表达很少。联合应用MP与GM1后CD95阳性表达细胞在各个时间点都比A组明显减少(图6)；在SCI 8h后虽然CD95阳性表达细胞数达到高峰，但较A组明显降低(P<0.01)；D组CD95阳性表达细胞数较B、C两组亦有减少(P<0.01)；在SCI 48h后白质中CD95阳性表达细胞数达到高峰，以胶质细胞为主，而阳性表达的神经元逐渐减少；SCI 2周时灰白质阳性表达细胞数基本消失。见表3。
图4 A组SCI后4h 免疫组化×200(略)
Fig 4 The photomicrograph of group Ashowing immunohistochemical expression of CD95 4 hour after SCI (×200)
图5 A组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 5 The photomicrograph of group A showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI (×200)
图6 D组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 6 The photomicrograph of group D showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI(×200)
3 讨论
SCI分为原发性损伤与继发性损伤。原发性损伤包括机械压迫、出血；继发性损害包括水肿、炎症反应、局部缺血、谷氨酸受体过度激活、钙离子溢出及过氧化作用等。在原发性损伤后较长一段时间内起作用的是一种细胞和分子水平的主动调节过程，具有可逆性。继发性损害可加重原发损伤，造成脊髓功能障碍，致机体全瘫或不全瘫[5]。众所周知，严重的SCI能触发一系列生化和代谢改变，它们从灰质向白质放射状展开，常引起不可逆转的损害。我们通过HE染色切片可见，SCI后病理改变从开始的灰质中出现出血灶及神经元细胞的变性到白质中出现出血灶及胶质细胞的增生、空泡的形成，与以上观点是吻合的。细胞死亡方式有两种，即坏死和凋亡。凋亡在SCI中的作用已被证明[6]。近年来，SCI后细胞凋亡所起的作用逐渐被认识，凋亡可以促进损伤区的继发性变性，可以使损伤区的传导束脱髓鞘。到目前为止，对原发性SCI尚无有效的治疗方法，仅依靠外科手术是不够的。继发性损害可加重原发性损伤，那么，对细胞凋亡进行积极控制有可能成为减轻SCI的有效途径之一。据认为，CD95分子在SCI后呈特异性表达，是反映SCI的客观指标之一。我们的实验表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在SCI后8h达到高峰，在白质中48h达到高峰，而D组的细胞凋亡数一直处于较低水平，虽然在SCI后8 h及48h有高峰，但较A 组明显减少(P<0.01)。通过实验可见细胞凋亡数由开始的灰质中出现到增多，而后白质中出现到增多，同时灰质中减少。最后灰白质中完全消失，这与中心性脊髓坏死的发展相一致。Gale评分及斜板试验表明D组神经功能有明显改善，切片HE染色可见灰质中央点状出血灶，神经元胞核清晰，较A组的病理变化明显减轻；CD95阳性表达细胞数亦较A组少；由此可见SCI后脊髓组织病理变化轻和细胞凋亡的减少及神经功能的恢复相一致。
激素类制剂在20世纪60年代开始应用于SCI的治疗，主要是因为激素能减轻SCI后的继发水肿。近年来研究认为，MP具有多方面的神经保护作用：(1)改善微循环，抑制脂质过氧化反应，减轻外伤后神经细胞的变性[7]；(2)减少细胞钙内流[8]；(3)维持神经元的兴奋性。
表3 大鼠SCI后不同时程CD95免疫反应阳性细胞数(略)
GM1是目前公认的一种谷氨酸受体拮抗剂[9]。其作用机制包括：(1)抗神经毒性作用，通过抑制谷氨酸NMDA受体介导的大量钙离子内流，从而防止细胞内钙离子超载所继发的一系列病理生理过程[10]；(2)神经营养作用，神经生长因子能维持神经元的存活和功能，对神经元具有营养作用，能够阻断神经元病理损害过程，明显促进神经组织再生[11]；(3)维持神经细胞膜线粒体的结构和功能，改善神经组织缺血缺氧，调节神经递质，改善神经传导速度[12]。
MP与GM1联合治疗SCI的可能机制是：(1)减轻组织细胞水肿。水肿是细胞损害后较早出现的一种表现，有效控制水肿对阻止病情发展意义重大。MP能拮抗抗利尿激素，减少远曲小管和集合管对水的重吸收，促使水的排出，从而减轻组织水肿。GM1 是通过恢复和活跃细胞膜Na+ K+ATP酶的活性，把大量的细胞内Na+逆浓度差转运出细胞膜外，减少钠水潴溜，从而减少细胞内水的含量，有效减轻细胞内水肿。本实验表明，在光镜下见D组SCI有轻度水肿，由此可见，联合用药能明显减轻组织细胞水肿。(2)抑制钙离子内流。由于细胞内的钙离子超载可导致神经细胞的损伤，促使细胞凋亡，因此，联合用药有利于阻止钙离子内流。(3)修复损伤的神经细胞。GM1是位于细胞膜表面的糖鞘脂，在中枢神经尤为丰富。动物试验表明GM1能通过血脑屏障，在神经损伤区含量最高，与损伤区的神经组织和神经细胞有高度的亲和力，并通过稳定膜结构与功能发挥作用[13]。因此，联合应用MP与GM1能有效阻止神经细胞的凋亡并促使损伤神经细胞的恢复。
本实验表明，A组凋亡发生早，且在SCI后8h及48h，CD95阳性细胞数达到高峰，而D组CD95阳性细胞数一直处于较低的水平，虽然在SCI后8h及48h亦有高峰，但较A组明显减少，可见MP加GM1治疗SCI具有较好的疗效，说明在SCI早期应用MP加GM1治疗，可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用，并能促进神经功能的恢复。
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[11]BAUMGARTNER W A， REDMOND J M, ZEHR K J, et al. The role of the monosialoganglioside, GM1 as a neuroprotectant in an experimental model of cardiopulmonary bypass and hypothermic circulatory arrest [J]. Ann N Y Acad Sci，1998，845: 382390.
[12]姚一，黄民权，陈长才.谷氨酸受体过度激活拮抗剂神经节苷脂GM1[J]. 国外医学脑血管病分册，2001，9(1)：3637.
[13]WEIRICH S D, COTLER H B, NARAYANA P A, et al. Histopathologic correlation of magnetic resonance imaging signal patterns in spinal cord injury model [J]. Spine,1990， 15(7):630638.
[收稿日期]20051008
东南大学医学院附属徐州医院骨科，江苏 徐州 221009
东南大学附属中大医院骨科，江苏 南京 210009
[基金项目]江苏省卫生厅奥赛康科研基金资助项目(P200503)
[摘要]
目的：研究甲泼尼龙(MP)加神经节苷脂(GM1)对大鼠脊髓损伤(SCI)的疗效。方法：采用Allen’s法制备SCI大鼠模型。将模型大鼠随机分为4组，A组为生理盐水对照组，B组为MP治疗组，C组为GM1治疗组，D组为MP加GM1联合治疗组。大鼠存活不同时间后分别行行为学观察再处死，取伤段脊髓作石蜡切片，行HE染色和CD95单克隆抗体免疫组化检测。结果：HE染色显示脊髓组织病理学改变B、C、D组明显轻于A组，而D组较B、C组轻。伤后2周行为学指标优差依次为DCBA(P<0.05)。免疫组化检测表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在8 h达到高峰，在白质中48 h时达到高峰，而D组虽有高峰，但明显少于A组(P<0.01)，D组也少于B、C组(P<0.01)。结论：MP与GM1联合应用可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用并可促进神经功能的恢复。
[关键词]甲泼尼龙；神经节苷脂；脊髓损伤；大鼠
[中图分类号]R651.2
Influence of methylprednisolone and ganglioside on the CD95 expression of rats’injured spinal cord
HUANG Jianhua1， WU Xiaotao2 ，YANG Qing 1 , MA Chuanxue1， FENG Qiang1, XU Ronghua1
(1. Department of Orthopaedics, Xuzhou Hospital Affiliated to the Medical College， Southeast University， Xuzhou 221009， China ; 2. Department of Orthopaedics， Zhongda Hospital， Southeast University， Nanjing 210009， China )
Abstract：Objective To investigate the curative effect of methylprednisolone (MP)and ganglioside(GM1) on rats’ spinal cord injury. Methods Preparing rats with spinal cord injury by resorting to Allen’s mode and then dividing them into four groups at random: group A (control), group B ( with MP )， group C (with GM1 ) and Group D ( with MP and GM1 ). After different periods of surviving time, behavior of different rat was observed respectively and detected by Hemetoxylin staining and CD95 monoclonal antibody immunohistochemistry. Results In injured spinal cord，the pathological changes of group B, C and D were less obvious than that of group A, while group D was less obvious than group B and C. After two weeks of the injury, the order from superiority to inferiority of the behavioral index was DCBA (P<0.05,respectively). The immunohistochemical studies showed that in group A, the number of the CD95 immunostained positive cells in gray matter peaked after 8 hours, and in white matter it peaked after 48 hours. However, although group D had its peak, it was obviously less than group A (P<0.01), and also less than group B and C (P<0.01). Conclusion The combined application of MP and GM1 can stop the apoptosis of nerve cells, provide adequate protection for injured spinal cord and enhance the recovery of nerve functions.
Key words：methylprednisolone; ganglioside; spinal cord injury; rats
脊髓损伤(SCI)的病理机制非常复杂，分为原发性损伤和继发性损伤。继发性损伤中，血管痉挛、血栓形成、微循环障碍、水肿、自由基形成、兴奋性氨基酸生成、Ca2+内流超载等因素的综合作用导致了细胞的死亡。目前认为细胞调亡可能是细胞死亡的另外一种重要形式[1]。CD95是一种跨膜糖蛋白，它可与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)样配体结合诱导细胞凋亡，在SCI早期就有表达，伤后30min在脊髓后角的神经元上有阳性表达，而且特异性强，正常脊髓没有发现CD95免疫组化的阳性表达[2]。本实验旨在观察SCI后应用甲泼尼龙(methylprednisolone,MP)加神经节苷脂(ganglioside,GM1)对CD95表达的影响，从而了解MP联合GM1用药的疗效。
1 材料与方法
1.1 材料
SD大鼠185只，体重200～300g，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供。CD95单克隆抗体(兔抗大鼠)购于北京中杉生物技术有限公司，MP购于法玛西亚普强有限公司，GM1购于齐鲁制药有限公司，其他辅助用溶剂均来源于徐州医学院病理实验室。
1.2 方法
1.2.1 SCI动物模型的制作与分组
大鼠用0.3%戊巴比妥1ml·(100mg)-1腹腔内注射麻醉，消毒，手术显露T9～11脊髓,在骨窗上将5mm×3mm×1mm的硬质塑料片平放在脊髓上作为打击垫片，用直径为2mm、重量为10g的钢棒沿带有刻度的玻璃导管从50mm高度垂直自由下落，造成SCI模型，打击后迅速移开打击钢棒，立即可观察到大鼠尾巴痉挛性左右摆动，即视为造模成功。将模型大鼠随机分为4组：A组(对照组,n=45)术后15 min给生理盐水1ml；B组(MP治疗组,n=45)予MP 30mg·kg-1 腹腔内注射,1h后按5.4mg·(kg·h)-1计算23 h药量，分3次给药；C组(GM1治疗组,n=45)予GM1 10mg·kg-1 腹腔内注射；D组(MP加GM1治疗组,n=45) MP和GM1剂量同B、C组。在SCI后1、4、8、12、24、48、72h及1、2周9个时间点分别观察斜板试验角度，随后处死大鼠，取伤段脊髓，放入10%中性甲醛溶液中固定24h，经脱水、石蜡包埋后切成4μm厚的切片，进行病理学观察。
1.2.2 HE染色
(1)将做好的切片按以下顺序脱蜡：二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)；脱过蜡的切片再按以下顺序用乙醇洗去二甲苯：无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→80%乙醇→蒸馏水。(2)苏木素中浸泡5min，用蒸馏水冲洗，放入盐酸乙醇中浸泡20s，用蒸馏水冲洗，再放入蒸馏水中浸泡15min。(3)伊红染色1min，依次在75%、80%、95%及无水乙醇中浸泡1min。(4)用中性树脂封片，晾干。
1.2.3 免疫组化检测(PV9000通用型二步法)
将切片放入二甲苯中脱蜡；在无水、95%、80%乙醇中依次浸泡1min。用3%H2O2室温孵育5min，消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水洗3遍，浸入0.01mol·L-1 PBS缓冲液(pH 7.2)中2～3min；将切片浸入PBS缓冲液中，放入医用微波炉中加热，210s 后液体即可沸腾，间断微波加热，使温度维持在90℃以上，持续20min，再室温冷却30min，使其有充足时间进行抗原修复；滴加CD95(1∶50)，室温保温盒中作用120min，PBS液洗涤3次，每次2min。滴加第二抗体(poly peroxidaseantimouse IgG,)，室温保温盒中作用30min，PBS液荡洗3次，每次2min；DAB显色；苏木素复染。阳性对照采用扁桃体组织。
1.2.4 行为学检测
(1)斜板试验[3]：以Molt斜板测量动物在斜板上维持5s不下滑的最大角度。(2)Gale评分：0分，双后肢肌力为0级，感觉消失；1分，针刺有保护反应，有感觉存在，但无自主运动；2分，双后肢有轻微运动，但无功能，不能负重；3分，双后肢明显运动，但不能负重行走；4分，能负重行走数步，但不稳定，不持久；5分，能缓慢行走，但有一定缺陷，不灵活；6分，可正常行走[4]。
1.3 统计学处理
采用数字图像处理软件系统统计阳性细胞数。所有数据均为计量资料(±s),从每个实验动物损伤区的切片中随机选取3个部分,记录阳性细胞在灰白质中的总数，求出平均数。依次记录不同时间点切片的CD95阳性细胞数，阳性细胞数在各组的差异采用q检验，统计分析使用SPSS 11.5 for Windows 统计软件，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 行为学检测(斜板试验)结果
选5只正常大鼠，测得其斜板最大角度为(60.80±2.28)°，各组SCI后不同时间斜板最大角度的比较见表1。
2.2 Gale 评分结果
见表2。
表1 各组SCI后不同时间斜板最大角度(略)
表2 各时间段Gale 评分结果(略)
元变性；8h时B组白质中有出血灶，但结构清晰，C组灰质中神经元结构完整，胞核清晰；12～24h时两组灰质中虽有出血灶，但周边神经元结构完整，核及胞浆清晰；3～14d时两组灰质中可见增生胶质细胞，灰质边缘有神经元细胞，结构完整,但B组灰质中神经元轻度变性。D组：1～4h时灰质中央有点状出血，神经元数目较多，形态尚完整，胞核清晰(图3)；8h时神经元胞膜完整，核固缩，白质结构相对清晰；12～24h时灰质边缘神经元结构完整，核仁清晰；2～14d时神经元结构完整，胞核清晰，胶质细胞增生。
图1 A组SCI后 1h HE×400(略)
Fig 1 The photomicrograph of group A showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图2 C组SCI后1h HE×400(略)
Fig 2 The photomicrograph of group C showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图3 D组SCI后1h HE×400(略)
Fig 4 The photomicrograph of group D showing pathological change 1 hour
after SCI (HE×400)
2.4 免疫组化检测CD95表达情况
免疫组化检测显示，在阴性对照组(假手术组)没有发现CD95的阳性表达。SCI 1h，在脊髓灰质前、后角的神经元和胶质细胞上有阳性表达(细胞膜和细胞浆可见棕黄色)，但在白质中未见阳性表达；SCI 4h在灰质中可见强阳性表达，白质中有少量阳性细胞的表达(图4)；SCI 8h灰质中神经元细胞和胶质细胞CD95阳性表达明显增加，白质中胶质细胞CD95阳性表达也增加，并且达到最高峰(图5)；SCI 24～72h CD95阳性表达细胞为圆形有致密黑核的胶质细胞；SCI 1周后灰质中CD95阳性表达细胞甚少，CD95阳性表达细胞主要集中在白质中；SCI 2周后白质中CD95阳性表达很少。联合应用MP与GM1后CD95阳性表达细胞在各个时间点都比A组明显减少(图6)；在SCI 8h后虽然CD95阳性表达细胞数达到高峰，但较A组明显降低(P<0.01)；D组CD95阳性表达细胞数较B、C两组亦有减少(P<0.01)；在SCI 48h后白质中CD95阳性表达细胞数达到高峰，以胶质细胞为主，而阳性表达的神经元逐渐减少；SCI 2周时灰白质阳性表达细胞数基本消失。见表3。
图4 A组SCI后4h 免疫组化×200(略)
Fig 4 The photomicrograph of group Ashowing immunohistochemical expression of CD95 4 hour after SCI (×200)
图5 A组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 5 The photomicrograph of group A showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI (×200)
图6 D组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 6 The photomicrograph of group D showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI(×200)
3 讨论
SCI分为原发性损伤与继发性损伤。原发性损伤包括机械压迫、出血；继发性损害包括水肿、炎症反应、局部缺血、谷氨酸受体过度激活、钙离子溢出及过氧化作用等。在原发性损伤后较长一段时间内起作用的是一种细胞和分子水平的主动调节过程，具有可逆性。继发性损害可加重原发损伤，造成脊髓功能障碍，致机体全瘫或不全瘫[5]。众所周知，严重的SCI能触发一系列生化和代谢改变，它们从灰质向白质放射状展开，常引起不可逆转的损害。我们通过HE染色切片可见，SCI后病理改变从开始的灰质中出现出血灶及神经元细胞的变性到白质中出现出血灶及胶质细胞的增生、空泡的形成，与以上观点是吻合的。细胞死亡方式有两种，即坏死和凋亡。凋亡在SCI中的作用已被证明[6]。近年来，SCI后细胞凋亡所起的作用逐渐被认识，凋亡可以促进损伤区的继发性变性，可以使损伤区的传导束脱髓鞘。到目前为止，对原发性SCI尚无有效的治疗方法，仅依靠外科手术是不够的。继发性损害可加重原发性损伤，那么，对细胞凋亡进行积极控制有可能成为减轻SCI的有效途径之一。据认为，CD95分子在SCI后呈特异性表达，是反映SCI的客观指标之一。我们的实验表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在SCI后8h达到高峰，在白质中48h达到高峰，而D组的细胞凋亡数一直处于较低水平，虽然在SCI后8 h及48h有高峰，但较A 组明显减少(P<0.01)。通过实验可见细胞凋亡数由开始的灰质中出现到增多，而后白质中出现到增多，同时灰质中减少。最后灰白质中完全消失，这与中心性脊髓坏死的发展相一致。Gale评分及斜板试验表明D组神经功能有明显改善，切片HE染色可见灰质中央点状出血灶，神经元胞核清晰，较A组的病理变化明显减轻；CD95阳性表达细胞数亦较A组少；由此可见SCI后脊髓组织病理变化轻和细胞凋亡的减少及神经功能的恢复相一致。
激素类制剂在20世纪60年代开始应用于SCI的治疗，主要是因为激素能减轻SCI后的继发水肿。近年来研究认为，MP具有多方面的神经保护作用：(1)改善微循环，抑制脂质过氧化反应，减轻外伤后神经细胞的变性[7]；(2)减少细胞钙内流[8]；(3)维持神经元的兴奋性。
表3 大鼠SCI后不同时程CD95免疫反应阳性细胞数(略)
GM1是目前公认的一种谷氨酸受体拮抗剂[9]。其作用机制包括：(1)抗神经毒性作用，通过抑制谷氨酸NMDA受体介导的大量钙离子内流，从而防止细胞内钙离子超载所继发的一系列病理生理过程[10]；(2)神经营养作用，神经生长因子能维持神经元的存活和功能，对神经元具有营养作用，能够阻断神经元病理损害过程，明显促进神经组织再生[11]；(3)维持神经细胞膜线粒体的结构和功能，改善神经组织缺血缺氧，调节神经递质，改善神经传导速度[12]。
MP与GM1联合治疗SCI的可能机制是：(1)减轻组织细胞水肿。水肿是细胞损害后较早出现的一种表现，有效控制水肿对阻止病情发展意义重大。MP能拮抗抗利尿激素，减少远曲小管和集合管对水的重吸收，促使水的排出，从而减轻组织水肿。GM1 是通过恢复和活跃细胞膜Na+ K+ATP酶的活性，把大量的细胞内Na+逆浓度差转运出细胞膜外，减少钠水潴溜，从而减少细胞内水的含量，有效减轻细胞内水肿。本实验表明，在光镜下见D组SCI有轻度水肿，由此可见，联合用药能明显减轻组织细胞水肿。(2)抑制钙离子内流。由于细胞内的钙离子超载可导致神经细胞的损伤，促使细胞凋亡，因此，联合用药有利于阻止钙离子内流。(3)修复损伤的神经细胞。GM1是位于细胞膜表面的糖鞘脂，在中枢神经尤为丰富。动物试验表明GM1能通过血脑屏障，在神经损伤区含量最高，与损伤区的神经组织和神经细胞有高度的亲和力，并通过稳定膜结构与功能发挥作用[13]。因此，联合应用MP与GM1能有效阻止神经细胞的凋亡并促使损伤神经细胞的恢复。
本实验表明，A组凋亡发生早，且在SCI后8h及48h，CD95阳性细胞数达到高峰，而D组CD95阳性细胞数一直处于较低的水平，虽然在SCI后8h及48h亦有高峰，但较A组明显减少，可见MP加GM1治疗SCI具有较好的疗效，说明在SCI早期应用MP加GM1治疗，可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用，并能促进神经功能的恢复。
[参考文献]
[1] RINK A， FUNG K M， TROJANOWSKI J Q， et al. Evidences of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injure in the rat [J]. Am J Pathol， 1995， 147: 15751583.
[2]ZI Y, FAN G Y, ZHU Y U E, et al. Presence and significance of CD95 expression in rats after spinal cord injury [J]. Chin J Clin Rehabi, 2002, 6(20):30523053.
[3]FEHLINGS M G, TATOR C H. The relationships among the severity of spinal cord injury， residual neurological function， axon counts， and counts of retrogradely labled neurons after experimental spinal cord injury[J].Exp Nurol，1995，132:220228.
[4]廖经武，宋跃明.大剂量维生素C与小剂量甲基强的松龙联合治疗大鼠急性脊髓损伤初步研究[J].中国脊柱脊髓杂志，2004，14(5)：287289.
[5]胥少汀.脊髓损伤[J].中华骨科杂志，1997，17(5)：340343.
[6]O’BRIEN M F, LENKE L G, LOU J, et al. Astrocyte response and transforming growth factorα localization in acute spinal cord injury [J]. Spine, 1994， 19(20): 23212330.
[7]BRAUGHLER J M, HALL E D. Correlation of methylprednisolone levels in cat spinal cord with its effects on Na+K+ATP ase， lipid peroxidation， and alpha motor neuron function [J]. J Neurosurg, 1982， 56(6): 838844.
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[9]GERNDT S J, RODRIGUEZ J L, PAWLI J W, et al. Consequences of highdose steroid therapy for acute spinal cord injury [J]. J Trauma, 1997, 42: 22792284.
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[11]BAUMGARTNER W A， REDMOND J M, ZEHR K J, et al. The role of the monosialoganglioside, GM1 as a neuroprotectant in an experimental model of cardiopulmonary bypass and hypothermic circulatory arrest [J]. Ann N Y Acad Sci，1998，845: 382390.
[12]姚一，黄民权，陈长才.谷氨酸受体过度激活拮抗剂神经节苷脂GM1[J]. 国外医学脑血管病分册，2001，9(1)：3637.
[13]WEIRICH S D, COTLER H B, NARAYANA P A, et al. Histopathologic correlation of magnetic resonance imaging signal patterns in spinal cord injury model [J]. Spine,1990， 15(7):630638.
东南大学医学院附属徐州医院骨科，江苏 徐州 221009
东南大学附属中大医院骨科，江苏 南京 210009
[基金项目]江苏省卫生厅奥赛康科研基金资助项目(P200503), 百拇医药(黄建华,吴小涛 ,杨青,马传学,冯强,徐荣华)
目的：研究甲泼尼龙(MP)加神经节苷脂(GM1)对大鼠脊髓损伤(SCI)的疗效。方法：采用Allen’s法制备SCI大鼠模型。将模型大鼠随机分为4组，A组为生理盐水对照组，B组为MP治疗组，C组为GM1治疗组，D组为MP加GM1联合治疗组。大鼠存活不同时间后分别行行为学观察再处死，取伤段脊髓作石蜡切片，行HE染色和CD95单克隆抗体免疫组化检测。结果：HE染色显示脊髓组织病理学改变B、C、D组明显轻于A组，而D组较B、C组轻。伤后2周行为学指标优差依次为DCBA(P<0.05)。免疫组化检测表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在8 h达到高峰，在白质中48 h时达到高峰，而D组虽有高峰，但明显少于A组(P<0.01)，D组也少于B、C组(P<0.01)。结论：MP与GM1联合应用可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用并可促进神经功能的恢复。
[关键词]甲泼尼龙；神经节苷脂；脊髓损伤；大鼠
[中图分类号]R651.2
Influence of methylprednisolone and ganglioside on the CD95 expression of rats’injured spinal cord
HUANG Jianhua1， WU Xiaotao2 ，YANG Qing 1 , MA Chuanxue1， FENG Qiang1, XU Ronghua1
(1. Department of Orthopaedics, Xuzhou Hospital Affiliated to the Medical College， Southeast University， Xuzhou 221009， China ; 2. Department of Orthopaedics， Zhongda Hospital， Southeast University， Nanjing 210009， China )
Abstract：Objective To investigate the curative effect of methylprednisolone (MP)and ganglioside(GM1) on rats’ spinal cord injury. Methods Preparing rats with spinal cord injury by resorting to Allen’s mode and then dividing them into four groups at random: group A (control), group B ( with MP )， group C (with GM1 ) and Group D ( with MP and GM1 ). After different periods of surviving time, behavior of different rat was observed respectively and detected by Hemetoxylin staining and CD95 monoclonal antibody immunohistochemistry. Results In injured spinal cord，the pathological changes of group B, C and D were less obvious than that of group A, while group D was less obvious than group B and C. After two weeks of the injury, the order from superiority to inferiority of the behavioral index was DCBA (P<0.05,respectively). The immunohistochemical studies showed that in group A, the number of the CD95 immunostained positive cells in gray matter peaked after 8 hours, and in white matter it peaked after 48 hours. However, although group D had its peak, it was obviously less than group A (P<0.01), and also less than group B and C (P<0.01). Conclusion The combined application of MP and GM1 can stop the apoptosis of nerve cells, provide adequate protection for injured spinal cord and enhance the recovery of nerve functions.
Key words：methylprednisolone; ganglioside; spinal cord injury; rats
脊髓损伤(SCI)的病理机制非常复杂，分为原发性损伤和继发性损伤。继发性损伤中，血管痉挛、血栓形成、微循环障碍、水肿、自由基形成、兴奋性氨基酸生成、Ca2+内流超载等因素的综合作用导致了细胞的死亡。目前认为细胞调亡可能是细胞死亡的另外一种重要形式[1]。CD95是一种跨膜糖蛋白，它可与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)样配体结合诱导细胞凋亡，在SCI早期就有表达，伤后30min在脊髓后角的神经元上有阳性表达，而且特异性强，正常脊髓没有发现CD95免疫组化的阳性表达[2]。本实验旨在观察SCI后应用甲泼尼龙(methylprednisolone,MP)加神经节苷脂(ganglioside,GM1)对CD95表达的影响，从而了解MP联合GM1用药的疗效。
1 材料与方法
1.1 材料
SD大鼠185只，体重200～300g，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供。CD95单克隆抗体(兔抗大鼠)购于北京中杉生物技术有限公司，MP购于法玛西亚普强有限公司，GM1购于齐鲁制药有限公司，其他辅助用溶剂均来源于徐州医学院病理实验室。
1.2 方法
1.2.1 SCI动物模型的制作与分组
大鼠用0.3%戊巴比妥1ml·(100mg)-1腹腔内注射麻醉，消毒，手术显露T9～11脊髓,在骨窗上将5mm×3mm×1mm的硬质塑料片平放在脊髓上作为打击垫片，用直径为2mm、重量为10g的钢棒沿带有刻度的玻璃导管从50mm高度垂直自由下落，造成SCI模型，打击后迅速移开打击钢棒，立即可观察到大鼠尾巴痉挛性左右摆动，即视为造模成功。将模型大鼠随机分为4组：A组(对照组,n=45)术后15 min给生理盐水1ml；B组(MP治疗组,n=45)予MP 30mg·kg-1 腹腔内注射,1h后按5.4mg·(kg·h)-1计算23 h药量，分3次给药；C组(GM1治疗组,n=45)予GM1 10mg·kg-1 腹腔内注射；D组(MP加GM1治疗组,n=45) MP和GM1剂量同B、C组。在SCI后1、4、8、12、24、48、72h及1、2周9个时间点分别观察斜板试验角度，随后处死大鼠，取伤段脊髓，放入10%中性甲醛溶液中固定24h，经脱水、石蜡包埋后切成4μm厚的切片，进行病理学观察。
1.2.2 HE染色
(1)将做好的切片按以下顺序脱蜡：二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)；脱过蜡的切片再按以下顺序用乙醇洗去二甲苯：无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→80%乙醇→蒸馏水。(2)苏木素中浸泡5min，用蒸馏水冲洗，放入盐酸乙醇中浸泡20s，用蒸馏水冲洗，再放入蒸馏水中浸泡15min。(3)伊红染色1min，依次在75%、80%、95%及无水乙醇中浸泡1min。(4)用中性树脂封片，晾干。
1.2.3 免疫组化检测(PV9000通用型二步法)
将切片放入二甲苯中脱蜡；在无水、95%、80%乙醇中依次浸泡1min。用3%H2O2室温孵育5min，消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水洗3遍，浸入0.01mol·L-1 PBS缓冲液(pH 7.2)中2～3min；将切片浸入PBS缓冲液中，放入医用微波炉中加热，210s 后液体即可沸腾，间断微波加热，使温度维持在90℃以上，持续20min，再室温冷却30min，使其有充足时间进行抗原修复；滴加CD95(1∶50)，室温保温盒中作用120min，PBS液洗涤3次，每次2min。滴加第二抗体(poly peroxidaseantimouse IgG,)，室温保温盒中作用30min，PBS液荡洗3次，每次2min；DAB显色；苏木素复染。阳性对照采用扁桃体组织。
1.2.4 行为学检测
(1)斜板试验[3]：以Molt斜板测量动物在斜板上维持5s不下滑的最大角度。(2)Gale评分：0分，双后肢肌力为0级，感觉消失；1分，针刺有保护反应，有感觉存在，但无自主运动；2分，双后肢有轻微运动，但无功能，不能负重；3分，双后肢明显运动，但不能负重行走；4分，能负重行走数步，但不稳定，不持久；5分，能缓慢行走，但有一定缺陷，不灵活；6分，可正常行走[4]。
1.3 统计学处理
采用数字图像处理软件系统统计阳性细胞数。所有数据均为计量资料(±s),从每个实验动物损伤区的切片中随机选取3个部分,记录阳性细胞在灰白质中的总数，求出平均数。依次记录不同时间点切片的CD95阳性细胞数，阳性细胞数在各组的差异采用q检验，统计分析使用SPSS 11.5 for Windows 统计软件，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 行为学检测(斜板试验)结果
选5只正常大鼠，测得其斜板最大角度为(60.80±2.28)°，各组SCI后不同时间斜板最大角度的比较见表1。
2.2 Gale 评分结果
见表2。
表1 各组SCI后不同时间斜板最大角度(略)
表2 各时间段Gale 评分结果(略)
元变性；8h时B组白质中有出血灶，但结构清晰，C组灰质中神经元结构完整，胞核清晰；12～24h时两组灰质中虽有出血灶，但周边神经元结构完整，核及胞浆清晰；3～14d时两组灰质中可见增生胶质细胞，灰质边缘有神经元细胞，结构完整,但B组灰质中神经元轻度变性。D组：1～4h时灰质中央有点状出血，神经元数目较多，形态尚完整，胞核清晰(图3)；8h时神经元胞膜完整，核固缩，白质结构相对清晰；12～24h时灰质边缘神经元结构完整，核仁清晰；2～14d时神经元结构完整，胞核清晰，胶质细胞增生。
图1 A组SCI后 1h HE×400(略)
Fig 1 The photomicrograph of group A showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图2 C组SCI后1h HE×400(略)
Fig 2 The photomicrograph of group C showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图3 D组SCI后1h HE×400(略)
Fig 4 The photomicrograph of group D showing pathological change 1 hour
after SCI (HE×400)
2.4 免疫组化检测CD95表达情况
免疫组化检测显示，在阴性对照组(假手术组)没有发现CD95的阳性表达。SCI 1h，在脊髓灰质前、后角的神经元和胶质细胞上有阳性表达(细胞膜和细胞浆可见棕黄色)，但在白质中未见阳性表达；SCI 4h在灰质中可见强阳性表达，白质中有少量阳性细胞的表达(图4)；SCI 8h灰质中神经元细胞和胶质细胞CD95阳性表达明显增加，白质中胶质细胞CD95阳性表达也增加，并且达到最高峰(图5)；SCI 24～72h CD95阳性表达细胞为圆形有致密黑核的胶质细胞；SCI 1周后灰质中CD95阳性表达细胞甚少，CD95阳性表达细胞主要集中在白质中；SCI 2周后白质中CD95阳性表达很少。联合应用MP与GM1后CD95阳性表达细胞在各个时间点都比A组明显减少(图6)；在SCI 8h后虽然CD95阳性表达细胞数达到高峰，但较A组明显降低(P<0.01)；D组CD95阳性表达细胞数较B、C两组亦有减少(P<0.01)；在SCI 48h后白质中CD95阳性表达细胞数达到高峰，以胶质细胞为主，而阳性表达的神经元逐渐减少；SCI 2周时灰白质阳性表达细胞数基本消失。见表3。
图4 A组SCI后4h 免疫组化×200(略)
Fig 4 The photomicrograph of group Ashowing immunohistochemical expression of CD95 4 hour after SCI (×200)
图5 A组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 5 The photomicrograph of group A showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI (×200)
图6 D组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 6 The photomicrograph of group D showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI(×200)
3 讨论
SCI分为原发性损伤与继发性损伤。原发性损伤包括机械压迫、出血；继发性损害包括水肿、炎症反应、局部缺血、谷氨酸受体过度激活、钙离子溢出及过氧化作用等。在原发性损伤后较长一段时间内起作用的是一种细胞和分子水平的主动调节过程，具有可逆性。继发性损害可加重原发损伤，造成脊髓功能障碍，致机体全瘫或不全瘫[5]。众所周知，严重的SCI能触发一系列生化和代谢改变，它们从灰质向白质放射状展开，常引起不可逆转的损害。我们通过HE染色切片可见，SCI后病理改变从开始的灰质中出现出血灶及神经元细胞的变性到白质中出现出血灶及胶质细胞的增生、空泡的形成，与以上观点是吻合的。细胞死亡方式有两种，即坏死和凋亡。凋亡在SCI中的作用已被证明[6]。近年来，SCI后细胞凋亡所起的作用逐渐被认识，凋亡可以促进损伤区的继发性变性，可以使损伤区的传导束脱髓鞘。到目前为止，对原发性SCI尚无有效的治疗方法，仅依靠外科手术是不够的。继发性损害可加重原发性损伤，那么，对细胞凋亡进行积极控制有可能成为减轻SCI的有效途径之一。据认为，CD95分子在SCI后呈特异性表达，是反映SCI的客观指标之一。我们的实验表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在SCI后8h达到高峰，在白质中48h达到高峰，而D组的细胞凋亡数一直处于较低水平，虽然在SCI后8 h及48h有高峰，但较A 组明显减少(P<0.01)。通过实验可见细胞凋亡数由开始的灰质中出现到增多，而后白质中出现到增多，同时灰质中减少。最后灰白质中完全消失，这与中心性脊髓坏死的发展相一致。Gale评分及斜板试验表明D组神经功能有明显改善，切片HE染色可见灰质中央点状出血灶，神经元胞核清晰，较A组的病理变化明显减轻；CD95阳性表达细胞数亦较A组少；由此可见SCI后脊髓组织病理变化轻和细胞凋亡的减少及神经功能的恢复相一致。
激素类制剂在20世纪60年代开始应用于SCI的治疗，主要是因为激素能减轻SCI后的继发水肿。近年来研究认为，MP具有多方面的神经保护作用：(1)改善微循环，抑制脂质过氧化反应，减轻外伤后神经细胞的变性[7]；(2)减少细胞钙内流[8]；(3)维持神经元的兴奋性。
表3 大鼠SCI后不同时程CD95免疫反应阳性细胞数(略)
GM1是目前公认的一种谷氨酸受体拮抗剂[9]。其作用机制包括：(1)抗神经毒性作用，通过抑制谷氨酸NMDA受体介导的大量钙离子内流，从而防止细胞内钙离子超载所继发的一系列病理生理过程[10]；(2)神经营养作用，神经生长因子能维持神经元的存活和功能，对神经元具有营养作用，能够阻断神经元病理损害过程，明显促进神经组织再生[11]；(3)维持神经细胞膜线粒体的结构和功能，改善神经组织缺血缺氧，调节神经递质，改善神经传导速度[12]。
MP与GM1联合治疗SCI的可能机制是：(1)减轻组织细胞水肿。水肿是细胞损害后较早出现的一种表现，有效控制水肿对阻止病情发展意义重大。MP能拮抗抗利尿激素，减少远曲小管和集合管对水的重吸收，促使水的排出，从而减轻组织水肿。GM1 是通过恢复和活跃细胞膜Na+ K+ATP酶的活性，把大量的细胞内Na+逆浓度差转运出细胞膜外，减少钠水潴溜，从而减少细胞内水的含量，有效减轻细胞内水肿。本实验表明，在光镜下见D组SCI有轻度水肿，由此可见，联合用药能明显减轻组织细胞水肿。(2)抑制钙离子内流。由于细胞内的钙离子超载可导致神经细胞的损伤，促使细胞凋亡，因此，联合用药有利于阻止钙离子内流。(3)修复损伤的神经细胞。GM1是位于细胞膜表面的糖鞘脂，在中枢神经尤为丰富。动物试验表明GM1能通过血脑屏障，在神经损伤区含量最高，与损伤区的神经组织和神经细胞有高度的亲和力，并通过稳定膜结构与功能发挥作用[13]。因此，联合应用MP与GM1能有效阻止神经细胞的凋亡并促使损伤神经细胞的恢复。
本实验表明，A组凋亡发生早，且在SCI后8h及48h，CD95阳性细胞数达到高峰，而D组CD95阳性细胞数一直处于较低的水平，虽然在SCI后8h及48h亦有高峰，但较A组明显减少，可见MP加GM1治疗SCI具有较好的疗效，说明在SCI早期应用MP加GM1治疗，可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用，并能促进神经功能的恢复。
[参考文献]
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[4]廖经武，宋跃明.大剂量维生素C与小剂量甲基强的松龙联合治疗大鼠急性脊髓损伤初步研究[J].中国脊柱脊髓杂志，2004，14(5)：287289.
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[12]姚一，黄民权，陈长才.谷氨酸受体过度激活拮抗剂神经节苷脂GM1[J]. 国外医学脑血管病分册，2001，9(1)：3637.
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[收稿日期]20051008
东南大学医学院附属徐州医院骨科，江苏 徐州 221009
东南大学附属中大医院骨科，江苏 南京 210009
[基金项目]江苏省卫生厅奥赛康科研基金资助项目(P200503)
[摘要]
目的：研究甲泼尼龙(MP)加神经节苷脂(GM1)对大鼠脊髓损伤(SCI)的疗效。方法：采用Allen’s法制备SCI大鼠模型。将模型大鼠随机分为4组，A组为生理盐水对照组，B组为MP治疗组，C组为GM1治疗组，D组为MP加GM1联合治疗组。大鼠存活不同时间后分别行行为学观察再处死，取伤段脊髓作石蜡切片，行HE染色和CD95单克隆抗体免疫组化检测。结果：HE染色显示脊髓组织病理学改变B、C、D组明显轻于A组，而D组较B、C组轻。伤后2周行为学指标优差依次为DCBA(P<0.05)。免疫组化检测表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在8 h达到高峰，在白质中48 h时达到高峰，而D组虽有高峰，但明显少于A组(P<0.01)，D组也少于B、C组(P<0.01)。结论：MP与GM1联合应用可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用并可促进神经功能的恢复。
[关键词]甲泼尼龙；神经节苷脂；脊髓损伤；大鼠
[中图分类号]R651.2
Influence of methylprednisolone and ganglioside on the CD95 expression of rats’injured spinal cord
HUANG Jianhua1， WU Xiaotao2 ，YANG Qing 1 , MA Chuanxue1， FENG Qiang1, XU Ronghua1
(1. Department of Orthopaedics, Xuzhou Hospital Affiliated to the Medical College， Southeast University， Xuzhou 221009， China ; 2. Department of Orthopaedics， Zhongda Hospital， Southeast University， Nanjing 210009， China )
Abstract：Objective To investigate the curative effect of methylprednisolone (MP)and ganglioside(GM1) on rats’ spinal cord injury. Methods Preparing rats with spinal cord injury by resorting to Allen’s mode and then dividing them into four groups at random: group A (control), group B ( with MP )， group C (with GM1 ) and Group D ( with MP and GM1 ). After different periods of surviving time, behavior of different rat was observed respectively and detected by Hemetoxylin staining and CD95 monoclonal antibody immunohistochemistry. Results In injured spinal cord，the pathological changes of group B, C and D were less obvious than that of group A, while group D was less obvious than group B and C. After two weeks of the injury, the order from superiority to inferiority of the behavioral index was DCBA (P<0.05,respectively). The immunohistochemical studies showed that in group A, the number of the CD95 immunostained positive cells in gray matter peaked after 8 hours, and in white matter it peaked after 48 hours. However, although group D had its peak, it was obviously less than group A (P<0.01), and also less than group B and C (P<0.01). Conclusion The combined application of MP and GM1 can stop the apoptosis of nerve cells, provide adequate protection for injured spinal cord and enhance the recovery of nerve functions.
Key words：methylprednisolone; ganglioside; spinal cord injury; rats
脊髓损伤(SCI)的病理机制非常复杂，分为原发性损伤和继发性损伤。继发性损伤中，血管痉挛、血栓形成、微循环障碍、水肿、自由基形成、兴奋性氨基酸生成、Ca2+内流超载等因素的综合作用导致了细胞的死亡。目前认为细胞调亡可能是细胞死亡的另外一种重要形式[1]。CD95是一种跨膜糖蛋白，它可与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)样配体结合诱导细胞凋亡，在SCI早期就有表达，伤后30min在脊髓后角的神经元上有阳性表达，而且特异性强，正常脊髓没有发现CD95免疫组化的阳性表达[2]。本实验旨在观察SCI后应用甲泼尼龙(methylprednisolone,MP)加神经节苷脂(ganglioside,GM1)对CD95表达的影响，从而了解MP联合GM1用药的疗效。
1 材料与方法
1.1 材料
SD大鼠185只，体重200～300g，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供。CD95单克隆抗体(兔抗大鼠)购于北京中杉生物技术有限公司，MP购于法玛西亚普强有限公司，GM1购于齐鲁制药有限公司，其他辅助用溶剂均来源于徐州医学院病理实验室。
1.2 方法
1.2.1 SCI动物模型的制作与分组
大鼠用0.3%戊巴比妥1ml·(100mg)-1腹腔内注射麻醉，消毒，手术显露T9～11脊髓,在骨窗上将5mm×3mm×1mm的硬质塑料片平放在脊髓上作为打击垫片，用直径为2mm、重量为10g的钢棒沿带有刻度的玻璃导管从50mm高度垂直自由下落，造成SCI模型，打击后迅速移开打击钢棒，立即可观察到大鼠尾巴痉挛性左右摆动，即视为造模成功。将模型大鼠随机分为4组：A组(对照组,n=45)术后15 min给生理盐水1ml；B组(MP治疗组,n=45)予MP 30mg·kg-1 腹腔内注射,1h后按5.4mg·(kg·h)-1计算23 h药量，分3次给药；C组(GM1治疗组,n=45)予GM1 10mg·kg-1 腹腔内注射；D组(MP加GM1治疗组,n=45) MP和GM1剂量同B、C组。在SCI后1、4、8、12、24、48、72h及1、2周9个时间点分别观察斜板试验角度，随后处死大鼠，取伤段脊髓，放入10%中性甲醛溶液中固定24h，经脱水、石蜡包埋后切成4μm厚的切片，进行病理学观察。
1.2.2 HE染色
(1)将做好的切片按以下顺序脱蜡：二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)；脱过蜡的切片再按以下顺序用乙醇洗去二甲苯：无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→80%乙醇→蒸馏水。(2)苏木素中浸泡5min，用蒸馏水冲洗，放入盐酸乙醇中浸泡20s，用蒸馏水冲洗，再放入蒸馏水中浸泡15min。(3)伊红染色1min，依次在75%、80%、95%及无水乙醇中浸泡1min。(4)用中性树脂封片，晾干。
1.2.3 免疫组化检测(PV9000通用型二步法)
将切片放入二甲苯中脱蜡；在无水、95%、80%乙醇中依次浸泡1min。用3%H2O2室温孵育5min，消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水洗3遍，浸入0.01mol·L-1 PBS缓冲液(pH 7.2)中2～3min；将切片浸入PBS缓冲液中，放入医用微波炉中加热，210s 后液体即可沸腾，间断微波加热，使温度维持在90℃以上，持续20min，再室温冷却30min，使其有充足时间进行抗原修复；滴加CD95(1∶50)，室温保温盒中作用120min，PBS液洗涤3次，每次2min。滴加第二抗体(poly peroxidaseantimouse IgG,)，室温保温盒中作用30min，PBS液荡洗3次，每次2min；DAB显色；苏木素复染。阳性对照采用扁桃体组织。
1.2.4 行为学检测
(1)斜板试验[3]：以Molt斜板测量动物在斜板上维持5s不下滑的最大角度。(2)Gale评分：0分，双后肢肌力为0级，感觉消失；1分，针刺有保护反应，有感觉存在，但无自主运动；2分，双后肢有轻微运动，但无功能，不能负重；3分，双后肢明显运动，但不能负重行走；4分，能负重行走数步，但不稳定，不持久；5分，能缓慢行走，但有一定缺陷，不灵活；6分，可正常行走[4]。
1.3 统计学处理
采用数字图像处理软件系统统计阳性细胞数。所有数据均为计量资料(±s),从每个实验动物损伤区的切片中随机选取3个部分,记录阳性细胞在灰白质中的总数，求出平均数。依次记录不同时间点切片的CD95阳性细胞数，阳性细胞数在各组的差异采用q检验，统计分析使用SPSS 11.5 for Windows 统计软件，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 行为学检测(斜板试验)结果
选5只正常大鼠，测得其斜板最大角度为(60.80±2.28)°，各组SCI后不同时间斜板最大角度的比较见表1。
2.2 Gale 评分结果
见表2。
表1 各组SCI后不同时间斜板最大角度(略)
表2 各时间段Gale 评分结果(略)
元变性；8h时B组白质中有出血灶，但结构清晰，C组灰质中神经元结构完整，胞核清晰；12～24h时两组灰质中虽有出血灶，但周边神经元结构完整，核及胞浆清晰；3～14d时两组灰质中可见增生胶质细胞，灰质边缘有神经元细胞，结构完整,但B组灰质中神经元轻度变性。D组：1～4h时灰质中央有点状出血，神经元数目较多，形态尚完整，胞核清晰(图3)；8h时神经元胞膜完整，核固缩，白质结构相对清晰；12～24h时灰质边缘神经元结构完整，核仁清晰；2～14d时神经元结构完整，胞核清晰，胶质细胞增生。
图1 A组SCI后 1h HE×400(略)
Fig 1 The photomicrograph of group A showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图2 C组SCI后1h HE×400(略)
Fig 2 The photomicrograph of group C showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图3 D组SCI后1h HE×400(略)
Fig 4 The photomicrograph of group D showing pathological change 1 hour
after SCI (HE×400)
2.4 免疫组化检测CD95表达情况
免疫组化检测显示，在阴性对照组(假手术组)没有发现CD95的阳性表达。SCI 1h，在脊髓灰质前、后角的神经元和胶质细胞上有阳性表达(细胞膜和细胞浆可见棕黄色)，但在白质中未见阳性表达；SCI 4h在灰质中可见强阳性表达，白质中有少量阳性细胞的表达(图4)；SCI 8h灰质中神经元细胞和胶质细胞CD95阳性表达明显增加，白质中胶质细胞CD95阳性表达也增加，并且达到最高峰(图5)；SCI 24～72h CD95阳性表达细胞为圆形有致密黑核的胶质细胞；SCI 1周后灰质中CD95阳性表达细胞甚少，CD95阳性表达细胞主要集中在白质中；SCI 2周后白质中CD95阳性表达很少。联合应用MP与GM1后CD95阳性表达细胞在各个时间点都比A组明显减少(图6)；在SCI 8h后虽然CD95阳性表达细胞数达到高峰，但较A组明显降低(P<0.01)；D组CD95阳性表达细胞数较B、C两组亦有减少(P<0.01)；在SCI 48h后白质中CD95阳性表达细胞数达到高峰，以胶质细胞为主，而阳性表达的神经元逐渐减少；SCI 2周时灰白质阳性表达细胞数基本消失。见表3。
图4 A组SCI后4h 免疫组化×200(略)
Fig 4 The photomicrograph of group Ashowing immunohistochemical expression of CD95 4 hour after SCI (×200)
图5 A组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 5 The photomicrograph of group A showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI (×200)
图6 D组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 6 The photomicrograph of group D showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI(×200)
3 讨论
SCI分为原发性损伤与继发性损伤。原发性损伤包括机械压迫、出血；继发性损害包括水肿、炎症反应、局部缺血、谷氨酸受体过度激活、钙离子溢出及过氧化作用等。在原发性损伤后较长一段时间内起作用的是一种细胞和分子水平的主动调节过程，具有可逆性。继发性损害可加重原发损伤，造成脊髓功能障碍，致机体全瘫或不全瘫[5]。众所周知，严重的SCI能触发一系列生化和代谢改变，它们从灰质向白质放射状展开，常引起不可逆转的损害。我们通过HE染色切片可见，SCI后病理改变从开始的灰质中出现出血灶及神经元细胞的变性到白质中出现出血灶及胶质细胞的增生、空泡的形成，与以上观点是吻合的。细胞死亡方式有两种，即坏死和凋亡。凋亡在SCI中的作用已被证明[6]。近年来，SCI后细胞凋亡所起的作用逐渐被认识，凋亡可以促进损伤区的继发性变性，可以使损伤区的传导束脱髓鞘。到目前为止，对原发性SCI尚无有效的治疗方法，仅依靠外科手术是不够的。继发性损害可加重原发性损伤，那么，对细胞凋亡进行积极控制有可能成为减轻SCI的有效途径之一。据认为，CD95分子在SCI后呈特异性表达，是反映SCI的客观指标之一。我们的实验表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在SCI后8h达到高峰，在白质中48h达到高峰，而D组的细胞凋亡数一直处于较低水平，虽然在SCI后8 h及48h有高峰，但较A 组明显减少(P<0.01)。通过实验可见细胞凋亡数由开始的灰质中出现到增多，而后白质中出现到增多，同时灰质中减少。最后灰白质中完全消失，这与中心性脊髓坏死的发展相一致。Gale评分及斜板试验表明D组神经功能有明显改善，切片HE染色可见灰质中央点状出血灶，神经元胞核清晰，较A组的病理变化明显减轻；CD95阳性表达细胞数亦较A组少；由此可见SCI后脊髓组织病理变化轻和细胞凋亡的减少及神经功能的恢复相一致。
激素类制剂在20世纪60年代开始应用于SCI的治疗，主要是因为激素能减轻SCI后的继发水肿。近年来研究认为，MP具有多方面的神经保护作用：(1)改善微循环，抑制脂质过氧化反应，减轻外伤后神经细胞的变性[7]；(2)减少细胞钙内流[8]；(3)维持神经元的兴奋性。
表3 大鼠SCI后不同时程CD95免疫反应阳性细胞数(略)
GM1是目前公认的一种谷氨酸受体拮抗剂[9]。其作用机制包括：(1)抗神经毒性作用，通过抑制谷氨酸NMDA受体介导的大量钙离子内流，从而防止细胞内钙离子超载所继发的一系列病理生理过程[10]；(2)神经营养作用，神经生长因子能维持神经元的存活和功能，对神经元具有营养作用，能够阻断神经元病理损害过程，明显促进神经组织再生[11]；(3)维持神经细胞膜线粒体的结构和功能，改善神经组织缺血缺氧，调节神经递质，改善神经传导速度[12]。
MP与GM1联合治疗SCI的可能机制是：(1)减轻组织细胞水肿。水肿是细胞损害后较早出现的一种表现，有效控制水肿对阻止病情发展意义重大。MP能拮抗抗利尿激素，减少远曲小管和集合管对水的重吸收，促使水的排出，从而减轻组织水肿。GM1 是通过恢复和活跃细胞膜Na+ K+ATP酶的活性，把大量的细胞内Na+逆浓度差转运出细胞膜外，减少钠水潴溜，从而减少细胞内水的含量，有效减轻细胞内水肿。本实验表明，在光镜下见D组SCI有轻度水肿，由此可见，联合用药能明显减轻组织细胞水肿。(2)抑制钙离子内流。由于细胞内的钙离子超载可导致神经细胞的损伤，促使细胞凋亡，因此，联合用药有利于阻止钙离子内流。(3)修复损伤的神经细胞。GM1是位于细胞膜表面的糖鞘脂，在中枢神经尤为丰富。动物试验表明GM1能通过血脑屏障，在神经损伤区含量最高，与损伤区的神经组织和神经细胞有高度的亲和力，并通过稳定膜结构与功能发挥作用[13]。因此，联合应用MP与GM1能有效阻止神经细胞的凋亡并促使损伤神经细胞的恢复。
本实验表明，A组凋亡发生早，且在SCI后8h及48h，CD95阳性细胞数达到高峰，而D组CD95阳性细胞数一直处于较低的水平，虽然在SCI后8h及48h亦有高峰，但较A组明显减少，可见MP加GM1治疗SCI具有较好的疗效，说明在SCI早期应用MP加GM1治疗，可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用，并能促进神经功能的恢复。
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[7]BRAUGHLER J M, HALL E D. Correlation of methylprednisolone levels in cat spinal cord with its effects on Na+K+ATP ase， lipid peroxidation， and alpha motor neuron function [J]. J Neurosurg, 1982， 56(6): 838844.
[8]YOUNG W， FLAMM E S. Effect of highdose corticosteroid therapy on blood flow, evoked potentials， and extracellular calcium in experiment spinal injury [J]. J Neurosurg， 1982,57(5): 667673.
[9]GERNDT S J, RODRIGUEZ J L, PAWLI J W, et al. Consequences of highdose steroid therapy for acute spinal cord injury [J]. J Trauma, 1997, 42: 22792284.
[10]MANEV H， COSTA E， WROBLEWSKI J T, et al. Abusive stimulation of excitatory amino acid receptors， a strategy to limit neurotoxicity [J].FASEB J， 1990， 4(10): 27892797.
[11]BAUMGARTNER W A， REDMOND J M, ZEHR K J, et al. The role of the monosialoganglioside, GM1 as a neuroprotectant in an experimental model of cardiopulmonary bypass and hypothermic circulatory arrest [J]. Ann N Y Acad Sci，1998，845: 382390.
[12]姚一，黄民权，陈长才.谷氨酸受体过度激活拮抗剂神经节苷脂GM1[J]. 国外医学脑血管病分册，2001，9(1)：3637.
[13]WEIRICH S D, COTLER H B, NARAYANA P A, et al. Histopathologic correlation of magnetic resonance imaging signal patterns in spinal cord injury model [J]. Spine,1990， 15(7):630638.
[收稿日期]20051008
东南大学医学院附属徐州医院骨科，江苏 徐州 221009
东南大学附属中大医院骨科，江苏 南京 210009
[基金项目]江苏省卫生厅奥赛康科研基金资助项目(P200503)
[摘要]
目的：研究甲泼尼龙(MP)加神经节苷脂(GM1)对大鼠脊髓损伤(SCI)的疗效。方法：采用Allen’s法制备SCI大鼠模型。将模型大鼠随机分为4组，A组为生理盐水对照组，B组为MP治疗组，C组为GM1治疗组，D组为MP加GM1联合治疗组。大鼠存活不同时间后分别行行为学观察再处死，取伤段脊髓作石蜡切片，行HE染色和CD95单克隆抗体免疫组化检测。结果：HE染色显示脊髓组织病理学改变B、C、D组明显轻于A组，而D组较B、C组轻。伤后2周行为学指标优差依次为DCBA(P<0.05)。免疫组化检测表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在8 h达到高峰，在白质中48 h时达到高峰，而D组虽有高峰，但明显少于A组(P<0.01)，D组也少于B、C组(P<0.01)。结论：MP与GM1联合应用可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用并可促进神经功能的恢复。
[关键词]甲泼尼龙；神经节苷脂；脊髓损伤；大鼠
[中图分类号]R651.2
Influence of methylprednisolone and ganglioside on the CD95 expression of rats’injured spinal cord
HUANG Jianhua1， WU Xiaotao2 ，YANG Qing 1 , MA Chuanxue1， FENG Qiang1, XU Ronghua1
(1. Department of Orthopaedics, Xuzhou Hospital Affiliated to the Medical College， Southeast University， Xuzhou 221009， China ; 2. Department of Orthopaedics， Zhongda Hospital， Southeast University， Nanjing 210009， China )
Abstract：Objective To investigate the curative effect of methylprednisolone (MP)and ganglioside(GM1) on rats’ spinal cord injury. Methods Preparing rats with spinal cord injury by resorting to Allen’s mode and then dividing them into four groups at random: group A (control), group B ( with MP )， group C (with GM1 ) and Group D ( with MP and GM1 ). After different periods of surviving time, behavior of different rat was observed respectively and detected by Hemetoxylin staining and CD95 monoclonal antibody immunohistochemistry. Results In injured spinal cord，the pathological changes of group B, C and D were less obvious than that of group A, while group D was less obvious than group B and C. After two weeks of the injury, the order from superiority to inferiority of the behavioral index was DCBA (P<0.05,respectively). The immunohistochemical studies showed that in group A, the number of the CD95 immunostained positive cells in gray matter peaked after 8 hours, and in white matter it peaked after 48 hours. However, although group D had its peak, it was obviously less than group A (P<0.01), and also less than group B and C (P<0.01). Conclusion The combined application of MP and GM1 can stop the apoptosis of nerve cells, provide adequate protection for injured spinal cord and enhance the recovery of nerve functions.
Key words：methylprednisolone; ganglioside; spinal cord injury; rats
脊髓损伤(SCI)的病理机制非常复杂，分为原发性损伤和继发性损伤。继发性损伤中，血管痉挛、血栓形成、微循环障碍、水肿、自由基形成、兴奋性氨基酸生成、Ca2+内流超载等因素的综合作用导致了细胞的死亡。目前认为细胞调亡可能是细胞死亡的另外一种重要形式[1]。CD95是一种跨膜糖蛋白，它可与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)样配体结合诱导细胞凋亡，在SCI早期就有表达，伤后30min在脊髓后角的神经元上有阳性表达，而且特异性强，正常脊髓没有发现CD95免疫组化的阳性表达[2]。本实验旨在观察SCI后应用甲泼尼龙(methylprednisolone,MP)加神经节苷脂(ganglioside,GM1)对CD95表达的影响，从而了解MP联合GM1用药的疗效。
1 材料与方法
1.1 材料
SD大鼠185只，体重200～300g，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供。CD95单克隆抗体(兔抗大鼠)购于北京中杉生物技术有限公司，MP购于法玛西亚普强有限公司，GM1购于齐鲁制药有限公司，其他辅助用溶剂均来源于徐州医学院病理实验室。
1.2 方法
1.2.1 SCI动物模型的制作与分组
大鼠用0.3%戊巴比妥1ml·(100mg)-1腹腔内注射麻醉，消毒，手术显露T9～11脊髓,在骨窗上将5mm×3mm×1mm的硬质塑料片平放在脊髓上作为打击垫片，用直径为2mm、重量为10g的钢棒沿带有刻度的玻璃导管从50mm高度垂直自由下落，造成SCI模型，打击后迅速移开打击钢棒，立即可观察到大鼠尾巴痉挛性左右摆动，即视为造模成功。将模型大鼠随机分为4组：A组(对照组,n=45)术后15 min给生理盐水1ml；B组(MP治疗组,n=45)予MP 30mg·kg-1 腹腔内注射,1h后按5.4mg·(kg·h)-1计算23 h药量，分3次给药；C组(GM1治疗组,n=45)予GM1 10mg·kg-1 腹腔内注射；D组(MP加GM1治疗组,n=45) MP和GM1剂量同B、C组。在SCI后1、4、8、12、24、48、72h及1、2周9个时间点分别观察斜板试验角度，随后处死大鼠，取伤段脊髓，放入10%中性甲醛溶液中固定24h，经脱水、石蜡包埋后切成4μm厚的切片，进行病理学观察。
1.2.2 HE染色
(1)将做好的切片按以下顺序脱蜡：二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)；脱过蜡的切片再按以下顺序用乙醇洗去二甲苯：无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→80%乙醇→蒸馏水。(2)苏木素中浸泡5min，用蒸馏水冲洗，放入盐酸乙醇中浸泡20s，用蒸馏水冲洗，再放入蒸馏水中浸泡15min。(3)伊红染色1min，依次在75%、80%、95%及无水乙醇中浸泡1min。(4)用中性树脂封片，晾干。
1.2.3 免疫组化检测(PV9000通用型二步法)
将切片放入二甲苯中脱蜡；在无水、95%、80%乙醇中依次浸泡1min。用3%H2O2室温孵育5min，消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水洗3遍，浸入0.01mol·L-1 PBS缓冲液(pH 7.2)中2～3min；将切片浸入PBS缓冲液中，放入医用微波炉中加热，210s 后液体即可沸腾，间断微波加热，使温度维持在90℃以上，持续20min，再室温冷却30min，使其有充足时间进行抗原修复；滴加CD95(1∶50)，室温保温盒中作用120min，PBS液洗涤3次，每次2min。滴加第二抗体(poly peroxidaseantimouse IgG,)，室温保温盒中作用30min，PBS液荡洗3次，每次2min；DAB显色；苏木素复染。阳性对照采用扁桃体组织。
1.2.4 行为学检测
(1)斜板试验[3]：以Molt斜板测量动物在斜板上维持5s不下滑的最大角度。(2)Gale评分：0分，双后肢肌力为0级，感觉消失；1分，针刺有保护反应，有感觉存在，但无自主运动；2分，双后肢有轻微运动，但无功能，不能负重；3分，双后肢明显运动，但不能负重行走；4分，能负重行走数步，但不稳定，不持久；5分，能缓慢行走，但有一定缺陷，不灵活；6分，可正常行走[4]。
1.3 统计学处理
采用数字图像处理软件系统统计阳性细胞数。所有数据均为计量资料(±s),从每个实验动物损伤区的切片中随机选取3个部分,记录阳性细胞在灰白质中的总数，求出平均数。依次记录不同时间点切片的CD95阳性细胞数，阳性细胞数在各组的差异采用q检验，统计分析使用SPSS 11.5 for Windows 统计软件，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 行为学检测(斜板试验)结果
选5只正常大鼠，测得其斜板最大角度为(60.80±2.28)°，各组SCI后不同时间斜板最大角度的比较见表1。
2.2 Gale 评分结果
见表2。
表1 各组SCI后不同时间斜板最大角度(略)
表2 各时间段Gale 评分结果(略)
元变性；8h时B组白质中有出血灶，但结构清晰，C组灰质中神经元结构完整，胞核清晰；12～24h时两组灰质中虽有出血灶，但周边神经元结构完整，核及胞浆清晰；3～14d时两组灰质中可见增生胶质细胞，灰质边缘有神经元细胞，结构完整,但B组灰质中神经元轻度变性。D组：1～4h时灰质中央有点状出血，神经元数目较多，形态尚完整，胞核清晰(图3)；8h时神经元胞膜完整，核固缩，白质结构相对清晰；12～24h时灰质边缘神经元结构完整，核仁清晰；2～14d时神经元结构完整，胞核清晰，胶质细胞增生。
图1 A组SCI后 1h HE×400(略)
Fig 1 The photomicrograph of group A showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图2 C组SCI后1h HE×400(略)
Fig 2 The photomicrograph of group C showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图3 D组SCI后1h HE×400(略)
Fig 4 The photomicrograph of group D showing pathological change 1 hour
after SCI (HE×400)
2.4 免疫组化检测CD95表达情况
免疫组化检测显示，在阴性对照组(假手术组)没有发现CD95的阳性表达。SCI 1h，在脊髓灰质前、后角的神经元和胶质细胞上有阳性表达(细胞膜和细胞浆可见棕黄色)，但在白质中未见阳性表达；SCI 4h在灰质中可见强阳性表达，白质中有少量阳性细胞的表达(图4)；SCI 8h灰质中神经元细胞和胶质细胞CD95阳性表达明显增加，白质中胶质细胞CD95阳性表达也增加，并且达到最高峰(图5)；SCI 24～72h CD95阳性表达细胞为圆形有致密黑核的胶质细胞；SCI 1周后灰质中CD95阳性表达细胞甚少，CD95阳性表达细胞主要集中在白质中；SCI 2周后白质中CD95阳性表达很少。联合应用MP与GM1后CD95阳性表达细胞在各个时间点都比A组明显减少(图6)；在SCI 8h后虽然CD95阳性表达细胞数达到高峰，但较A组明显降低(P<0.01)；D组CD95阳性表达细胞数较B、C两组亦有减少(P<0.01)；在SCI 48h后白质中CD95阳性表达细胞数达到高峰，以胶质细胞为主，而阳性表达的神经元逐渐减少；SCI 2周时灰白质阳性表达细胞数基本消失。见表3。
图4 A组SCI后4h 免疫组化×200(略)
Fig 4 The photomicrograph of group Ashowing immunohistochemical expression of CD95 4 hour after SCI (×200)
图5 A组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 5 The photomicrograph of group A showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI (×200)
图6 D组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 6 The photomicrograph of group D showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI(×200)
3 讨论
SCI分为原发性损伤与继发性损伤。原发性损伤包括机械压迫、出血；继发性损害包括水肿、炎症反应、局部缺血、谷氨酸受体过度激活、钙离子溢出及过氧化作用等。在原发性损伤后较长一段时间内起作用的是一种细胞和分子水平的主动调节过程，具有可逆性。继发性损害可加重原发损伤，造成脊髓功能障碍，致机体全瘫或不全瘫[5]。众所周知，严重的SCI能触发一系列生化和代谢改变，它们从灰质向白质放射状展开，常引起不可逆转的损害。我们通过HE染色切片可见，SCI后病理改变从开始的灰质中出现出血灶及神经元细胞的变性到白质中出现出血灶及胶质细胞的增生、空泡的形成，与以上观点是吻合的。细胞死亡方式有两种，即坏死和凋亡。凋亡在SCI中的作用已被证明[6]。近年来，SCI后细胞凋亡所起的作用逐渐被认识，凋亡可以促进损伤区的继发性变性，可以使损伤区的传导束脱髓鞘。到目前为止，对原发性SCI尚无有效的治疗方法，仅依靠外科手术是不够的。继发性损害可加重原发性损伤，那么，对细胞凋亡进行积极控制有可能成为减轻SCI的有效途径之一。据认为，CD95分子在SCI后呈特异性表达，是反映SCI的客观指标之一。我们的实验表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在SCI后8h达到高峰，在白质中48h达到高峰，而D组的细胞凋亡数一直处于较低水平，虽然在SCI后8 h及48h有高峰，但较A 组明显减少(P<0.01)。通过实验可见细胞凋亡数由开始的灰质中出现到增多，而后白质中出现到增多，同时灰质中减少。最后灰白质中完全消失，这与中心性脊髓坏死的发展相一致。Gale评分及斜板试验表明D组神经功能有明显改善，切片HE染色可见灰质中央点状出血灶，神经元胞核清晰，较A组的病理变化明显减轻；CD95阳性表达细胞数亦较A组少；由此可见SCI后脊髓组织病理变化轻和细胞凋亡的减少及神经功能的恢复相一致。
激素类制剂在20世纪60年代开始应用于SCI的治疗，主要是因为激素能减轻SCI后的继发水肿。近年来研究认为，MP具有多方面的神经保护作用：(1)改善微循环，抑制脂质过氧化反应，减轻外伤后神经细胞的变性[7]；(2)减少细胞钙内流[8]；(3)维持神经元的兴奋性。
表3 大鼠SCI后不同时程CD95免疫反应阳性细胞数(略)
GM1是目前公认的一种谷氨酸受体拮抗剂[9]。其作用机制包括：(1)抗神经毒性作用，通过抑制谷氨酸NMDA受体介导的大量钙离子内流，从而防止细胞内钙离子超载所继发的一系列病理生理过程[10]；(2)神经营养作用，神经生长因子能维持神经元的存活和功能，对神经元具有营养作用，能够阻断神经元病理损害过程，明显促进神经组织再生[11]；(3)维持神经细胞膜线粒体的结构和功能，改善神经组织缺血缺氧，调节神经递质，改善神经传导速度[12]。
MP与GM1联合治疗SCI的可能机制是：(1)减轻组织细胞水肿。水肿是细胞损害后较早出现的一种表现，有效控制水肿对阻止病情发展意义重大。MP能拮抗抗利尿激素，减少远曲小管和集合管对水的重吸收，促使水的排出，从而减轻组织水肿。GM1 是通过恢复和活跃细胞膜Na+ K+ATP酶的活性，把大量的细胞内Na+逆浓度差转运出细胞膜外，减少钠水潴溜，从而减少细胞内水的含量，有效减轻细胞内水肿。本实验表明，在光镜下见D组SCI有轻度水肿，由此可见，联合用药能明显减轻组织细胞水肿。(2)抑制钙离子内流。由于细胞内的钙离子超载可导致神经细胞的损伤，促使细胞凋亡，因此，联合用药有利于阻止钙离子内流。(3)修复损伤的神经细胞。GM1是位于细胞膜表面的糖鞘脂，在中枢神经尤为丰富。动物试验表明GM1能通过血脑屏障，在神经损伤区含量最高，与损伤区的神经组织和神经细胞有高度的亲和力，并通过稳定膜结构与功能发挥作用[13]。因此，联合应用MP与GM1能有效阻止神经细胞的凋亡并促使损伤神经细胞的恢复。
本实验表明，A组凋亡发生早，且在SCI后8h及48h，CD95阳性细胞数达到高峰，而D组CD95阳性细胞数一直处于较低的水平，虽然在SCI后8h及48h亦有高峰，但较A组明显减少，可见MP加GM1治疗SCI具有较好的疗效，说明在SCI早期应用MP加GM1治疗，可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用，并能促进神经功能的恢复。
[参考文献]
[1] RINK A， FUNG K M， TROJANOWSKI J Q， et al. Evidences of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injure in the rat [J]. Am J Pathol， 1995， 147: 15751583.
[2]ZI Y, FAN G Y, ZHU Y U E, et al. Presence and significance of CD95 expression in rats after spinal cord injury [J]. Chin J Clin Rehabi, 2002, 6(20):30523053.
[3]FEHLINGS M G, TATOR C H. The relationships among the severity of spinal cord injury， residual neurological function， axon counts， and counts of retrogradely labled neurons after experimental spinal cord injury[J].Exp Nurol，1995，132:220228.
[4]廖经武，宋跃明.大剂量维生素C与小剂量甲基强的松龙联合治疗大鼠急性脊髓损伤初步研究[J].中国脊柱脊髓杂志，2004，14(5)：287289.
[5]胥少汀.脊髓损伤[J].中华骨科杂志，1997，17(5)：340343.
[6]O’BRIEN M F, LENKE L G, LOU J, et al. Astrocyte response and transforming growth factorα localization in acute spinal cord injury [J]. Spine, 1994， 19(20): 23212330.
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[收稿日期]20051008
东南大学医学院附属徐州医院骨科，江苏 徐州 221009
东南大学附属中大医院骨科，江苏 南京 210009
[基金项目]江苏省卫生厅奥赛康科研基金资助项目(P200503)
[摘要]
目的：研究甲泼尼龙(MP)加神经节苷脂(GM1)对大鼠脊髓损伤(SCI)的疗效。方法：采用Allen’s法制备SCI大鼠模型。将模型大鼠随机分为4组，A组为生理盐水对照组，B组为MP治疗组，C组为GM1治疗组，D组为MP加GM1联合治疗组。大鼠存活不同时间后分别行行为学观察再处死，取伤段脊髓作石蜡切片，行HE染色和CD95单克隆抗体免疫组化检测。结果：HE染色显示脊髓组织病理学改变B、C、D组明显轻于A组，而D组较B、C组轻。伤后2周行为学指标优差依次为DCBA(P<0.05)。免疫组化检测表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在8 h达到高峰，在白质中48 h时达到高峰，而D组虽有高峰，但明显少于A组(P<0.01)，D组也少于B、C组(P<0.01)。结论：MP与GM1联合应用可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用并可促进神经功能的恢复。
[关键词]甲泼尼龙；神经节苷脂；脊髓损伤；大鼠
[中图分类号]R651.2
Influence of methylprednisolone and ganglioside on the CD95 expression of rats’injured spinal cord
HUANG Jianhua1， WU Xiaotao2 ，YANG Qing 1 , MA Chuanxue1， FENG Qiang1, XU Ronghua1
(1. Department of Orthopaedics, Xuzhou Hospital Affiliated to the Medical College， Southeast University， Xuzhou 221009， China ; 2. Department of Orthopaedics， Zhongda Hospital， Southeast University， Nanjing 210009， China )
Abstract：Objective To investigate the curative effect of methylprednisolone (MP)and ganglioside(GM1) on rats’ spinal cord injury. Methods Preparing rats with spinal cord injury by resorting to Allen’s mode and then dividing them into four groups at random: group A (control), group B ( with MP )， group C (with GM1 ) and Group D ( with MP and GM1 ). After different periods of surviving time, behavior of different rat was observed respectively and detected by Hemetoxylin staining and CD95 monoclonal antibody immunohistochemistry. Results In injured spinal cord，the pathological changes of group B, C and D were less obvious than that of group A, while group D was less obvious than group B and C. After two weeks of the injury, the order from superiority to inferiority of the behavioral index was DCBA (P<0.05,respectively). The immunohistochemical studies showed that in group A, the number of the CD95 immunostained positive cells in gray matter peaked after 8 hours, and in white matter it peaked after 48 hours. However, although group D had its peak, it was obviously less than group A (P<0.01), and also less than group B and C (P<0.01). Conclusion The combined application of MP and GM1 can stop the apoptosis of nerve cells, provide adequate protection for injured spinal cord and enhance the recovery of nerve functions.
Key words：methylprednisolone; ganglioside; spinal cord injury; rats
脊髓损伤(SCI)的病理机制非常复杂，分为原发性损伤和继发性损伤。继发性损伤中，血管痉挛、血栓形成、微循环障碍、水肿、自由基形成、兴奋性氨基酸生成、Ca2+内流超载等因素的综合作用导致了细胞的死亡。目前认为细胞调亡可能是细胞死亡的另外一种重要形式[1]。CD95是一种跨膜糖蛋白，它可与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)样配体结合诱导细胞凋亡，在SCI早期就有表达，伤后30min在脊髓后角的神经元上有阳性表达，而且特异性强，正常脊髓没有发现CD95免疫组化的阳性表达[2]。本实验旨在观察SCI后应用甲泼尼龙(methylprednisolone,MP)加神经节苷脂(ganglioside,GM1)对CD95表达的影响，从而了解MP联合GM1用药的疗效。
1 材料与方法
1.1 材料
SD大鼠185只，体重200～300g，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供。CD95单克隆抗体(兔抗大鼠)购于北京中杉生物技术有限公司，MP购于法玛西亚普强有限公司，GM1购于齐鲁制药有限公司，其他辅助用溶剂均来源于徐州医学院病理实验室。
1.2 方法
1.2.1 SCI动物模型的制作与分组
大鼠用0.3%戊巴比妥1ml·(100mg)-1腹腔内注射麻醉，消毒，手术显露T9～11脊髓,在骨窗上将5mm×3mm×1mm的硬质塑料片平放在脊髓上作为打击垫片，用直径为2mm、重量为10g的钢棒沿带有刻度的玻璃导管从50mm高度垂直自由下落，造成SCI模型，打击后迅速移开打击钢棒，立即可观察到大鼠尾巴痉挛性左右摆动，即视为造模成功。将模型大鼠随机分为4组：A组(对照组,n=45)术后15 min给生理盐水1ml；B组(MP治疗组,n=45)予MP 30mg·kg-1 腹腔内注射,1h后按5.4mg·(kg·h)-1计算23 h药量，分3次给药；C组(GM1治疗组,n=45)予GM1 10mg·kg-1 腹腔内注射；D组(MP加GM1治疗组,n=45) MP和GM1剂量同B、C组。在SCI后1、4、8、12、24、48、72h及1、2周9个时间点分别观察斜板试验角度，随后处死大鼠，取伤段脊髓，放入10%中性甲醛溶液中固定24h，经脱水、石蜡包埋后切成4μm厚的切片，进行病理学观察。
1.2.2 HE染色
(1)将做好的切片按以下顺序脱蜡：二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)→二甲苯(2～3min)；脱过蜡的切片再按以下顺序用乙醇洗去二甲苯：无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→80%乙醇→蒸馏水。(2)苏木素中浸泡5min，用蒸馏水冲洗，放入盐酸乙醇中浸泡20s，用蒸馏水冲洗，再放入蒸馏水中浸泡15min。(3)伊红染色1min，依次在75%、80%、95%及无水乙醇中浸泡1min。(4)用中性树脂封片，晾干。
1.2.3 免疫组化检测(PV9000通用型二步法)
将切片放入二甲苯中脱蜡；在无水、95%、80%乙醇中依次浸泡1min。用3%H2O2室温孵育5min，消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水洗3遍，浸入0.01mol·L-1 PBS缓冲液(pH 7.2)中2～3min；将切片浸入PBS缓冲液中，放入医用微波炉中加热，210s 后液体即可沸腾，间断微波加热，使温度维持在90℃以上，持续20min，再室温冷却30min，使其有充足时间进行抗原修复；滴加CD95(1∶50)，室温保温盒中作用120min，PBS液洗涤3次，每次2min。滴加第二抗体(poly peroxidaseantimouse IgG,)，室温保温盒中作用30min，PBS液荡洗3次，每次2min；DAB显色；苏木素复染。阳性对照采用扁桃体组织。
1.2.4 行为学检测
(1)斜板试验[3]：以Molt斜板测量动物在斜板上维持5s不下滑的最大角度。(2)Gale评分：0分，双后肢肌力为0级，感觉消失；1分，针刺有保护反应，有感觉存在，但无自主运动；2分，双后肢有轻微运动，但无功能，不能负重；3分，双后肢明显运动，但不能负重行走；4分，能负重行走数步，但不稳定，不持久；5分，能缓慢行走，但有一定缺陷，不灵活；6分，可正常行走[4]。
1.3 统计学处理
采用数字图像处理软件系统统计阳性细胞数。所有数据均为计量资料(±s),从每个实验动物损伤区的切片中随机选取3个部分,记录阳性细胞在灰白质中的总数，求出平均数。依次记录不同时间点切片的CD95阳性细胞数，阳性细胞数在各组的差异采用q检验，统计分析使用SPSS 11.5 for Windows 统计软件，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 行为学检测(斜板试验)结果
选5只正常大鼠，测得其斜板最大角度为(60.80±2.28)°，各组SCI后不同时间斜板最大角度的比较见表1。
2.2 Gale 评分结果
见表2。
表1 各组SCI后不同时间斜板最大角度(略)
表2 各时间段Gale 评分结果(略)
元变性；8h时B组白质中有出血灶，但结构清晰，C组灰质中神经元结构完整，胞核清晰；12～24h时两组灰质中虽有出血灶，但周边神经元结构完整，核及胞浆清晰；3～14d时两组灰质中可见增生胶质细胞，灰质边缘有神经元细胞，结构完整,但B组灰质中神经元轻度变性。D组：1～4h时灰质中央有点状出血，神经元数目较多，形态尚完整，胞核清晰(图3)；8h时神经元胞膜完整，核固缩，白质结构相对清晰；12～24h时灰质边缘神经元结构完整，核仁清晰；2～14d时神经元结构完整，胞核清晰，胶质细胞增生。
图1 A组SCI后 1h HE×400(略)
Fig 1 The photomicrograph of group A showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图2 C组SCI后1h HE×400(略)
Fig 2 The photomicrograph of group C showing pathological change 1 hour after SCI (HE×400)
图3 D组SCI后1h HE×400(略)
Fig 4 The photomicrograph of group D showing pathological change 1 hour
after SCI (HE×400)
2.4 免疫组化检测CD95表达情况
免疫组化检测显示，在阴性对照组(假手术组)没有发现CD95的阳性表达。SCI 1h，在脊髓灰质前、后角的神经元和胶质细胞上有阳性表达(细胞膜和细胞浆可见棕黄色)，但在白质中未见阳性表达；SCI 4h在灰质中可见强阳性表达，白质中有少量阳性细胞的表达(图4)；SCI 8h灰质中神经元细胞和胶质细胞CD95阳性表达明显增加，白质中胶质细胞CD95阳性表达也增加，并且达到最高峰(图5)；SCI 24～72h CD95阳性表达细胞为圆形有致密黑核的胶质细胞；SCI 1周后灰质中CD95阳性表达细胞甚少，CD95阳性表达细胞主要集中在白质中；SCI 2周后白质中CD95阳性表达很少。联合应用MP与GM1后CD95阳性表达细胞在各个时间点都比A组明显减少(图6)；在SCI 8h后虽然CD95阳性表达细胞数达到高峰，但较A组明显降低(P<0.01)；D组CD95阳性表达细胞数较B、C两组亦有减少(P<0.01)；在SCI 48h后白质中CD95阳性表达细胞数达到高峰，以胶质细胞为主，而阳性表达的神经元逐渐减少；SCI 2周时灰白质阳性表达细胞数基本消失。见表3。
图4 A组SCI后4h 免疫组化×200(略)
Fig 4 The photomicrograph of group Ashowing immunohistochemical expression of CD95 4 hour after SCI (×200)
图5 A组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 5 The photomicrograph of group A showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI (×200)
图6 D组SCI后8h 免疫组化×200(略)
Fig 6 The photomicrograph of group D showing immunohistochemical expression of CD95 8 hour after SCI(×200)
3 讨论
SCI分为原发性损伤与继发性损伤。原发性损伤包括机械压迫、出血；继发性损害包括水肿、炎症反应、局部缺血、谷氨酸受体过度激活、钙离子溢出及过氧化作用等。在原发性损伤后较长一段时间内起作用的是一种细胞和分子水平的主动调节过程，具有可逆性。继发性损害可加重原发损伤，造成脊髓功能障碍，致机体全瘫或不全瘫[5]。众所周知，严重的SCI能触发一系列生化和代谢改变，它们从灰质向白质放射状展开，常引起不可逆转的损害。我们通过HE染色切片可见，SCI后病理改变从开始的灰质中出现出血灶及神经元细胞的变性到白质中出现出血灶及胶质细胞的增生、空泡的形成，与以上观点是吻合的。细胞死亡方式有两种，即坏死和凋亡。凋亡在SCI中的作用已被证明[6]。近年来，SCI后细胞凋亡所起的作用逐渐被认识，凋亡可以促进损伤区的继发性变性，可以使损伤区的传导束脱髓鞘。到目前为止，对原发性SCI尚无有效的治疗方法，仅依靠外科手术是不够的。继发性损害可加重原发性损伤，那么，对细胞凋亡进行积极控制有可能成为减轻SCI的有效途径之一。据认为，CD95分子在SCI后呈特异性表达，是反映SCI的客观指标之一。我们的实验表明，A组脊髓灰质CD95免疫染色阳性细胞数在SCI后8h达到高峰，在白质中48h达到高峰，而D组的细胞凋亡数一直处于较低水平，虽然在SCI后8 h及48h有高峰，但较A 组明显减少(P<0.01)。通过实验可见细胞凋亡数由开始的灰质中出现到增多，而后白质中出现到增多，同时灰质中减少。最后灰白质中完全消失，这与中心性脊髓坏死的发展相一致。Gale评分及斜板试验表明D组神经功能有明显改善，切片HE染色可见灰质中央点状出血灶，神经元胞核清晰，较A组的病理变化明显减轻；CD95阳性表达细胞数亦较A组少；由此可见SCI后脊髓组织病理变化轻和细胞凋亡的减少及神经功能的恢复相一致。
激素类制剂在20世纪60年代开始应用于SCI的治疗，主要是因为激素能减轻SCI后的继发水肿。近年来研究认为，MP具有多方面的神经保护作用：(1)改善微循环，抑制脂质过氧化反应，减轻外伤后神经细胞的变性[7]；(2)减少细胞钙内流[8]；(3)维持神经元的兴奋性。
表3 大鼠SCI后不同时程CD95免疫反应阳性细胞数(略)
GM1是目前公认的一种谷氨酸受体拮抗剂[9]。其作用机制包括：(1)抗神经毒性作用，通过抑制谷氨酸NMDA受体介导的大量钙离子内流，从而防止细胞内钙离子超载所继发的一系列病理生理过程[10]；(2)神经营养作用，神经生长因子能维持神经元的存活和功能，对神经元具有营养作用，能够阻断神经元病理损害过程，明显促进神经组织再生[11]；(3)维持神经细胞膜线粒体的结构和功能，改善神经组织缺血缺氧，调节神经递质，改善神经传导速度[12]。
MP与GM1联合治疗SCI的可能机制是：(1)减轻组织细胞水肿。水肿是细胞损害后较早出现的一种表现，有效控制水肿对阻止病情发展意义重大。MP能拮抗抗利尿激素，减少远曲小管和集合管对水的重吸收，促使水的排出，从而减轻组织水肿。GM1 是通过恢复和活跃细胞膜Na+ K+ATP酶的活性，把大量的细胞内Na+逆浓度差转运出细胞膜外，减少钠水潴溜，从而减少细胞内水的含量，有效减轻细胞内水肿。本实验表明，在光镜下见D组SCI有轻度水肿，由此可见，联合用药能明显减轻组织细胞水肿。(2)抑制钙离子内流。由于细胞内的钙离子超载可导致神经细胞的损伤，促使细胞凋亡，因此，联合用药有利于阻止钙离子内流。(3)修复损伤的神经细胞。GM1是位于细胞膜表面的糖鞘脂，在中枢神经尤为丰富。动物试验表明GM1能通过血脑屏障，在神经损伤区含量最高，与损伤区的神经组织和神经细胞有高度的亲和力，并通过稳定膜结构与功能发挥作用[13]。因此，联合应用MP与GM1能有效阻止神经细胞的凋亡并促使损伤神经细胞的恢复。
本实验表明，A组凋亡发生早，且在SCI后8h及48h，CD95阳性细胞数达到高峰，而D组CD95阳性细胞数一直处于较低的水平，虽然在SCI后8h及48h亦有高峰，但较A组明显减少，可见MP加GM1治疗SCI具有较好的疗效，说明在SCI早期应用MP加GM1治疗，可阻断神经细胞的凋亡，对损伤的脊髓组织有良好的保护作用，并能促进神经功能的恢复。
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东南大学医学院附属徐州医院骨科，江苏 徐州 221009
东南大学附属中大医院骨科，江苏 南京 210009
[基金项目]江苏省卫生厅奥赛康科研基金资助项目(P200503), 百拇医药(黄建华,吴小涛 ,杨青,马传学,冯强,徐荣华)