卵巢癌细胞系来源外来体的获得及形态特征观察
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李奇灵,辛晓燕 ,卜 宁 ,李亚玲 ,于月成 ,方 静
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参见附件(223KB，3页)。
摘要：目的 从8910、TC1、SKOV3、CAOV和3AO卵巢癌细胞系培养上清液中获得外来体。方法 分别培养8910、TC1、SKOV3、CAOV和3AO卵巢癌细胞系，收集上清液，通过多步离心和超滤等方法分离出外来体。电镜下进行形态学观察。结果 8910和3AO细胞系培养上清液中分离出外来体，置于透射电子显微镜下观察，可见具有明显异质性的圆形或椭圆形小囊泡，直径约30-90nm，有完整的包膜。TC1、SKOV3和CAOV细胞系培养上清液中未分离出外来体。结论 8910和3AO卵巢癌细胞系可分泌外来体，两种细胞系来源的外来体在形态和大小上无明显差别，有可能作为卵巢癌免疫治疗的潜在抗原。
关键词：卵巢癌；免疫治疗；外来体；细胞系
Obtainment and morphologic characteristics of exosomes acquired from ovarian cancer lines
Li Qiling, Yin Xiaoyan, Bu Ning, Li Yaling, Yu Yuecheng, Fang Jing
(Department of Gynecology and Obstetrics, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710032;Department of Haematology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University,Xian 710032;Gongzhuling Health School, Gongzhuling 136100;Department of Gynecology and Obstetrics, First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)
ABSTRACT: Objective To obtain exosomes from the cell culture supernatants of 8910, TC1, SKOV3, CAOV and 3AO ovarian cancer cell lines. Methods 8910, TC1, SKOV3, CAOV and 3AO ovarian cancer cell lines were cultured separately and the cell culture supernatants were collected to seperate exosomes with multiple centrifugation and ultrafiltration. Morphology of exosomes were observed with electron microscopy. Results Exosomes were purified in 8910 and 3AO cell culture supernatants. Exosoems exhibited heterogenous round or elliptic microvesicles ranging from 30 to 90 nm in diameter with intact membrane. Exosomes were not purified in TC1, SKOV3, and CAOV cell culture supernatants. Conclusion 8910 and 3AO cell lines may secrete exosomes, which are potential specific antigens for immunotherapy against ovarian cancer cells.
KEY WORDS: ovarian cancer; immunotherapy; exosomes; cell line
现代西医治疗卵巢癌的原则是以手术为主，辅以化疗和(或)放疗，对暂时不能手术切除者，直接采用化疗和(或)放疗，尽量多的杀灭肿瘤细胞，减轻其对机体的损害。此外，在切除肿瘤和化疗放疗的同时，还需要积极应用免疫治疗在内的生物治疗。树突状细胞(dendritic cell, DC)是目前最有效的抗原递呈细胞，将其作为肿瘤主动免疫治疗手段，已成为肿瘤疫苗研究的热点之一\[1\]。目前DC介导的肿瘤疫苗主要有抗原肽刺激的DC，肿瘤提取物刺激的DC，肿瘤细胞与DC融合产物及基因转染的DC\[23\]。 而外来体作为特异性抗原致敏DC，近年来被许多学者所关注。本研究从8910、TC1、SKOV3、CAOV和3AO卵巢癌细胞系培养上清液中分离外来体，有望为卵巢癌的免疫治疗提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料 RPMI1640培养液购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司；99.93%重水购自四川火炬化工集团有限责任公司；Centriplus离心超滤管(100KDa)、Amicon Ultra高回收率高流速切向流超滤离心管(100KDa)购自美国Millipore公司；超速低温离心机(美国Beckman公司)。
1.2 方法
1.2.1 肿瘤细胞的复苏 将装有肿瘤细胞混悬液的冻存管从液氮罐中取出后直接投入设置温度为37℃的快速恒温数显水箱中，不时摇动使其融化。在超净工作台中，用750mL/L乙醇消毒冷冻管外周；打开冷冻管，用吸管吸出细胞悬液至离心管，加15mL含100mL/L胎牛血清RPMI1640完全培养基混匀，水平离心100g×10min，洗涤2次，吸弃上清；加入新鲜培养液，细胞计数板计数，使细胞最终浓度为5×105/mL，接种于培养瓶中，放至37℃含50mL/L CO2饱和湿度细胞培养箱中常规培养。第2天换液，水平离心100g×10min，继续原条件下培养，及时传代。
1.2.2 细胞培养 SKOV3、8910、TC1、CAOV和3AO 5种细胞系均置于含2mmol/L L谷氨酰胺和青、链霉素各100U/mL，100mL/L胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中，于37℃含50mL/L CO2细胞培养箱中常规培养，隔日传代，待细胞生长至对数期，用2.5g/L胰蛋白酶消化收集细胞，用PBS洗涤重悬，调整细胞浓度为1×107/mL。所有实验均用对数生长期的细胞。
1.2.3 外来体的获得 以300×g离心5min，取上清液；以800×g离心30min，去沉淀；再以10000×g离心40min，取上清液；加入Centriplus超滤离心管(100K)中，以1500×g离心1h，取浓缩液。将30g/L的蔗糖/重水垫3mL、浓缩液3mL和0.01mol/L PBS 4mL依次放入离心管中，低温下以100000×g超速离心1h。取出混有外来体的蔗糖/重水垫，0.01mol/L PBS悬浮，加入Amicon Ultra高回收率高流速切向流超滤离心管(100ku)中以1500×g离心30min，重复3次。取浓缩液用0.01mol/L PBS悬浮成5mL，为原液。置于4℃冰箱中保存备用。
1.2.4 外来体的形态观察 取20μL外来体原液滴于载样铜网上，于室温静置1min；用滤纸从侧面吸干液体，滴加20g/L磷钨酸(pH6.8)约30μL于铜网上，室温负染1min；用滤纸吸干负染液，在白炽灯下烤干后，于透射电镜下观察，并照相。
2 结果
8910、3AO细胞系培养上清液中分离出外来体，TC1、SKOV3和CAOV细胞系培养上清液中未分离出外来体。两种细胞系来源的外来体在形态和大小上无明显差别(图1a，1b)。透射电子显微镜下观察，可见具有明显异质性的圆形或椭圆形小囊泡，直径约30-90nm，有完整的包膜，内为低电子密度物质(图1a,1b)。
图1 电镜下来源于8910卵巢癌细胞系(a)和3AO卵巢癌细胞系(b)的外来体(×120000)(略)
Fig.1 Exosomes derived from 8910 ovarian cancer cell line (a) and 3AO ovarian cancer cell line (b) in electron microscopy(×120000). Exosomes were not distinct difference in morphology and diameter in two figures. They exhibited characteristic round or elliptic microvesicles ranging from 30 to 90 nm in diameter with intact membrane, in which there were low electron density substance.
3 讨论
肿瘤细胞疫苗存在下列缺点：①取材受限，必须有新鲜的、无菌的自身肿瘤；②肿瘤细胞需经外照射灭活才能使用，但不同的细胞放射敏感度不同，照射剂量难以掌握适度。照射过量，抗原性消失；照射不足，可能导致肿瘤生长；③个体之间差异较大，效果不够稳定；④病毒载体的转染效率较低，病毒自身的免疫原性和安全性也限制其应用。总之，这种瘤苗的临床应用还存在很多限制，寻找非细胞成分的特异性抗原成为肿瘤免疫治疗的关键。
自从发现外来体后，这个直径为30-90nm的膜性囊泡引起学者们极大的兴趣。外来体最初用来描述网织红细胞分泌的一种膜小泡，后来发现B细胞、肥大细胞、不成熟的树突状细胞、血小板、细胞毒性T淋巴细胞、纤维母细胞和上皮细胞也能分泌外来体\[46\]。外来体来源于细胞的多泡体(multivesicular body, MVB)，为一种复杂的胞内细胞器，由胞吞作用产生。细胞膜先内陷形成吞饮泡，吞饮泡的界膜再向内出芽，形成许多小泡，这种胞吞腔室即为MVB。胞吞的主要功能是对内化的大分子和膜蛋白进行分类，一部分MVB被转运到溶酶体降解；另一部分MVB的泡膜与质膜融合后释放小泡到胞外空间，这种小泡便是外来体\[4\]。
最近发现，肿瘤细胞也可释放外来体，这些30-90nm的小囊泡来源于具有细胞膜的晚期的多囊性的内涵体(endosomes/lysosomes)。肿瘤细胞释放外来体，不仅包含丰富的MHCⅡ分子，也有MHCI、共刺激分子\[9\]、CD63、CD82\[10\]、Hsp73、Giz、annexin、gap1、CD9、Mac1、MFGE8\[11\]、Fas和Fas配体\[1213\]，可见外来体上携带有丰富的抗原信息。进一步研究发现，肿瘤细胞释放的外来体能够包含和转移抗原给树突状细胞，提呈给T淋巴细胞，引起CTL效应\[78\]，故肿瘤源性的外来体能用于抗肿瘤的免疫治疗。
外来体作为一种非细胞成分，在治疗肿瘤方面具有可以冷冻储藏、稳定性高、体积小易清除、无繁殖能力等优点，可能具有细胞毒性效应、免疫调节、诱导凋亡和免疫耐受诱导等作用，克服了肿瘤疫苗的许多缺点。但仍需要进一步观察外来体瘤苗在不同肿瘤的生物治疗中的效果和不良反应，且对其致免疫耐受性还需要深入地研究，以探明外来体用于治疗自身免疫性疾病或防治移植排斥反应的可能性。
本研究培养了5种卵巢癌细胞株，经过高速离心、低温超速离心和超滤等方法分别从8910、3AO细胞株培养上清液中分离出外来体，透射电子显微镜下观察，可见具有明显异质性的圆形或椭圆形小囊泡，直径30 -90 nm，有完整的包膜，内为低电子密度物质。而TC1、SKOV3和CAOV细胞系培养上清液中未分离出外来体，与国外报道的外来体透射电镜下形态一致。外来体作为一种亚细胞成分，一旦获得即可长时间保存，省却了长期培养肿瘤抗原致敏DC的困难，而且实际使用中的可操作性和可控制性更强。但卵巢癌细胞株上清液中分离出来的外来体在抗原提呈过程中的作用、提呈途径及免疫治疗效果等问题还有待于进一步研究。但由于其具有诸多的优点，我们有理由相信，这种肿瘤细胞分泌的亚细胞器，作为肿瘤特异性抗原，对肿瘤的预防和治疗都有很好的研究价值，可能具有广阔的开发前景，我们将会在今后的实验中进一步研究。
参考文献：
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(编辑 邱 芬)
作者简介：李奇灵(1970)，女(汉族)，在读博士生.
(第四军医大学西京医院妇产科，陕西西安 710032；第四军医大学血液科，陕西西安 710032；吉林省公主岭卫校，吉林公主岭 136100；西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安 710061)
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