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编号:11124283
褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的神经细丝过度磷酸化的影响及机制
http://www.100md.com 李夏春 ,张军霞 ,王建枝
阿尔茨海默病;花萼海绵诱癌素;褪黑素;神经细丝;过度磷酸化
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    参见附件(357KB，4页)。

     王建枝作者简介：李夏春(1972)，女(汉族)，讲师，硕士，研究方向：褪黑素与AD样骨架蛋白磷酸化的关系.

    摘要：目的 探讨褪黑素(Mel)对花萼海绵诱癌素(CA)在成神经瘤细胞诱导的神经细丝过度磷酸化中的影响及其机制。方法 采用鼠野生型成神经瘤细胞(N2awt)，给予CA处理，或同时给予不同浓度Mel或维生素E(Vit E)处理，并用免疫印迹法检测神经细丝磷酸化水平和蛋白磷酸酯酶2A

    (PP2A)含量，32P特异底物标记技术检测PP2A活性。结果 ①CA可在N2awt细胞引起神经细丝过度磷酸化，同时伴有PP2A含量和活性降低。②Mel对CA引起的神经细丝过度磷酸化有保护作用，且强于Vit E；Mel同时对抗CA诱导的PP2A活性和含量降低。结论 Mel可通过调节细胞内PP2A的含量和活性而减轻CA引起的神经细丝过度磷酸化。

    关键词：阿尔茨海默病；花萼海绵诱癌素；褪黑素；神经细丝；过度磷酸化

    Effect of melatonin on calyculin Ainduced neurofilament hyperphosphorylationLi Xiachun1, Zhang Junxia2, Wang Jianzhi2

    (1. Department of Pathophysiology, Medical School of Three Gorge University, Yichang 443002;

    2. Department of Pathophysiology, Tongji Medical College, Huazhong University

    of Science and Technology, Wuhan 430030, China)

    ABSTRACT: Objective To investigate the in vivo effect of melatonin on calyculin Ainduced neurofilament (NF) hyperphosphorylation in neuroblastma cells (N2awt). Methods N2awt cells were treated with CA or CA and different concentration melatonin or CA and vitamin E, the levels of neurofilament phosphorylation and the level of PP2A were detected, and the activities of PP2A were assayed. Results Calyculin A treatment led to neurofilament hyperphosphorylation by decreasing the level and activity of PP2A. Both melatonin and vitamin E had protective effect on calyculin Ainduced neurofilament hyperphosphorylation, although melatonin increased the activity of PP2A while vitamin E did not. Morever, melatonin partially attenuated the decreasing of PP2A level. Conclusion Melatonin protects neuroblastma cells from CAinduced neurofilament hyperphosphorylation through the regulation of PP2A level and the increase of PP2A activity.

    KEY WORDS: Alzheimers disease; calyculin A; melatonin; neurofilament; hyperphosphorylation

    阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)是一种以进行性记忆减退和认知功能障碍为主要临床症状的神经退行性疾病，神经原纤维缠结 (neurofibrillary tangles, NFTs) 是其主要病理特征之一。NFTs主要由异常过度磷酸化的tau蛋白构成，tau蛋白作为细胞内的主要骨架蛋白，对微管组装、维持微管稳定性都具有重要作用。神经细丝(neurofilament，NF)是骨架蛋白中的中间丝，由低(NFL)、中(NFM)、高(NFH)分子量的三种亚基组成，它与微管、微管相关蛋白(包括tau蛋白在内)等其他骨架蛋白存在广泛的相互作用，并共同维持着细胞骨架的正常结构。Nancy 等证实异常过度磷酸化的神经细丝也是NFTs的重要组成成分，因此其在AD发病机制中的作用也日益受到重视。褪黑素(melatonin，Mel)是由松果体分泌的一种具有多种生物学功能的内分泌激素，随着年龄的增长其分泌量逐渐下降。研究发现AD患者脑脊液中Mel的水平显著低于同年龄正常人群，临床上AD患者给予Mel后，可以改善某些患者的认知功能。因此，Mel分泌紊乱在AD的发病过程中可能起重要作用。最近有人报道，Mel可阻断或逆转冈田酸(okadaic acid, OA)在神经瘤细胞(N1E115)引起的氧化应激、细胞凋亡和微管破坏。我们曾报道Mel可对抗花萼海绵诱癌素(calyculin A, CA)在SY5Y细胞引起的神经细丝过度磷酸化。为进一步研究Mel对抗CA引起的神经细丝过度磷酸化的机制，我们分别用Mel和维生素E(vitamin E, Vit E)与CA同时处理成神经瘤细胞N2awt，用免疫印迹法检测神经细丝磷酸化水平和PP2A含量，免疫标记技术检测PP2A活性。结果发现Mel和Vit E可对抗CA引起的神经细丝过度磷酸化，同时Mel对抗CA引起的PP2A活性降低和含量降低。本实验进一步揭示了Mel和Vit E对抗CA诱导的神经细丝磷酸化的机制。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂 DMEM、OptiMEM、胎牛血清(FBS)购自美国Gibico公司；丙烯酰胺(Arc)、N，N亚甲叉双丙烯酰胺(Bis)、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸(Glycine)、小牛血清白蛋白(BSA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、Mel、Vit E均为美国Sigma公司产品；过硫酸铵(AP)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自美国Pierce公司；硝酸纤维素膜(NC膜)为 Hybond公司产品；单克隆抗体SMI31(识别磷酸化的NFH、NFM，1∶5000)、SMI32(识别非磷酸化的NFH、NFM，1∶5000)、R123d(识别PP2A的催化亚单位，1∶1500)购自Sternberger公司，所用抗体稀释液为50g/L脱脂奶粉，TBS/T配制；辣根过氧化物酶标记的二抗和ECL显色系统购自Santa Cruz公司；CA购自美国Biochemical公司；γ32PATP购自北京亚辉生物医药公司。

    1.2 细胞培养 鼠野生型成神经瘤细胞贴壁生长细胞株(N2awt)由许华熙教授(The Burnham Institute, La Jolla, California, USA)提供，细胞用含50g/L胎牛血清(FBS)的DMEM/OptiMEM(1∶1)培养基，在5%(体积分数)CO2、37℃培养箱内进行培养，每2-3d更换培养液一次，细胞达约70%-80%丰度时，传代或用于实验。给药处理前，细胞用无血清培养基培养12h诱导分化。细胞分为6组：正常对照组，加入含DMSO(<0.01%体积分数)的培养基；CA组，加入5nmol/L CA；25mol/L Mel组，加入5nmol/L CA同时加入25μmol/L Mel；50μmol/L Mel组，加入5nmol/L CA同时加入50μmol/L Mel；100μmol/L Mel组，加入5nmol/L CA同时加入100μmol/L Mel；Vit E组，加入5nmol/L CA同时加入50μmol/L Vit E。

    1.3 蛋白质印迹分析 按上述分组加药处理细胞12h后，弃培养基，预冷的PBS洗2次，加入细胞裂解液90μL(50mmol/L TrisCl pH8.0，150mmol/L NaCl, 10mL/L Triton，1g/L SDS，0.2g/L NaN3，100mg/L PMSF，1mg/L aprotinin，PMSF和aprotinin临用前加入)，在冰上静置10min，用细胞刮刮起细胞并转移到EP管中，加入4×加样缓冲液30μL，煮沸10min，超声破碎(3×5s)，12000g离心10min，取上清。取样品加入各个泳道(保证各泳道加入的样品蛋白总量为10μg)，蛋白质经7.5% SDSPAGE凝胶电泳分离后被转移至NC膜上；NC膜用50g/L脱脂牛奶室温封闭1h，分别加入单克隆抗体SMI31、SMI32，R123d，4℃孵育过夜，然后用含1g/LTween20的 TBS(TTBS)漂洗(3×5min)；再加入适当稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育1h，TTBS漂洗(3×5min)；加入ECL显色液，显色1min，终止显色并将胶片置于NC膜上，在暗室里曝光30s，免疫印迹结果扫描后用图象分析系统分析。

    1.4 PP2A活性测定 按照Gong等的方法。在磷酸化缓冲液(单位：mmol/L，TrisHCl 40、pH 8.5, βME 20，CaCl2 0.2，MgCl215)中，磷酸化酶b(Phb，2g/L)和0.5mmol/L 32PATP 及10mg/L磷酸化酶激酶(PhK)，在30℃孵育10min后，Phb被磷酸化为Pha并有一部分被32P标记；32P标记的磷酸化酶a(32PPha)经Sephadex G50柱与游离ATP(Free32P)分离，收集组分中32P Pha的放射性/(Free32P的放射性+32P Pha的放射性)×100%>95%作为PP2A的底物。PP2A 催化32PPha释放出32P，根据\[32P\]的释放量可判定PP2A的活性。反应体系总体积20μL， 含Tris 50mmol/L、pH 7.0，BME 10mmol/L，EDTA 0.1mmol/L，caffeine 7.5mmol/L，7.5mg/L 32PPha和0.06g/L细胞提取物及0.2g/L抑制因子1(PP1的特异性抑制剂)，反应以加入32P Pha开始，30℃进行30min，加入10μL终止液(4mmol/L ATP、200g/L 三氯乙酸溶解)终止反应，取7μL反应混合物点到层析纸上，释放出的32P在50g/L三氯乙酸(0.2mol/L NaCl溶解)层析液中通过上行色谱法与底物分离。然后用Cerenkov 液闪仪进行闪烁计数分析。

    1.5 统计学处理 实验数据以±s表示，采用SPSS 10.0统计分析软件行方差分析，以P<0.05为差异有显著性。

    2 结 果

    2.1 Mel和Vit E对CA诱导的神经细丝磷酸化的影响 本研究用识别磷酸化的神经细丝(NFH，NFM)的抗体SMI31和识别非磷酸化的神经细丝(NFH，NFM)的抗体检测神经细丝的磷酸化状态。神经细丝的免疫印迹结果显示：CA处理后SMI31显色显著增强(图1A)，而SMI32显色显著减弱(图1B)；25、50、100μmol/L Mel和Vit E使SMI31显色减弱(图1A)，SMI32显色增强(图1B)。图象分析结果进一步显示：Mel在50μmol/L时对神经细丝的磷酸化的保护作用最强，且比同浓度的Vit E的作用更强。结果提示CA处理12h后N2awt细胞的神经细丝发生了磷酸化，Mel和Vit E对CA诱导的神经细丝的磷酸化有保护作用。图1 Mel和Vit E对CA诱导的神经细丝磷酸化的影响(略)

    2.2 Mel和Vit E对CA引起的PP2A活性变化的影响 我们以前报道了Mel对OA和CA引起的神经细丝的过度磷酸化都有保护作用\[4,7\]，因此我们推测Mel对骨架蛋白磷酸化的保护作用可能与其升高PP2A活性有关。为了进一步探讨Mel 对CA引起的神经细丝过度磷酸化的保护机制，我们用32P特异底物标记技术检测PP2A活性。结果显示：CA组细胞内PP2A活性与正常对照组相比显著降低(P<0.01)；25、50、100μmol/L Mel处理组的PP2A活性与CA组相比均显著升高(P<0.01)，但随Mel浓度升高，PP2A活性升高程度降低；Vit E组的PP2A活性与CA组相比显著降低(P<0.01)。结果提示低、中、高浓度Mel对CA诱导的PP2A活性降低均有保护作用，而Vit E对之无保护作用(图2)。图2 Mel和Vit E对CA诱导的PP2A活性降低的影响(略)

    2.3 Mel和Vit E对CA引起的细胞内PP2A含量的影响 为进一步探讨Mel对抗CA引起的PP2A活性降低的机制。我们用识别PP2A的单克隆抗体R123d检测细胞内PP2A含量。结果发现：CA组的R123d显色较正常对照组减弱(P<0.01)；25μmol/L Mel组和50μmol/L Mel组的R123d显色强于CA组(P<0.01)；100μmol/L Mel组和 Vit E组的R123d显色与CA组相比无统计学差异(P>0.05)。结果表明CA显著降低细胞内PP2A水平，25、50μmol/L Mel可部分对抗CA引起的细胞内PP2A水平降低(图3)。 图3 Mel和Vit E对CA诱导的PP2A含量降低的影响(略)

    3 讨 论

    我国学者曾报道AD患者脑和脑脊液中磷酸化的NFH和NFM水平显著升高， PP2A和PP1的特异性抑制剂OA处理人神经瘤细胞SY5Y后，细胞出现了相似的结果。最近，我们发现PP 2A和

    PP1的另一种抑制剂CA处理SY5Y细胞也可引起神经细丝过度磷酸化。在本实验中，我们发现CA处理N2awt细胞后，细胞内神经细丝发生过度磷酸化， PP2A含量显著降低，但PP2A活性轻度降低。我们曾报道CA处理后，细胞内出现明显的氧化应激和脂质过氧化，同时细胞内GSK3活性显著升高。根据报道，脂质过氧化产物可激活GSK3引起tau蛋白过度磷酸化，我们认为CA引起神经细丝过度磷酸化的机理不仅与其降低PP2A含量和PP2A活性有关，而且还与其促进氧化应激有关。

    Mel既具有脂溶性，也具有水溶性，容易通过血脑屏障进入神经细胞。研究表明，Mel可逆转或阻断OA引起的氧化应激、细胞凋亡、骨架蛋白破坏。在本实验中，我们发现低、中、高浓度Mel均可部分对抗CA引起的神经细丝过度磷酸化，但高浓度Mel的对抗作用比低、中浓度的作用弱；同时，Mel还可升高PP2A活性，但随Mel浓度升高，其升高PP2A活性的作用减弱；Vit E虽降低PP2A活性，但也可部分对抗CA诱导的神经细丝过度磷酸化。我们推测其可能原因为：Vit E部分对抗CA引起的氧化应激和脂质过氧化，从而对抗CA引起的GSK3活性升高；同时Vit E降低PP2A活性，又使Ser9磷酸化的GSK3去磷酸化减少，从而Ser9磷酸化的GSK3占总GSK3的比例升高，GSK3活性低于正常，进而恢复GSK3/PP2A平衡，对抗CA引起的神经细丝过度磷酸化。具体机制尚需进一步实验证明。

    总之，本研究证明Mel对CA所致的神经细丝过度磷酸化有保护作用，其机制可能与Mel对抗CA诱导的PP2A含量及活性降低有关。

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    1. 三峡大学医学院病理生理教研室，湖北宜昌 443002；

    2. 华中科技大学同济医学院病理生理教研室，湖北武汉 430030

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