自制多聚胺阳离子脂质体转染效率及细胞毒性的评价
Evaluation of transfection efficiency and cytotoxicity of selfprepared polyamine cationic liposome
SUN RuiLin, JIN FaGuang, WU DaoCheng, WU Hong, LIU Bin, WEN DeSheng
Department of Respiratory Diseases, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038, China, Department of Chemistry, School of Pharmacy,Fourth Military Medical University, Xian 710032, China, Department of Oral Biology, Stomatological Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China, School of Life Science & Information, Xian Jiaotong University, Xian 710049, China
【Abstract】 AIM: To evaluate the transfection efficiency and cytotoxicity of polyamine cationic liposome(PCL)prepared by ourselves.METHODS: PCL with polyamine cationic lipids TCChol and neutral phospholipid DOPE at a molar ratio of 3∶1 was prepared, and PCL or Lipofectamine 2000 (as control) mediated by the plasmid PIRES2EGFP was transfected into HeLa cells or Hep2 cells, and the expression of EGFP was determined by fluorescence microscope.The survival fraction was determined by MTT to evaluate the transfection efficiency and cytotoxicity after transfection. RESULTS: The transfection efficiency of PCL prepared with TCChol and DOPE at a molar ratio of 3∶1 was a few lower than that of Lipofectamine 2000, but the cytotoxicity of the former was less than the latter. CONCLUSION: PCL has a sound transfection activity and less cytotoxicity compared with Lipofectamine 2000.It is shown to be promising for gene transfection and gene therapy.
【Keywords】 polyamine cationic liposome; preparation; transfect
【摘要】 目的： 评估制备的多聚胺阳离子脂质体转染哺乳动物细胞的转染效率及细胞毒性. 方法： 多聚胺阳离子脂质TCChol与中性磷脂DOPE以3∶1摩尔比，制备多聚胺阳离子脂质体，通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2EGFP入HeLa细胞, Hep2细胞，倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达，通过MTT法，检测细胞存活分数，并以Lipofectamine2000为对照，评价制备阳离子脂质体转染效率及细胞毒性. 结果： 多聚胺阳离子脂质体转染效率略低于Lipofectamine 2000，但细胞毒性较低,为一种相对高效低毒的阳离子脂质体. 结论： 多聚胺阳离子脂质体为一种相对高效低毒的阳离子脂质体，在基因转染和基因治疗方面具有较广阔的前景.
【关键词】 多聚胺阳离子脂质体；制备；转染
0引言
基因治疗能否成功最重要的影响因素是基因转染载体. 阳离子脂质体能与目的基因以静电作用相结合，可携带的外源基因容量较大, 且不含抗原成分，细胞毒性低，可被机体降解，能多次反复转染，因此成为一种有临床应用潜力的基因转染载体[1]. 多聚胺阳离子脂质体 (polyamine cationic liposome, PCL) 易与核酸形成静电复合物而自由通过亲脂性膜，因此，是阳离子脂质体中效果较好的核酸运载载体[2]. 本研究旨在以Invitrogen公司阳离子脂质体Lipofectamine2000为对照，转染带有增强型绿色荧光蛋白EGFP质粒PIRES2EGFP入HeLa细胞或Hep2细胞，通过荧光显微镜观察报告基因的表达，评价PCL的转染效率，通过MTT法检测细胞存活分数，评价自制PCL的细胞毒性.
1材料和方法
1.1材料TCChol(Sigma)， 二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE(Sigma)， Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，质粒PIRES2EGFP，感受态细胞DH5α均由我校免疫教研室杨安钢教授惠赠，质粒微量抽提试剂盒(安徽优晶生物工程有限公司)，DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(天津TBD)，24孔培养板(Orange)，96孔培养板(Orange)，MTT(Amresco).
1.2方法
1.2.1PCL的制备[3-4]TCChol溶于适量氯仿后，分别与DOPE以1∶1，3∶1摩尔比混合， 在茄形瓶中振荡摇匀使形成一层薄膜，真空除去有机溶剂，同时加Hepes(pH 7.8)，水浴超声约5～10 min制备PCL，透射电镜检测后4℃保存.
1.2.2质粒DNA提取与纯化[5]质粒PIRES2EGFP转化感受态细胞DH5α, 37℃, 200 r/min摇菌过夜，质粒微量抽提试剂盒提取质粒，取少许稀释后，紫外分光光度计，以洗脱液为调零孔，测量A230 nm, A260 nm，A280 nm，以A260 nm/A230 nm>1.5, 1.8≤A260 nm/A280 nm≤2.0为合格质粒，-20℃保存备用.
1.2.3体外细胞转染[6-7]转染前1 d，胰酶消化HeLa细胞，Hep2细胞并计数，按1~2×105/孔接种于24孔培养板中，置37℃, 50 mL/L孵箱中培养使其在转染日密度为80%. 对于每孔细胞，使用50 μL无血清DMEM培养基稀释0.8 μg质粒，按照脂质体与质粒不同质量比分别用50 μL无血清DMEM培养基稀释阳离子脂质体，每组4孔，在10 min内同稀释的质粒混合并静置30 min，形成PCL/DNA复合物，Lipofectamine2000/DNA复合物. 用滴管吸去含血清培养基，用无血清DMEM培养基漂洗细胞2次,替换为0.6 mL无血清培养基, 分别将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀以使复合物充分散开. 在37℃，50 mL/L的CO2中孵育，5 h后换含100 mL/L胎牛血清DMEM培养液.
1.2.4基因转染效率测定转染后48 h，倒置荧光显微镜(OlympusIX71) 检测EGFP表达并计算转染效率： 将转染后的细胞调整细胞密度100～200×107/L之间，2.5 g/L胰酶消化，血球计数板普通视野下计细胞数A，换荧光下相同视野计荧光细胞数a，计算转染效率(转染效率＝a/A×100%).
1.2.5细胞毒性检测MTT试验转染后12 h将各孔细胞分别吸出，按1×104/孔传至96孔培养板，至48 h每孔加入5 g/L MTT, 37℃，50 mL/L的CO2中继续孵育4 h后将上清液吸弃并加入 DMSO，以无血清 DMEM 为调零孔，以未转染细胞为对照组，酶联免疫检测仪测A490 nm，并计算细胞存活分数(细胞存活分数＝转染细胞A/对照组细胞A×100%).
统计学处理： 采用SPSS11.0软件进行统计学分析，数据均以x±s表示，组间比较采用成组t检验，P<0.05表示有统计学差异.
2结果
2.1转染效率评价
2.1.1PCL转染HeLa细胞、Hep2细胞后48 h荧光显微镜观察(图1).
A： PCL转染HeLa细胞后48 h；B： PCL转染Hep2细胞后48 h；C： Lipofectamine 2000转染HeLa细胞后48 h；D： Lipofectamine 2000转染Hep2细胞后48 h.
图1PCL或Lipofectamine 2000转染PIRES2EGFP入HeLa细胞或Hep2细胞×10(略)
2.1.2分别比较PCL与Lipofectamine 2000转染HeLa细胞，Hep2细胞48 h后转染效率，结果表明，PCL转染效率略低于Lipofectamine 2000(P<0.05，图2).
aP<0.05 vs Lipofectamine2000组.
图2PCL, Lipofectamine 2000转染PIRES2EGFP入HeLa细胞、Hep2细胞转染效率比较(略)
2.2细胞毒性评价MTT法分别比较PCL，Lipofectamine 2000转染HeLa细胞48 h后存活分数，分别为(87.4±4.6)%，(70.3±3.0)%，经统计学分析，二者有显著性差异(P<0.05)；检测PCL, Lipofectamine2000转染后Hep2细胞48 h后存活分数分别为(88.2±3.5)%, (69.4±4.3)%, 经统计学分析，二者有显著性差异(P<0.05). 结果表明，PCL细胞毒性低于Lipofectamine 2000.
3讨论
影响基因转染效率的因素很多[3]，包括细胞种类，转染时间，载体结构，脂质体/DNA复合物内部净电荷数量[8]，脂质体粒径大小等方面，此外Li等[9]认为脂质体DNA复合物中两者比例对基因转染效率也有重要的影响. 我们在前期试验中制备四种PCL，并按照PCL与DNA 的不同质量比，通过转染质粒PIRES2EGFP入HeLa细胞，检测转染后不同时间的转染效率和细胞存活分数，发现转染后48 h，转染效率最高，阳离子脂质体与DNA结合比例为3～4∶1时，同时筛选出相对高效低毒PCL.
本研究利用前期制备并筛选出的PCL，采用前期实验筛选的PCL与DNA比例，转染时间等参数，通过转染携带绿色荧光蛋白报告基因的质粒PIRES2EGFP进入HeLa细胞，Hep2细胞，通过荧光显微镜检测EGFP的表达，反映PCL的转染效率，研究发现，本实验制备的PCL转染效率略低于Lipofectamine2000.
转染HeLa细胞、Hep2细胞，前者转染效率较高，其机制尚不清楚，考虑可能与细胞摄取能力有关，但尚不能认为HeLa细胞摄取任何脂质体的能力均强于Hep2细胞. 通过MTT法检测细胞存活分数，实验发现，转染后48 h, PCL组较Lipofectamie 2000组表现出较小的细胞毒性，考虑PCL同Lipofectamine 2000相比，其疏水基团前者为胆固醇，后者为两条长链脂肪酸链，而胆固醇成分同细胞膜结构成分类似有关，因此细胞毒性较小. 同时有学者报道，多聚胺胆固醇阳离子脂质以胆固醇基团替代两条长链脂肪酸后，从而亲水基团与胆固醇基团形成“T”空间结构[3]， 且与DNA形成的复合物更稳定[10]，从而提高由其组成的载体的转染效率.
综上所述，本实验中成功制备的PCL[TCChol∶DOPE 3∶1(摩尔比)]具有转染效率较高，细胞毒性较小的特点，在基因治疗方面具有广阔的应用前景.
【参考文献】
[1] Ropert C.Liposomes as a gene delivery system[J]. Braz J Med Biol Res, 1999,32(2):163-169.
[2] Lee ER, Marshall J, Siegel CS, et al. Detailed analysis of structures and formulations of cationic lipids for high efficient gene transfer to the lung[J]. Hum Gene Ther, 1996,7(14):1701-1717.
[3] Judith K, Guy C, Veeraiah B, et al. Novel polyaminolipids enhance the cellular uptake of oligonucleotides[J]. J Biol Chem, 1995,270:31391-31396.
[4] Xiang G, Leaf H. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,1991,179:280-285.
[5] J.萨姆布鲁克，E.F. 弗里奇，T. 曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南[M]. 2版. 北京： 科学出版社，1992：16-19.
[6] Choi JS, Lee EJ, Jang HS, et al. New cationic liposomes for gene transfer into mammalian cells with high efficiency and low toxicity[J]. Bio Chem, 2001, 12:108-113.
[7] Kim YJ, Kim TW, Chung H, et al. The effects of serum on the stability and the transfection activity of the cationic lipid emulsion with various oils[J]. Int J Pharm, 2003,252(12):241-252.
[8] 韩一生，胡蕴玉，金格乐，等.脂质体介导下重组pcDNA3Hbmp3转染兔关节软骨细胞的条件[J].第四军医大学学报，2001,22(11):987-990.
[9] Li W, Ishida T, Okada Y, et al. Increased gene expression by cationic liposomes(TFL3)in lung metastases following intravenous injection[J]. Biol Pham Bull,2005,28(4):701-706.
[10] F Natali, C Castellano, D Pozzi, et al. Dynamic properties of an oriented lipid/DNA complex studied by neutron scattering[J]. Biophys J, 2005,88(2):1081-1090.
编辑袁天峰
基金项目：陕西省社会发展计划项目(2003K10G55)
(第四军医大学： 唐都医院呼吸科，陕西 西安 710038， 药学系化学教研室， 口腔医院生物教研室，陕西 西安 710033， 西安交通大学生命信息学院，陕西 西安 710049), 百拇医药(孙瑞琳，金发光，吴道澄，吴红，刘彬，温德升)
SUN RuiLin, JIN FaGuang, WU DaoCheng, WU Hong, LIU Bin, WEN DeSheng
Department of Respiratory Diseases, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038, China, Department of Chemistry, School of Pharmacy,Fourth Military Medical University, Xian 710032, China, Department of Oral Biology, Stomatological Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China, School of Life Science & Information, Xian Jiaotong University, Xian 710049, China
【Abstract】 AIM: To evaluate the transfection efficiency and cytotoxicity of polyamine cationic liposome(PCL)prepared by ourselves.METHODS: PCL with polyamine cationic lipids TCChol and neutral phospholipid DOPE at a molar ratio of 3∶1 was prepared, and PCL or Lipofectamine 2000 (as control) mediated by the plasmid PIRES2EGFP was transfected into HeLa cells or Hep2 cells, and the expression of EGFP was determined by fluorescence microscope.The survival fraction was determined by MTT to evaluate the transfection efficiency and cytotoxicity after transfection. RESULTS: The transfection efficiency of PCL prepared with TCChol and DOPE at a molar ratio of 3∶1 was a few lower than that of Lipofectamine 2000, but the cytotoxicity of the former was less than the latter. CONCLUSION: PCL has a sound transfection activity and less cytotoxicity compared with Lipofectamine 2000.It is shown to be promising for gene transfection and gene therapy.
【Keywords】 polyamine cationic liposome; preparation; transfect
【摘要】 目的： 评估制备的多聚胺阳离子脂质体转染哺乳动物细胞的转染效率及细胞毒性. 方法： 多聚胺阳离子脂质TCChol与中性磷脂DOPE以3∶1摩尔比，制备多聚胺阳离子脂质体，通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2EGFP入HeLa细胞, Hep2细胞，倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达，通过MTT法，检测细胞存活分数，并以Lipofectamine2000为对照，评价制备阳离子脂质体转染效率及细胞毒性. 结果： 多聚胺阳离子脂质体转染效率略低于Lipofectamine 2000，但细胞毒性较低,为一种相对高效低毒的阳离子脂质体. 结论： 多聚胺阳离子脂质体为一种相对高效低毒的阳离子脂质体，在基因转染和基因治疗方面具有较广阔的前景.
【关键词】 多聚胺阳离子脂质体；制备；转染
0引言
基因治疗能否成功最重要的影响因素是基因转染载体. 阳离子脂质体能与目的基因以静电作用相结合，可携带的外源基因容量较大, 且不含抗原成分，细胞毒性低，可被机体降解，能多次反复转染，因此成为一种有临床应用潜力的基因转染载体[1]. 多聚胺阳离子脂质体 (polyamine cationic liposome, PCL) 易与核酸形成静电复合物而自由通过亲脂性膜，因此，是阳离子脂质体中效果较好的核酸运载载体[2]. 本研究旨在以Invitrogen公司阳离子脂质体Lipofectamine2000为对照，转染带有增强型绿色荧光蛋白EGFP质粒PIRES2EGFP入HeLa细胞或Hep2细胞，通过荧光显微镜观察报告基因的表达，评价PCL的转染效率，通过MTT法检测细胞存活分数，评价自制PCL的细胞毒性.
1材料和方法
1.1材料TCChol(Sigma)， 二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE(Sigma)， Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，质粒PIRES2EGFP，感受态细胞DH5α均由我校免疫教研室杨安钢教授惠赠，质粒微量抽提试剂盒(安徽优晶生物工程有限公司)，DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(天津TBD)，24孔培养板(Orange)，96孔培养板(Orange)，MTT(Amresco).
1.2方法
1.2.1PCL的制备[3-4]TCChol溶于适量氯仿后，分别与DOPE以1∶1，3∶1摩尔比混合， 在茄形瓶中振荡摇匀使形成一层薄膜，真空除去有机溶剂，同时加Hepes(pH 7.8)，水浴超声约5～10 min制备PCL，透射电镜检测后4℃保存.
1.2.2质粒DNA提取与纯化[5]质粒PIRES2EGFP转化感受态细胞DH5α, 37℃, 200 r/min摇菌过夜，质粒微量抽提试剂盒提取质粒，取少许稀释后，紫外分光光度计，以洗脱液为调零孔，测量A230 nm, A260 nm，A280 nm，以A260 nm/A230 nm>1.5, 1.8≤A260 nm/A280 nm≤2.0为合格质粒，-20℃保存备用.
1.2.3体外细胞转染[6-7]转染前1 d，胰酶消化HeLa细胞，Hep2细胞并计数，按1~2×105/孔接种于24孔培养板中，置37℃, 50 mL/L孵箱中培养使其在转染日密度为80%. 对于每孔细胞，使用50 μL无血清DMEM培养基稀释0.8 μg质粒，按照脂质体与质粒不同质量比分别用50 μL无血清DMEM培养基稀释阳离子脂质体，每组4孔，在10 min内同稀释的质粒混合并静置30 min，形成PCL/DNA复合物，Lipofectamine2000/DNA复合物. 用滴管吸去含血清培养基，用无血清DMEM培养基漂洗细胞2次,替换为0.6 mL无血清培养基, 分别将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀以使复合物充分散开. 在37℃，50 mL/L的CO2中孵育，5 h后换含100 mL/L胎牛血清DMEM培养液.
1.2.4基因转染效率测定转染后48 h，倒置荧光显微镜(OlympusIX71) 检测EGFP表达并计算转染效率： 将转染后的细胞调整细胞密度100～200×107/L之间，2.5 g/L胰酶消化，血球计数板普通视野下计细胞数A，换荧光下相同视野计荧光细胞数a，计算转染效率(转染效率＝a/A×100%).
1.2.5细胞毒性检测MTT试验转染后12 h将各孔细胞分别吸出，按1×104/孔传至96孔培养板，至48 h每孔加入5 g/L MTT, 37℃，50 mL/L的CO2中继续孵育4 h后将上清液吸弃并加入 DMSO，以无血清 DMEM 为调零孔，以未转染细胞为对照组，酶联免疫检测仪测A490 nm，并计算细胞存活分数(细胞存活分数＝转染细胞A/对照组细胞A×100%).
统计学处理： 采用SPSS11.0软件进行统计学分析，数据均以x±s表示，组间比较采用成组t检验，P<0.05表示有统计学差异.
2结果
2.1转染效率评价
2.1.1PCL转染HeLa细胞、Hep2细胞后48 h荧光显微镜观察(图1).
A： PCL转染HeLa细胞后48 h；B： PCL转染Hep2细胞后48 h；C： Lipofectamine 2000转染HeLa细胞后48 h；D： Lipofectamine 2000转染Hep2细胞后48 h.
图1PCL或Lipofectamine 2000转染PIRES2EGFP入HeLa细胞或Hep2细胞×10(略)
2.1.2分别比较PCL与Lipofectamine 2000转染HeLa细胞，Hep2细胞48 h后转染效率，结果表明，PCL转染效率略低于Lipofectamine 2000(P<0.05，图2).
aP<0.05 vs Lipofectamine2000组.
图2PCL, Lipofectamine 2000转染PIRES2EGFP入HeLa细胞、Hep2细胞转染效率比较(略)
2.2细胞毒性评价MTT法分别比较PCL，Lipofectamine 2000转染HeLa细胞48 h后存活分数，分别为(87.4±4.6)%，(70.3±3.0)%，经统计学分析，二者有显著性差异(P<0.05)；检测PCL, Lipofectamine2000转染后Hep2细胞48 h后存活分数分别为(88.2±3.5)%, (69.4±4.3)%, 经统计学分析，二者有显著性差异(P<0.05). 结果表明，PCL细胞毒性低于Lipofectamine 2000.
3讨论
影响基因转染效率的因素很多[3]，包括细胞种类，转染时间，载体结构，脂质体/DNA复合物内部净电荷数量[8]，脂质体粒径大小等方面，此外Li等[9]认为脂质体DNA复合物中两者比例对基因转染效率也有重要的影响. 我们在前期试验中制备四种PCL，并按照PCL与DNA 的不同质量比，通过转染质粒PIRES2EGFP入HeLa细胞，检测转染后不同时间的转染效率和细胞存活分数，发现转染后48 h，转染效率最高，阳离子脂质体与DNA结合比例为3～4∶1时，同时筛选出相对高效低毒PCL.
本研究利用前期制备并筛选出的PCL，采用前期实验筛选的PCL与DNA比例，转染时间等参数，通过转染携带绿色荧光蛋白报告基因的质粒PIRES2EGFP进入HeLa细胞，Hep2细胞，通过荧光显微镜检测EGFP的表达，反映PCL的转染效率，研究发现，本实验制备的PCL转染效率略低于Lipofectamine2000.
转染HeLa细胞、Hep2细胞，前者转染效率较高，其机制尚不清楚，考虑可能与细胞摄取能力有关，但尚不能认为HeLa细胞摄取任何脂质体的能力均强于Hep2细胞. 通过MTT法检测细胞存活分数，实验发现，转染后48 h, PCL组较Lipofectamie 2000组表现出较小的细胞毒性，考虑PCL同Lipofectamine 2000相比，其疏水基团前者为胆固醇，后者为两条长链脂肪酸链，而胆固醇成分同细胞膜结构成分类似有关，因此细胞毒性较小. 同时有学者报道，多聚胺胆固醇阳离子脂质以胆固醇基团替代两条长链脂肪酸后，从而亲水基团与胆固醇基团形成“T”空间结构[3]， 且与DNA形成的复合物更稳定[10]，从而提高由其组成的载体的转染效率.
综上所述，本实验中成功制备的PCL[TCChol∶DOPE 3∶1(摩尔比)]具有转染效率较高，细胞毒性较小的特点，在基因治疗方面具有广阔的应用前景.
【参考文献】
[1] Ropert C.Liposomes as a gene delivery system[J]. Braz J Med Biol Res, 1999,32(2):163-169.
[2] Lee ER, Marshall J, Siegel CS, et al. Detailed analysis of structures and formulations of cationic lipids for high efficient gene transfer to the lung[J]. Hum Gene Ther, 1996,7(14):1701-1717.
[3] Judith K, Guy C, Veeraiah B, et al. Novel polyaminolipids enhance the cellular uptake of oligonucleotides[J]. J Biol Chem, 1995,270:31391-31396.
[4] Xiang G, Leaf H. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,1991,179:280-285.
[5] J.萨姆布鲁克，E.F. 弗里奇，T. 曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南[M]. 2版. 北京： 科学出版社，1992：16-19.
[6] Choi JS, Lee EJ, Jang HS, et al. New cationic liposomes for gene transfer into mammalian cells with high efficiency and low toxicity[J]. Bio Chem, 2001, 12:108-113.
[7] Kim YJ, Kim TW, Chung H, et al. The effects of serum on the stability and the transfection activity of the cationic lipid emulsion with various oils[J]. Int J Pharm, 2003,252(12):241-252.
[8] 韩一生，胡蕴玉，金格乐，等.脂质体介导下重组pcDNA3Hbmp3转染兔关节软骨细胞的条件[J].第四军医大学学报，2001,22(11):987-990.
[9] Li W, Ishida T, Okada Y, et al. Increased gene expression by cationic liposomes(TFL3)in lung metastases following intravenous injection[J]. Biol Pham Bull,2005,28(4):701-706.
[10] F Natali, C Castellano, D Pozzi, et al. Dynamic properties of an oriented lipid/DNA complex studied by neutron scattering[J]. Biophys J, 2005,88(2):1081-1090.
编辑袁天峰
基金项目：陕西省社会发展计划项目(2003K10G55)
(第四军医大学： 唐都医院呼吸科，陕西 西安 710038， 药学系化学教研室， 口腔医院生物教研室，陕西 西安 710033， 西安交通大学生命信息学院，陕西 西安 710049), 百拇医药(孙瑞琳，金发光，吴道澄，吴红，刘彬，温德升)