1.2.3 连接至pMD18-T载体(大连宝生物公司)
① 连接PCR产物4 μL,pMD18-T Vector 1μL,Ligase Buffer 5 μL,16℃ 8 h。
② 转化：取出冻存的DH5α(200 μL/Tube)，冰中溶解,取5 μL连接液加入菌液中，轻轻混匀,冰浴30 min,42℃ 1.5 min,冰浴2 min,加入500 μL LB 37℃ 100 rpm 45 min,取200 μL涂布至Amp板(100 μg/mL),37℃倒置培养过夜，至克隆长出。
③ 扩增：取单克隆至3 mL Amp/LB中，37℃ 250 rpm，过夜。
④ 质粒抽提(V-gene 质粒抽提Kit)：质粒量为100 ng/μL。
1.2.4 测序 由测序结果可知T/A克隆序列正确(BigDye Mix，PE公司产品，测序引物为M13-F)。测序结果如下：
CTATAGAATNCAAGTTCAANGGCGAACTCTAGA
GATTatagccaggcagaaggtgagggatgcagaaaaacagtatgaaaaggatc
cagatgagttgaacaagagaacattaactgaccgagTgggcgttgcagtatctatc
caggcaaaaattgatgagttaaaaaggcaactggcagataggattgcaAATCG
TCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCG
TTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTAC
CCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCC
AGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGC
CCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGC
GCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGT
ATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCT
GCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACA
① 连接PCR产物4 μL,pMD18-T Vector 1μL,Ligase Buffer 5 μL,16℃ 8 h。
② 转化：取出冻存的DH5α(200 μL/Tube)，冰中溶解,取5 μL连接液加入菌液中，轻轻混匀,冰浴30 min,42℃ 1.5 min,冰浴2 min,加入500 μL LB 37℃ 100 rpm 45 min,取200 μL涂布至Amp板(100 μg/mL),37℃倒置培养过夜，至克隆长出。
③ 扩增：取单克隆至3 mL Amp/LB中，37℃ 250 rpm，过夜。
④ 质粒抽提(V-gene 质粒抽提Kit)：质粒量为100 ng/μL。
1.2.4 测序 由测序结果可知T/A克隆序列正确(BigDye Mix，PE公司产品，测序引物为M13-F)。测序结果如下：
CTATAGAATNCAAGTTCAANGGCGAACTCTAGA
GATTatagccaggcagaaggtgagggatgcagaaaaacagtatgaaaaggatc
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caggcaaaaattgatgagttaaaaaggcaactggcagataggattgcaAATCG
TCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCG
TTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTAC
CCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCC
AGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGC
CCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGC
GCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGT
ATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCT
GCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACA