国内外关于周围神经损伤的若干研究方法
周围神经损伤动物模型
周围神经损伤动物模型
长度
1. 0cm
模型制作
用1%戊巴比妥钠麻醉（60mg/kg）。在鼠股后外侧区行纵形切口，自股二头肌与半腱肌、半膜肌间钝性分离，以缝吊法牵开臀大肌充分暴露坐骨神经。自梨状肌孔下0.5cm处，用消毒剃刀整齐切断并切除神经干1.0cm。然后选用相应粗细的新鲜异体坐骨神经1.0cm，于4X手术放大镜下用10-0尼龙线缝合神经外膜4-6针[3]。
缝合方法
激光
端侧吻合
神经损伤修复干预
, 百拇医药
桥接物选择
神经
自体
异体
冷冻
放射
煮沸
免疫抑制剂
CSA
雷公藤多甙
肌肉
带蒂骨骼肌
变性肌桥
, http://www.100md.com
血管植入变性肌桥
骨骼肌包埋自体神经段
含血运神经片段的外膜管
静脉
去钙骨导管
筋膜管
间皮管
滑膜管
基膜
硅胶管
壳聚糖导管 普通外科门静脉导管
硬脊膜
, http://www.100md.com 酒精保存
时间
2周
新鲜
bFGF复合膜
几丁糖-胶元复合膜
羊膜
戊二醛处理
雪旺氏细胞
细胞培养
来源于脊神经
培养方法
雪旺氏细胞的纯化
, 百拇医药
组织块培养法
分散培养法
化学试剂杀死FB
加用抗有丝分裂剂
加用补体
胸腺素
粘附，剔除FB
差速贴壁法
免疫法
巨噬细胞培养基
雪旺氏细胞的扩增
牛垂体浸出液Laminin和Fibronection
, 百拇医药
霍乱毒素
活体增殖法
细胞膜、轴膜刺激增殖法
基因调控法
微重力场干预
髓鞘碱性蛋白微基因通过脂质体介导入雪旺氏细胞
药物干预
雷公藤
检测脊髓后角p物质水平
大鼠脾脏IL-2测定
冰片
作用
, http://www.100md.com
增加血脑屏障的药物通透性，而对血脑屏障无结构损伤
当归
复方神肌冲剂
复方红芪提取液
表皮生长因子（EGF）
雪旺氏细胞胞浆神经生长蛋白
银杏叶提取物、肌酸、哮喘素
电场
肌肉电刺激
脊髓电刺激
高压氧
神经生长因子
, 百拇医药
特性
NGF大分子物质不易通过血脑屏障
促进剂
去甲肾上腺素NE
肾上腺素ephnephyrine
多马胺(dopamine)
麻黄宁(epinine)
异丙基肾上腺素(isoproterenol)
多巴(DOPA)
苯醌(bnezo、quinones)、hericenones、erinacines、fellutamides、ransuininA、ingenol
, 百拇医药
triacetate、jolkinolide B
吡咯喹啉醒(pyrroloquinoline quinones,PQQ)
抑制剂
胚胎肢芽内神经营养活性物质的提纯及其生物活性的研究
脑源性神经生长因子
神经再生评价指标
大体观察
足跟皮肤、有无溃疡
步态
坐骨神经指数
展爪反射
, 百拇医药
肌肉
电镜
肌肉湿重测定
肌肉周径测量
电生理
肌肉纤颤电位波幅
肌纤维截面积
肌细胞核数目
肌肉纤维数目
胶元纤维含量
Van Gieson染色
总蛋白质含量
, 百拇医药 成肌细胞增殖动力学变化
流式细胞仪分析细胞周期变化
腓肠肌
氯化金压染法压片光镜观察运动终板一般结构
肌肉张力测定
MDA测定
SOD测定
乙酰胆碱酯酶染色
Na-k-ATP酶
Ca-ATP酶
吻合口描述
粘连状况
, 百拇医药
神经瘤形成
远端神经纤维萎缩变性
分子生物学指标
肌肉组织RNA
myogenin mRNA表达
针对周围神经
电子显微镜
有髓神经纤维
髓鞘厚度
板层结构
有髓神经纤维平均直径
光学显微镜
, 百拇医药
染色方法
HE染色
HE-坚牢蓝复染
劳克坚牢蓝属于铜-酞箐染料（copper-phthalocyanine dye）,
在酒精溶液内具有与髓鞘磷脂结合的染色特性，如再籍中性红或焦油紫复染，尚可染示神经元的胞核及尼氏体，且对髓鞘着色有一定的强化效应。
1． 组织固定于10%福尔马林生理盐水液或福尔马林钙液一星期或长至一月均可。
2． 常规石蜡切片15~20um。火棉胶或冰冻切片均可。
3． 切片脱蜡入无水酒精。冰冻切片从水内贴于载玻片凉干再入无水酒精。
, http://www.100md.com
4． 在染液染色，60度，8~10小时，瓶密封。
劳克坚牢蓝（luxol fast blue MBS） 0.1 g
10%醋酸液 0.5 ml
95%酒精 100ml
染液配制后过滤使用，能较长期贮存。
5． 经70%酒精，入蒸馏水
6． 以0.05%碳酸锂水溶液分色，石蜡切片约需10~30秒钟，厚冰冻切片常需要10分钟以上。
7． 又经70%酒精继续分色两次，每次约0.5~1分钟，至灰、白质区分清晰。镜检若分色不足，可再重复6,7步骤。
, http://www.100md.com 8． 水洗并贴干切片多余液剂。
9． 用0.5%中性红水溶液加数滴冰醋酸染液复染10分钟（5~10分钟，视镜检、分色而定）。
10． 70%酒精将复染分色至仅使胞核及尼氏体呈红色。
11． 滤纸沾尽多余液，入正丁醇两次漂洗脱水，每次3~5分钟，二甲苯透明，封片。
结果：髓鞘兰色，胞核及尼氏体红色
此方法经复染步骤可改用Holmes镀银显示轴突。
侵银染色
Glees-Marland’s氏浸银染色
此法对甲醛固定石蜡切片能染出满意结果，可作为常规方法。
, 百拇医药
染液配制：
铵银液：
20%硝酸银水溶液30ml加纯酒精或95%酒精20%ml混合，滴加浓氨水，使形成的沉淀刚刚溶解，再加5滴浓氨水。
染色方法：
1) 切片6-8um，二甲苯脱蜡。
2) 浸入纯酒精。
3) 用0.2%火棉胶封盖切片，以免脱片。
4) 擦掉多余的火棉胶，再入70%酒精硬化。
5) 蒸馏水洗三次。
6) 放入20%硝酸银水溶液25-30分钟，置于37℃温箱内。
, 百拇医药
7) 蒸馏水洗二次。
8) 入10%甲醛自来水溶液浸二次，每次10秒钟，切片呈黄色，除掉多余的甲醛液。
9) 切片浸润于Glee氏铵银液30秒钟。
10) 排去切片上的多余的铵银液，浸入10%甲醛自来水溶液，每次1分钟。切片呈棕黄色，甲醛呈黑色。
11) 蒸馏水洗。
12) 调色于0.2%氯化金水溶液5分钟。
13) 蒸馏水洗后入5%硫代硫酸钠水溶液固定5分钟。
14) 自来水清洗。
15) 吸干，酒精脱水。
, 百拇医药
16) 二甲苯透明，树胶封固。
结果：神经细胞，轴索，树突呈黑色。
砂罗铬花青法（改良的PAGE法，1965，1970）
试剂配制；
（一） 10%硫酸铁水溶液
硫酸铁铵（ferric ammonium sulfate）10g
蒸馏水加至 100ml
（二） 砂罗铬花青染液
砂罗铬花青(solochrome cyanine R) 0.2g
蒸馏水 96ml
, 百拇医药
10%硫酸铁铵水溶液 4ml
浓硫酸 0.5ml
依次溶解，充分混合，用小口砂塞瓶盛装室温保存。
（三）荧光桃红染液
荧光桃红 B（phloxine B） 0.5g
0.5%氯化钙水溶液 100ml
操作方法；
1． 组织固定于20%甲醛液，以不少于3天为宜，按常规脱水包埋,切片厚4-6um
2． 切片脱蜡至水。
3． 滴加砂罗铬花青染液于上，室温染料15-20 钟。
, http://www.100md.com
4． 倾去染液，流水冲洗1-2分钟。
5． 10%硫酸铁胺水溶液分化1-5分钟，至胶原纤维和肌纤维接近无色或淡灰色，髓鞘呈清晰的兰色为止，每次取出水洗后应在显微镜下观察控制。
6． 流水冲洗5-10分钟
7． 荧光桃红染液复染数分钟。
8． 稍水洗后各级酒精脱水。
9． 二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：
髓鞘呈鲜红色，红细胞深兰色，神经细胞胞质，肌纤维及胶原纤维鲜红色。胞核和核仁兰色。
注意事项：
, 百拇医药
1. 本染色不宜使用含铬盐的固定液固定组织，否则染色不良。
2. 砂罗铬花青R染液稳定，配制后能较长时间保存使用。
3. 如用10% 硫酸铁胺液分化不易掌握，可改用4%硫酸铁胺分化，但作用很慢，需要时间较长。
4. 砂罗铬花青R染色法既简单，又快速，没有Luxol固蓝MBS方法把胶原纤维也着染的缺点。
染色原理：
砂罗铬花青R和硫酸铁胺结合形成染料-金属复合物，经甲醛固定后的髓鞘脂蛋白能与这复合物牢固的结合而着色。
Mallory染色
weil铁明矾苏木精染色
, 百拇医药
Weil 铁矾苏木素染色法 Berube ,Powers与 Clark (1965年) 源于weil (1928年)
显示目的：髓鞘。
固定：10 ％甲醛液。
包埋：火棉胶、石蜡或冰冻切片。冰冻切片应裱在涂有蛋白或白胶的载玻片上，并在空气中干燥。最好是在45摄氏度温箱中烘干。
试剂配制：
（1）A 液： 苏木素1克，无水乙醇100ml ，此液可以立即使用或放置封存。越久越好
（2）B 液： 硫酸铁胺4克，蒸馏水100ml
（3）C 液： 铁氰化钾12.．5克，硼砂2.．5克，蒸馏水1000ml
, 百拇医药
（4）D 液： 综合染色液， A液1份，B液1份，蒸馏水2份
染色方法：
（1） 各种方法的切片按常规处理。
（2） 将切片浸入D液染20min..
（3） 在水中洗。
（4） 在B液中分色，直至灰质和白质可以区别为止。
（5） 在自来水中清洗，蒸馏水中洗2次。
（6） 在C液中完成分色。
（7） 在水中洗，蒸馏水洗。
（8） 用Darrow红染色5＿10 min(Darrow红25mg ,0．2M/L Walpope缓冲液pH3．5，蒸馏水200ml，加热溶解过滤)。
, 百拇医药
（9） 脱水、透明、封片。
结果：髓鞘深蓝至黑色，灰质黄色至无色。
fast blue染色
s-100蛋白
56kD蛋白的表达
I- 辣根过氧化物酶标记近端探测
p75受体表达
轴突记数
电生理指标
神经传导速度
复合动作电位
生物化学
, 百拇医药
神经吻合口瘢痕（胶元测定）
分子生物学指标
脑源性神经营养因子BDNF
睫状神经营养因子CNTF
远端神经组织神经生长因子mRNA
远端神经组织胰岛素样生长因子-1mRNA
bFGF mRNA表达
针对脊髓
电镜观察
HRP逆行示踪
TMB染色后观察 脊髓腰膨大腰4节段是否有标记细胞
, http://www.100md.com
S-100蛋白
P物质
髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫细胞化学染色
地高辛（DIG）标记的bM BE2 cDNA探针的原位杂交
生长相关蛋白GAP-43
免疫电镜
钙调素
细胞凋亡
TUNEL法
HE染色
焦油紫染色
Nissl染色
NADPH-d黄递酶（NOS）组织化学染色
破伤风毒素间接免疫荧光法
一氧化氮合成酶(NOS)含量
神经再生室内容物指标
100,1000以下蛋白Phast电泳、染色和扫描定量分析
, 百拇医药(李皓桓整理)
长度
1. 0cm
模型制作
用1%戊巴比妥钠麻醉（60mg/kg）。在鼠股后外侧区行纵形切口，自股二头肌与半腱肌、半膜肌间钝性分离，以缝吊法牵开臀大肌充分暴露坐骨神经。自梨状肌孔下0.5cm处，用消毒剃刀整齐切断并切除神经干1.0cm。然后选用相应粗细的新鲜异体坐骨神经1.0cm，于4X手术放大镜下用10-0尼龙线缝合神经外膜4-6针[3]。
缝合方法
激光
端侧吻合
神经损伤修复干预
, 百拇医药
桥接物选择
神经
自体
异体
冷冻
放射
煮沸
免疫抑制剂
CSA
雷公藤多甙
肌肉
带蒂骨骼肌
变性肌桥
, http://www.100md.com
血管植入变性肌桥
骨骼肌包埋自体神经段
含血运神经片段的外膜管
静脉
去钙骨导管
筋膜管
间皮管
滑膜管
基膜
硅胶管
壳聚糖导管 普通外科门静脉导管
硬脊膜
, http://www.100md.com 酒精保存
时间
2周
新鲜
bFGF复合膜
几丁糖-胶元复合膜
羊膜
戊二醛处理
雪旺氏细胞
细胞培养
来源于脊神经
培养方法
雪旺氏细胞的纯化
, 百拇医药
组织块培养法
分散培养法
化学试剂杀死FB
加用抗有丝分裂剂
加用补体
胸腺素
粘附，剔除FB
差速贴壁法
免疫法
巨噬细胞培养基
雪旺氏细胞的扩增
牛垂体浸出液Laminin和Fibronection
, 百拇医药
霍乱毒素
活体增殖法
细胞膜、轴膜刺激增殖法
基因调控法
微重力场干预
髓鞘碱性蛋白微基因通过脂质体介导入雪旺氏细胞
药物干预
雷公藤
检测脊髓后角p物质水平
大鼠脾脏IL-2测定
冰片
作用
, http://www.100md.com
增加血脑屏障的药物通透性，而对血脑屏障无结构损伤
当归
复方神肌冲剂
复方红芪提取液
表皮生长因子（EGF）
雪旺氏细胞胞浆神经生长蛋白
银杏叶提取物、肌酸、哮喘素
电场
肌肉电刺激
脊髓电刺激
高压氧
神经生长因子
, 百拇医药
特性
NGF大分子物质不易通过血脑屏障
促进剂
去甲肾上腺素NE
肾上腺素ephnephyrine
多马胺(dopamine)
麻黄宁(epinine)
异丙基肾上腺素(isoproterenol)
多巴(DOPA)
苯醌(bnezo、quinones)、hericenones、erinacines、fellutamides、ransuininA、ingenol
, 百拇医药
triacetate、jolkinolide B
吡咯喹啉醒(pyrroloquinoline quinones,PQQ)
抑制剂
胚胎肢芽内神经营养活性物质的提纯及其生物活性的研究
脑源性神经生长因子
神经再生评价指标
大体观察
足跟皮肤、有无溃疡
步态
坐骨神经指数
展爪反射
, 百拇医药
肌肉
电镜
肌肉湿重测定
肌肉周径测量
电生理
肌肉纤颤电位波幅
肌纤维截面积
肌细胞核数目
肌肉纤维数目
胶元纤维含量
Van Gieson染色
总蛋白质含量
, 百拇医药 成肌细胞增殖动力学变化
流式细胞仪分析细胞周期变化
腓肠肌
氯化金压染法压片光镜观察运动终板一般结构
肌肉张力测定
MDA测定
SOD测定
乙酰胆碱酯酶染色
Na-k-ATP酶
Ca-ATP酶
吻合口描述
粘连状况
, 百拇医药
神经瘤形成
远端神经纤维萎缩变性
分子生物学指标
肌肉组织RNA
myogenin mRNA表达
针对周围神经
电子显微镜
有髓神经纤维
髓鞘厚度
板层结构
有髓神经纤维平均直径
光学显微镜
, 百拇医药
染色方法
HE染色
HE-坚牢蓝复染
劳克坚牢蓝属于铜-酞箐染料（copper-phthalocyanine dye）,
在酒精溶液内具有与髓鞘磷脂结合的染色特性，如再籍中性红或焦油紫复染，尚可染示神经元的胞核及尼氏体，且对髓鞘着色有一定的强化效应。
1． 组织固定于10%福尔马林生理盐水液或福尔马林钙液一星期或长至一月均可。
2． 常规石蜡切片15~20um。火棉胶或冰冻切片均可。
3． 切片脱蜡入无水酒精。冰冻切片从水内贴于载玻片凉干再入无水酒精。
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4． 在染液染色，60度，8~10小时，瓶密封。
劳克坚牢蓝（luxol fast blue MBS） 0.1 g
10%醋酸液 0.5 ml
95%酒精 100ml
染液配制后过滤使用，能较长期贮存。
5． 经70%酒精，入蒸馏水
6． 以0.05%碳酸锂水溶液分色，石蜡切片约需10~30秒钟，厚冰冻切片常需要10分钟以上。
7． 又经70%酒精继续分色两次，每次约0.5~1分钟，至灰、白质区分清晰。镜检若分色不足，可再重复6,7步骤。
, http://www.100md.com 8． 水洗并贴干切片多余液剂。
9． 用0.5%中性红水溶液加数滴冰醋酸染液复染10分钟（5~10分钟，视镜检、分色而定）。
10． 70%酒精将复染分色至仅使胞核及尼氏体呈红色。
11． 滤纸沾尽多余液，入正丁醇两次漂洗脱水，每次3~5分钟，二甲苯透明，封片。
结果：髓鞘兰色，胞核及尼氏体红色
此方法经复染步骤可改用Holmes镀银显示轴突。
侵银染色
Glees-Marland’s氏浸银染色
此法对甲醛固定石蜡切片能染出满意结果，可作为常规方法。
, 百拇医药
染液配制：
铵银液：
20%硝酸银水溶液30ml加纯酒精或95%酒精20%ml混合，滴加浓氨水，使形成的沉淀刚刚溶解，再加5滴浓氨水。
染色方法：
1) 切片6-8um，二甲苯脱蜡。
2) 浸入纯酒精。
3) 用0.2%火棉胶封盖切片，以免脱片。
4) 擦掉多余的火棉胶，再入70%酒精硬化。
5) 蒸馏水洗三次。
6) 放入20%硝酸银水溶液25-30分钟，置于37℃温箱内。
, 百拇医药
7) 蒸馏水洗二次。
8) 入10%甲醛自来水溶液浸二次，每次10秒钟，切片呈黄色，除掉多余的甲醛液。
9) 切片浸润于Glee氏铵银液30秒钟。
10) 排去切片上的多余的铵银液，浸入10%甲醛自来水溶液，每次1分钟。切片呈棕黄色，甲醛呈黑色。
11) 蒸馏水洗。
12) 调色于0.2%氯化金水溶液5分钟。
13) 蒸馏水洗后入5%硫代硫酸钠水溶液固定5分钟。
14) 自来水清洗。
15) 吸干，酒精脱水。
, 百拇医药
16) 二甲苯透明，树胶封固。
结果：神经细胞，轴索，树突呈黑色。
砂罗铬花青法（改良的PAGE法，1965，1970）
试剂配制；
（一） 10%硫酸铁水溶液
硫酸铁铵（ferric ammonium sulfate）10g
蒸馏水加至 100ml
（二） 砂罗铬花青染液
砂罗铬花青(solochrome cyanine R) 0.2g
蒸馏水 96ml
, 百拇医药
10%硫酸铁铵水溶液 4ml
浓硫酸 0.5ml
依次溶解，充分混合，用小口砂塞瓶盛装室温保存。
（三）荧光桃红染液
荧光桃红 B（phloxine B） 0.5g
0.5%氯化钙水溶液 100ml
操作方法；
1． 组织固定于20%甲醛液，以不少于3天为宜，按常规脱水包埋,切片厚4-6um
2． 切片脱蜡至水。
3． 滴加砂罗铬花青染液于上，室温染料15-20 钟。
, http://www.100md.com
4． 倾去染液，流水冲洗1-2分钟。
5． 10%硫酸铁胺水溶液分化1-5分钟，至胶原纤维和肌纤维接近无色或淡灰色，髓鞘呈清晰的兰色为止，每次取出水洗后应在显微镜下观察控制。
6． 流水冲洗5-10分钟
7． 荧光桃红染液复染数分钟。
8． 稍水洗后各级酒精脱水。
9． 二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：
髓鞘呈鲜红色，红细胞深兰色，神经细胞胞质，肌纤维及胶原纤维鲜红色。胞核和核仁兰色。
注意事项：
, 百拇医药
1. 本染色不宜使用含铬盐的固定液固定组织，否则染色不良。
2. 砂罗铬花青R染液稳定，配制后能较长时间保存使用。
3. 如用10% 硫酸铁胺液分化不易掌握，可改用4%硫酸铁胺分化，但作用很慢，需要时间较长。
4. 砂罗铬花青R染色法既简单，又快速，没有Luxol固蓝MBS方法把胶原纤维也着染的缺点。
染色原理：
砂罗铬花青R和硫酸铁胺结合形成染料-金属复合物，经甲醛固定后的髓鞘脂蛋白能与这复合物牢固的结合而着色。
Mallory染色
weil铁明矾苏木精染色
, 百拇医药
Weil 铁矾苏木素染色法 Berube ,Powers与 Clark (1965年) 源于weil (1928年)
显示目的：髓鞘。
固定：10 ％甲醛液。
包埋：火棉胶、石蜡或冰冻切片。冰冻切片应裱在涂有蛋白或白胶的载玻片上，并在空气中干燥。最好是在45摄氏度温箱中烘干。
试剂配制：
（1）A 液： 苏木素1克，无水乙醇100ml ，此液可以立即使用或放置封存。越久越好
（2）B 液： 硫酸铁胺4克，蒸馏水100ml
（3）C 液： 铁氰化钾12.．5克，硼砂2.．5克，蒸馏水1000ml
, 百拇医药
（4）D 液： 综合染色液， A液1份，B液1份，蒸馏水2份
染色方法：
（1） 各种方法的切片按常规处理。
（2） 将切片浸入D液染20min..
（3） 在水中洗。
（4） 在B液中分色，直至灰质和白质可以区别为止。
（5） 在自来水中清洗，蒸馏水中洗2次。
（6） 在C液中完成分色。
（7） 在水中洗，蒸馏水洗。
（8） 用Darrow红染色5＿10 min(Darrow红25mg ,0．2M/L Walpope缓冲液pH3．5，蒸馏水200ml，加热溶解过滤)。
, 百拇医药
（9） 脱水、透明、封片。
结果：髓鞘深蓝至黑色，灰质黄色至无色。
fast blue染色
s-100蛋白
56kD蛋白的表达
I- 辣根过氧化物酶标记近端探测
p75受体表达
轴突记数
电生理指标
神经传导速度
复合动作电位
生物化学
, 百拇医药
神经吻合口瘢痕（胶元测定）
分子生物学指标
脑源性神经营养因子BDNF
睫状神经营养因子CNTF
远端神经组织神经生长因子mRNA
远端神经组织胰岛素样生长因子-1mRNA
bFGF mRNA表达
针对脊髓
电镜观察
HRP逆行示踪
TMB染色后观察 脊髓腰膨大腰4节段是否有标记细胞
, http://www.100md.com
S-100蛋白
P物质
髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫细胞化学染色
地高辛（DIG）标记的bM BE2 cDNA探针的原位杂交
生长相关蛋白GAP-43
免疫电镜
钙调素
细胞凋亡
TUNEL法
HE染色
焦油紫染色
Nissl染色
NADPH-d黄递酶（NOS）组织化学染色
破伤风毒素间接免疫荧光法
一氧化氮合成酶(NOS)含量
神经再生室内容物指标
100,1000以下蛋白Phast电泳、染色和扫描定量分析
, 百拇医药(李皓桓整理)