骨肉瘤自杀基因治疗研究进展
自杀基因治疗是将某些细菌、病毒和真菌中特有的药物敏感基因导入肿瘤细胞，通过此基因编码的特异性酶类将原先对细胞无毒或抑制作用极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成有抑制作用的产物，通过抑制核酸合成达到杀死肿瘤细胞的目的。1999年，Grossin等[1] 将单纯疱疹病毒载体-胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine ki-nase，HSV-TK)转染入人骨肉瘤细胞株后发现其对丙氧鸟苷(ganciclovir，GCV)异常敏感。随后，charissoux等[2] 又做了体内实验，他们将小块骨肉瘤组织种植在兔胫骨的旁边，7d后向肿瘤组织内注射包装细胞，随后使用GCV治疗。结果显示本该在这一时间发生肿瘤肺脏转移的兔却安然无恙，同时发现肿瘤体积较以前减小了。这些研究表明，自杀基因对于骨肉瘤的治疗有着潜在的价值。近几年，人们针对骨肉瘤及其肺转移的基因治疗研究中已经在免疫基因治疗、反义基因治疗、抑癌基因治疗、自杀基因靶向治疗等多种基因治疗方面取得了一定进展。自杀基因治疗因为具备特有的旁观者效应，而骨肉瘤的基因治疗目前面临的最大问题就是转染率低，这使得自杀基因治疗成为一种极富前景的治疗方法，近几年在这方面的研究取得许多可喜成果，现综述如下。
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1 自杀基因治疗系统的研究
自杀基因治疗系统是由特定的自杀基因联合特定的前药组成，不同的治疗系统表现出不同的治疗特性，同一种治疗系统随肿瘤种类、性质的不同又表现出不同的细胞抑制作用和旁观者效应。在对特定的肿瘤治疗中选择对应性好的自杀基因治疗系统，不仅对肿瘤组织的杀伤性好，且能较好地保护正常组织。目前，已经运用到骨肉瘤试验性治疗的自杀 基因治疗系统且取得一定进展的有以下几个。
1.1 HSV-TK/GCV系统 HSV-TK在自杀基因治疗中是研究最多的，常用的前体药物是GCV。TK基因编码的胸苷激酶可将GCV代谢为二磷酸化物，二磷酸化物在细胞内酶的作用下成为有抑制作用的三磷酸化物，后者通过抑制DNA聚合酶活性，阻止DNA复制，从而杀死肿瘤细胞。Seto等[3] 将HSV-TK基因转染骨肉瘤细胞株LM8后，发现GCV对于导入HSV-TK的细胞株的细胞抑制作用更加敏感，而且在体内试验中观察到明显的肿瘤生长抑制和肺转移抑制。Zheng等[4] 进一步利用直接转运核苷激酶蛋白到骨肉瘤细胞中来观察它的治疗作用，结果发现骨肉瘤细胞株经酶—脂质混合物处理后对GCV的敏感性增强。这样的结果说明直接转染自杀基因蛋白是一种新的替代传统的基因治疗方法。虽然骨肉瘤已经被证实是HSV-TK/GCV自杀基因治疗的潜在靶标，但是HSV-TK/GCV系统在骨肉瘤治疗中的应用仍没有得到全面的认识。Ketola等 [5] 研究结果进一步证实:a)骨肉瘤细胞能够被腺病毒或慢病毒介导的基因转染;b)骨肉瘤细胞株是HSV-TK/GCV基因治疗良好的靶标;c)HSV-TK/GCV对细胞的抑制作用的程度与旁观者效应有相关性。
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1.2 CD/5Fc系统 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)催化胞嘧啶脱氨基生成尿嘧啶，使低抑制作用的5氟胞嘧啶(5cytosine uracil，5FC)变成了强抑制作用的化疗剂5氟尿嘧啶(5fluorineuracil，5FU)，5FU代谢生成5-氟磷酸脱氧尿苷，通过阻止脱氧尿苷生成脱氧胸腺嘧啶核甙三磷酸酯而抑制DNA的合成。Ramnaraine等 [6] 应用鼠科2472株骨肉瘤细胞转染带有细菌或真菌基因的神经生长因子受体与胞嘧啶脱氨酸的融合基因(nerve growthfactor re-ceptorandcytoplasmicCDfusiongenes containingeitherthe bacterial or yeast，NGFR- b CD或NGFR- y CD)，在体外实验中，5FC通过直接和旁观效应能够杀死这种被转染的细胞;相比之下，5FC用于治疗皮下分别种植NGFR-b CD和NGFR- y CD肿瘤的实验鼠结果显示仅对种植NGFR- y CD肿瘤有影响。用5FC治疗骨肉瘤，不仅可消除肿瘤，还能有效抑制肿瘤诱导的骨破坏并使得破骨细胞的数量减少，CD/5Fc系统以及黑腹果蝇DNA激酶(Drosophila melano gaster DNA kinase，Dm-dNK)作为自杀基因在骨肉瘤的联合基因治疗和化学基因治疗中也得以应用[7] 。
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1.3 Dm-dNK/BVDU系统 Zheng等[8] 用反转录病毒转导Dm-dNKcDNA到骨肉瘤细胞中，发现转导后的细胞能够表达有活性的酶，和前药溴乙烯脱氧尿苷(bromovinyl de-oxyuridine，BVDU)一起作用能够产生细胞抑制作用，而且表明BVDU被Dm-dNK磷酸化后也能引起旁观者效应。
1.4 CE2/CPT-11系统 Oosterhoff等
[9] 利用人肝羧酸酯酶-2(carboxylesterase-2，CE2)和抗癌因子喜树碱-11(camp-tothecin-11，CPT-11)来观察其对于骨肉瘤的治疗作用。CPT-11是一个在临床上已经得到证实的前药，能够在CE2作用下转化成有活性的乙羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin，SN-38)。体外试验中，转导包含编码分泌型CE2的腺病毒载体(adenoviral vector cantaining the cDNA encodinga secretedformof CE2，Ad-sCE2)的骨肉瘤细胞株对于CPT-11治疗的敏感度是未转导的2800倍;取自骨肉瘤病人的瘤细胞经短期培养后接受CPT-11治疗，转导Ad-sCE2细胞的敏感度是未转导的70倍。当试验鼠皮下接种骨肉瘤细胞株OSMG-63后，在肿瘤中注射Ad-sCE2和CPT-11，相比较单独注射Ad-sCE2或CPT-11而言，肿瘤的生长明显受到抑制。
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2 替代性前药的研究
GCV的三环类衍生物已经被证实对于骨肉瘤HSV-TK基因转导是一系列潜在的、高选择性的细胞抑制性前药，尽管它们对于HSV-TK的亲和力弱于GCV，但对于细胞抑制的能力和选择性则等同于GCV，而且在细胞培养中亦呈现出显著的旁观者效应。与GCV不同的是:三环类嘌呤衍生物具有内在的强荧光结构，这使得能够在生物组织和液体中对其进行简便和灵敏的检测;此外，它们的亲脂性远强于GCV，更易于进入含脂类高的组织中去[10] 。
5-碘嘧啶核苷作为基因治疗的前药应用于没有TK转导和有TK转导的骨肉瘤细胞株，结果显示:5-碘复合物比 GCV更能有效抑制有TK转导的细胞的生长，而对于没有TK转导的细胞则比GCV的抑制作用弱[11] 。
碘乙烯化去氧氟核糖尿嘧啶(iodovinyl deoxy fluoro ri-bofuranosyl uracil，IVFRU)是一种有选择性地增强鼠科骨肉瘤细胞株表达HSV-TK的嘧啶核苷酸类似物。Morin等[12] 在人骨肉瘤细胞摄取[I-125]IVFRU的研究中发现IVFRU相比较于GCV对于表达HSV-TK的细胞株表现出较低的细胞抑制作用;此外，IVFRU在亚细胞核酸部分分布的差异以及对细胞抑制的差异使得IVFRU能反映出细胞类型和谱系。
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3 肿瘤特异性启动子联合自杀基因的研究
如果在自杀基因前端接上一个肿瘤特异性的启动子，可以使自杀基因呈肿瘤特异性表达，以此来增强自杀基因对肿瘤细胞的杀伤效力以及降低它的系统抑制作用。
骨钙蛋白在成骨性骨肉瘤中高表达，具有特异性，因此，一些学者采用骨钙蛋白启动子联合自杀基因来治疗骨肉瘤。Ko等[13] 重组腺病毒-骨钙蛋白启动子-胸腺嘧啶激酶(aden-ovirus-osteocalcin-thymidine kinase，Ad-OC-TK)在体外转染人骨肉瘤细胞、体内转染鼠骨肉瘤细胞，均发现高选择性阻断肿瘤细胞生长。cheon等[14] 也采用Ad-OC-TK方法，同时结合化疗治疗鼠骨肉瘤模型，发现化学基因治疗组存活率明显提高。Shirakawa等[15] 通过静脉注射Ad-OC-TK、腹腔注射无环鸟苷(acyclovir，ACV)的方法治疗鼠骨肉瘤，亦观察到明显的抑瘤效应，并提示Ad-OC-TK/ACV可以用于骨肉瘤肺转移的系统治疗。
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Chen等 [16] 则采用包含编码TK基因和T7自主基因的非病毒载体T7、联合T7启动子及T7RNA聚合酶同时导入人骨肉瘤细胞系，90%以上的肿瘤细胞在4d内被GCV杀死。Majumdar等[17] 采用人端粒酶逆转录酶启动子-TK基因(human telomerase reverse transcriptase promotor/TK，hTERTp/TK)和巨细胞病毒启动子-TK基因(cy-tomegalovirus promoter，CMVp/TK)分别转染人OS143B细胞株，使用GCV获得相近的肿瘤消退和生存率，并且hTERTp启动子表现出很强的肿瘤特异性，在健康组织和器官中未检见自杀基因的表达。
葡萄糖调节蛋白-78(78-KDA glucose-regulated pro-tein，GRP78)是一种在变异细胞和血供差的瘤组织中处于糖饥饿、酸毒症和缺氧状况下的细胞中过渡表达的压力应激蛋白，其中有抗凋亡结构。已经证实GRP78启动子可以通过激活HSV-TK自杀基因的表达来消除肿瘤。在逆转录酶病毒载体中，Dong等[18] 观察到GRP78启动子驱动的自杀基因在骨肉瘤中强烈表达。在转基因鼠模型中，GRP78启动子激活基因在主要的成年器官中是静止的，但是在肿瘤细胞中和肿瘤相关的巨噬细胞中非常活跃，它能够扩散到肿瘤因缺血发生坏死的部位中并能有助于以细胞为基础的治疗。这样，通过应用GRP78启动子的转录控制为肿瘤的基因治疗提供多种新的方法。
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4 旁观者效应的研究
国内外所有HSV-TK研究者在实践中均发现HSV-TK系统不仅具有直接细胞杀伤作用，还具有明显的旁观者效应。这一效应有力地增强了HSV-TK系统的作用，有些甚至只需要1%～5%的转染细胞即可引起几乎全部瘤细胞死亡。
关于旁观者效应的机制，一般认为是GCV的磷酸化产物扩散至周围的肿瘤细胞而产生。Freeman等[19] 认为HSV-TK阳性细胞形成的“凋亡小体”被周围的HSV-TK阴性细胞摄取或细胞间通过缝隙连接进行胞质交换，使HSV-TK阴性细胞死亡。Yang等[20] 认为旁观者效应的程度与间隙连接细胞间通讯(gap junctional intercellular comminication，GJIC)有关。Mesnil等[21] 总结了GJIC在旁观者效应中的作用，发现无论是体内还是体外，GJIC表达的高低与潜在的旁杀伤作用之间具有直接的相关性，特别是在使用HSV-TK/GCV作为自杀基因系统的情况下更是如此。此外，由于肿瘤的发生与其逃避机体免疫监视有关。动物实验发现HSV-TK阳性肿瘤细胞被GCV杀伤后，可以引起坏死组织周围大量巨噬细胞和CD4+、CD8+T淋巴细胞的浸润，强烈炎症反应可引起抗肿瘤免疫性杀伤。这可能也是旁观者效应的机制之一。
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Degreve等[22] 研究发现在HSV-TK基因治疗中，嘌呤核苷类似物的旁观者效应较嘧啶核苷类似物要强，在同样的试验条件下，GCV代谢物比BVDU的代谢物更易通过缝隙连接。Walling等[22] 联合应用HSV-TK/GCV基因和白介素-2基因(interleukin-2，IL-2)，结果显示可以明显的改善疗效;在动物模型的治疗观察中，发现在距后植入的转染细胞1cm处未经转染的先植入细胞形成的骨肉瘤中出现明显的抗肿瘤的反应，证明HSV-TK/GCV基因治疗系统可以呈现出远距离旁观者效应，如果联合IL-2基因的转导则这种效应可得到加强。
5 结 语
自杀基因治疗系统应用于骨肉瘤有其许多特有的优点，如选择性地杀伤基因转染的骨肉瘤细胞，而对正常的骨组织损伤小，避免了全身化疗的毒副作用，旁观者效应能在一定程度上弥补载体系统在骨肉瘤细胞中转染率低以及靶向性差所带来的问题，但也有许多不足:a)自杀基因在骨肉瘤细 胞中的转染率仍很低下，虽有旁观者效应存在，也难以将所 有肿瘤细胞杀死;b)自杀基因治疗仅杀伤S期细胞，即仅能诱导一小部分分裂细胞发生死亡，这使其治疗范围受到限制;c)CD/5FU应用到骨肉瘤治疗中CD的转染较为困难，即使成功转染，5FC转化为5FU的效率还是不高;d)体内应用自杀基因治疗骨肉瘤目前并无太大优势，这是因为自杀基因难以精确地进入骨肉瘤细胞，正常细胞也可能感染自杀基因，或屈服于旁观者效应，导致其死亡或产生副反应;e)Chen等[24] 曾认为HSV-TK/GCV系统可能不是一个很好的基因治疗策略，其理由是体内实验证明单纯的HSV-TK基因不能抑制肿瘤生长，只有GCV加入1周后或更长时间才能产生杀瘤效应，而在这一段时间里，肿瘤可以迅速生长扩散，而骨肉瘤同样面临这样一个问题。
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总之，自杀基因治疗骨肉瘤仅仅是一个开端，目前仅限于试验阶段，与临床应用尚有相当长的过渡时期。今后的研究应寻找更多更有效的自杀基因，构建更为有效的针对骨肉瘤的靶向性载体，提高基因靶向转染效率，选择简便实用的治疗策略，建立合理搭配的联合基因治疗方案等。相信随着人类基因组计划的完成、肿瘤相关基因的揭示、肿瘤发病分子机理的深入阐明、DNA转移技术的革新、在体内重组载体表达的调控技术的提高以及自杀基因在其他肿瘤治疗研究中取得的进展，骨肉瘤的自杀基因治疗研究将会取得突破性进展。
参考文献:
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(山西医科大学第二医院，山西太原 030001), 百拇医药(冯毅，吕智)
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1 自杀基因治疗系统的研究
自杀基因治疗系统是由特定的自杀基因联合特定的前药组成，不同的治疗系统表现出不同的治疗特性，同一种治疗系统随肿瘤种类、性质的不同又表现出不同的细胞抑制作用和旁观者效应。在对特定的肿瘤治疗中选择对应性好的自杀基因治疗系统，不仅对肿瘤组织的杀伤性好，且能较好地保护正常组织。目前，已经运用到骨肉瘤试验性治疗的自杀 基因治疗系统且取得一定进展的有以下几个。
1.1 HSV-TK/GCV系统 HSV-TK在自杀基因治疗中是研究最多的，常用的前体药物是GCV。TK基因编码的胸苷激酶可将GCV代谢为二磷酸化物，二磷酸化物在细胞内酶的作用下成为有抑制作用的三磷酸化物，后者通过抑制DNA聚合酶活性，阻止DNA复制，从而杀死肿瘤细胞。Seto等[3] 将HSV-TK基因转染骨肉瘤细胞株LM8后，发现GCV对于导入HSV-TK的细胞株的细胞抑制作用更加敏感，而且在体内试验中观察到明显的肿瘤生长抑制和肺转移抑制。Zheng等[4] 进一步利用直接转运核苷激酶蛋白到骨肉瘤细胞中来观察它的治疗作用，结果发现骨肉瘤细胞株经酶—脂质混合物处理后对GCV的敏感性增强。这样的结果说明直接转染自杀基因蛋白是一种新的替代传统的基因治疗方法。虽然骨肉瘤已经被证实是HSV-TK/GCV自杀基因治疗的潜在靶标，但是HSV-TK/GCV系统在骨肉瘤治疗中的应用仍没有得到全面的认识。Ketola等 [5] 研究结果进一步证实:a)骨肉瘤细胞能够被腺病毒或慢病毒介导的基因转染;b)骨肉瘤细胞株是HSV-TK/GCV基因治疗良好的靶标;c)HSV-TK/GCV对细胞的抑制作用的程度与旁观者效应有相关性。
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1.2 CD/5Fc系统 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)催化胞嘧啶脱氨基生成尿嘧啶，使低抑制作用的5氟胞嘧啶(5cytosine uracil，5FC)变成了强抑制作用的化疗剂5氟尿嘧啶(5fluorineuracil，5FU)，5FU代谢生成5-氟磷酸脱氧尿苷，通过阻止脱氧尿苷生成脱氧胸腺嘧啶核甙三磷酸酯而抑制DNA的合成。Ramnaraine等 [6] 应用鼠科2472株骨肉瘤细胞转染带有细菌或真菌基因的神经生长因子受体与胞嘧啶脱氨酸的融合基因(nerve growthfactor re-ceptorandcytoplasmicCDfusiongenes containingeitherthe bacterial or yeast，NGFR- b CD或NGFR- y CD)，在体外实验中，5FC通过直接和旁观效应能够杀死这种被转染的细胞;相比之下，5FC用于治疗皮下分别种植NGFR-b CD和NGFR- y CD肿瘤的实验鼠结果显示仅对种植NGFR- y CD肿瘤有影响。用5FC治疗骨肉瘤，不仅可消除肿瘤，还能有效抑制肿瘤诱导的骨破坏并使得破骨细胞的数量减少，CD/5Fc系统以及黑腹果蝇DNA激酶(Drosophila melano gaster DNA kinase，Dm-dNK)作为自杀基因在骨肉瘤的联合基因治疗和化学基因治疗中也得以应用[7] 。
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1.3 Dm-dNK/BVDU系统 Zheng等[8] 用反转录病毒转导Dm-dNKcDNA到骨肉瘤细胞中，发现转导后的细胞能够表达有活性的酶，和前药溴乙烯脱氧尿苷(bromovinyl de-oxyuridine，BVDU)一起作用能够产生细胞抑制作用，而且表明BVDU被Dm-dNK磷酸化后也能引起旁观者效应。
1.4 CE2/CPT-11系统 Oosterhoff等
[9] 利用人肝羧酸酯酶-2(carboxylesterase-2，CE2)和抗癌因子喜树碱-11(camp-tothecin-11，CPT-11)来观察其对于骨肉瘤的治疗作用。CPT-11是一个在临床上已经得到证实的前药，能够在CE2作用下转化成有活性的乙羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin，SN-38)。体外试验中，转导包含编码分泌型CE2的腺病毒载体(adenoviral vector cantaining the cDNA encodinga secretedformof CE2，Ad-sCE2)的骨肉瘤细胞株对于CPT-11治疗的敏感度是未转导的2800倍;取自骨肉瘤病人的瘤细胞经短期培养后接受CPT-11治疗，转导Ad-sCE2细胞的敏感度是未转导的70倍。当试验鼠皮下接种骨肉瘤细胞株OSMG-63后，在肿瘤中注射Ad-sCE2和CPT-11，相比较单独注射Ad-sCE2或CPT-11而言，肿瘤的生长明显受到抑制。
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2 替代性前药的研究
GCV的三环类衍生物已经被证实对于骨肉瘤HSV-TK基因转导是一系列潜在的、高选择性的细胞抑制性前药，尽管它们对于HSV-TK的亲和力弱于GCV，但对于细胞抑制的能力和选择性则等同于GCV，而且在细胞培养中亦呈现出显著的旁观者效应。与GCV不同的是:三环类嘌呤衍生物具有内在的强荧光结构，这使得能够在生物组织和液体中对其进行简便和灵敏的检测;此外，它们的亲脂性远强于GCV，更易于进入含脂类高的组织中去[10] 。
5-碘嘧啶核苷作为基因治疗的前药应用于没有TK转导和有TK转导的骨肉瘤细胞株，结果显示:5-碘复合物比 GCV更能有效抑制有TK转导的细胞的生长，而对于没有TK转导的细胞则比GCV的抑制作用弱[11] 。
碘乙烯化去氧氟核糖尿嘧啶(iodovinyl deoxy fluoro ri-bofuranosyl uracil，IVFRU)是一种有选择性地增强鼠科骨肉瘤细胞株表达HSV-TK的嘧啶核苷酸类似物。Morin等[12] 在人骨肉瘤细胞摄取[I-125]IVFRU的研究中发现IVFRU相比较于GCV对于表达HSV-TK的细胞株表现出较低的细胞抑制作用;此外，IVFRU在亚细胞核酸部分分布的差异以及对细胞抑制的差异使得IVFRU能反映出细胞类型和谱系。
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3 肿瘤特异性启动子联合自杀基因的研究
如果在自杀基因前端接上一个肿瘤特异性的启动子，可以使自杀基因呈肿瘤特异性表达，以此来增强自杀基因对肿瘤细胞的杀伤效力以及降低它的系统抑制作用。
骨钙蛋白在成骨性骨肉瘤中高表达，具有特异性，因此，一些学者采用骨钙蛋白启动子联合自杀基因来治疗骨肉瘤。Ko等[13] 重组腺病毒-骨钙蛋白启动子-胸腺嘧啶激酶(aden-ovirus-osteocalcin-thymidine kinase，Ad-OC-TK)在体外转染人骨肉瘤细胞、体内转染鼠骨肉瘤细胞，均发现高选择性阻断肿瘤细胞生长。cheon等[14] 也采用Ad-OC-TK方法，同时结合化疗治疗鼠骨肉瘤模型，发现化学基因治疗组存活率明显提高。Shirakawa等[15] 通过静脉注射Ad-OC-TK、腹腔注射无环鸟苷(acyclovir，ACV)的方法治疗鼠骨肉瘤，亦观察到明显的抑瘤效应，并提示Ad-OC-TK/ACV可以用于骨肉瘤肺转移的系统治疗。
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Chen等 [16] 则采用包含编码TK基因和T7自主基因的非病毒载体T7、联合T7启动子及T7RNA聚合酶同时导入人骨肉瘤细胞系，90%以上的肿瘤细胞在4d内被GCV杀死。Majumdar等[17] 采用人端粒酶逆转录酶启动子-TK基因(human telomerase reverse transcriptase promotor/TK，hTERTp/TK)和巨细胞病毒启动子-TK基因(cy-tomegalovirus promoter，CMVp/TK)分别转染人OS143B细胞株，使用GCV获得相近的肿瘤消退和生存率，并且hTERTp启动子表现出很强的肿瘤特异性，在健康组织和器官中未检见自杀基因的表达。
葡萄糖调节蛋白-78(78-KDA glucose-regulated pro-tein，GRP78)是一种在变异细胞和血供差的瘤组织中处于糖饥饿、酸毒症和缺氧状况下的细胞中过渡表达的压力应激蛋白，其中有抗凋亡结构。已经证实GRP78启动子可以通过激活HSV-TK自杀基因的表达来消除肿瘤。在逆转录酶病毒载体中，Dong等[18] 观察到GRP78启动子驱动的自杀基因在骨肉瘤中强烈表达。在转基因鼠模型中，GRP78启动子激活基因在主要的成年器官中是静止的，但是在肿瘤细胞中和肿瘤相关的巨噬细胞中非常活跃，它能够扩散到肿瘤因缺血发生坏死的部位中并能有助于以细胞为基础的治疗。这样，通过应用GRP78启动子的转录控制为肿瘤的基因治疗提供多种新的方法。
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4 旁观者效应的研究
国内外所有HSV-TK研究者在实践中均发现HSV-TK系统不仅具有直接细胞杀伤作用，还具有明显的旁观者效应。这一效应有力地增强了HSV-TK系统的作用，有些甚至只需要1%～5%的转染细胞即可引起几乎全部瘤细胞死亡。
关于旁观者效应的机制，一般认为是GCV的磷酸化产物扩散至周围的肿瘤细胞而产生。Freeman等[19] 认为HSV-TK阳性细胞形成的“凋亡小体”被周围的HSV-TK阴性细胞摄取或细胞间通过缝隙连接进行胞质交换，使HSV-TK阴性细胞死亡。Yang等[20] 认为旁观者效应的程度与间隙连接细胞间通讯(gap junctional intercellular comminication，GJIC)有关。Mesnil等[21] 总结了GJIC在旁观者效应中的作用，发现无论是体内还是体外，GJIC表达的高低与潜在的旁杀伤作用之间具有直接的相关性，特别是在使用HSV-TK/GCV作为自杀基因系统的情况下更是如此。此外，由于肿瘤的发生与其逃避机体免疫监视有关。动物实验发现HSV-TK阳性肿瘤细胞被GCV杀伤后，可以引起坏死组织周围大量巨噬细胞和CD4+、CD8+T淋巴细胞的浸润，强烈炎症反应可引起抗肿瘤免疫性杀伤。这可能也是旁观者效应的机制之一。
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Degreve等[22] 研究发现在HSV-TK基因治疗中，嘌呤核苷类似物的旁观者效应较嘧啶核苷类似物要强，在同样的试验条件下，GCV代谢物比BVDU的代谢物更易通过缝隙连接。Walling等[22] 联合应用HSV-TK/GCV基因和白介素-2基因(interleukin-2，IL-2)，结果显示可以明显的改善疗效;在动物模型的治疗观察中，发现在距后植入的转染细胞1cm处未经转染的先植入细胞形成的骨肉瘤中出现明显的抗肿瘤的反应，证明HSV-TK/GCV基因治疗系统可以呈现出远距离旁观者效应，如果联合IL-2基因的转导则这种效应可得到加强。
5 结 语
自杀基因治疗系统应用于骨肉瘤有其许多特有的优点，如选择性地杀伤基因转染的骨肉瘤细胞，而对正常的骨组织损伤小，避免了全身化疗的毒副作用，旁观者效应能在一定程度上弥补载体系统在骨肉瘤细胞中转染率低以及靶向性差所带来的问题，但也有许多不足:a)自杀基因在骨肉瘤细 胞中的转染率仍很低下，虽有旁观者效应存在，也难以将所 有肿瘤细胞杀死;b)自杀基因治疗仅杀伤S期细胞，即仅能诱导一小部分分裂细胞发生死亡，这使其治疗范围受到限制;c)CD/5FU应用到骨肉瘤治疗中CD的转染较为困难，即使成功转染，5FC转化为5FU的效率还是不高;d)体内应用自杀基因治疗骨肉瘤目前并无太大优势，这是因为自杀基因难以精确地进入骨肉瘤细胞，正常细胞也可能感染自杀基因，或屈服于旁观者效应，导致其死亡或产生副反应;e)Chen等[24] 曾认为HSV-TK/GCV系统可能不是一个很好的基因治疗策略，其理由是体内实验证明单纯的HSV-TK基因不能抑制肿瘤生长，只有GCV加入1周后或更长时间才能产生杀瘤效应，而在这一段时间里，肿瘤可以迅速生长扩散，而骨肉瘤同样面临这样一个问题。
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总之，自杀基因治疗骨肉瘤仅仅是一个开端，目前仅限于试验阶段，与临床应用尚有相当长的过渡时期。今后的研究应寻找更多更有效的自杀基因，构建更为有效的针对骨肉瘤的靶向性载体，提高基因靶向转染效率，选择简便实用的治疗策略，建立合理搭配的联合基因治疗方案等。相信随着人类基因组计划的完成、肿瘤相关基因的揭示、肿瘤发病分子机理的深入阐明、DNA转移技术的革新、在体内重组载体表达的调控技术的提高以及自杀基因在其他肿瘤治疗研究中取得的进展，骨肉瘤的自杀基因治疗研究将会取得突破性进展。
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(山西医科大学第二医院，山西太原 030001), 百拇医药(冯毅，吕智)