在糖尿病粥样硬化动脉壁分布的免疫组化研究
【摘要】 目的 研究2型糖尿病动脉壁糖基化终末产物的程度以及糖基化机制在2型糖尿病并发症发生发展中的作用。方法 应用抗糖基化终末产物(AGEs)多克隆抗体，对2型糖尿病粥样硬化血管和非糖尿病粥样硬化血管、正常人群的血管进行动脉壁AGEs的免疫组化研究。结果 2型糖尿病粥样硬化血管壁AGEs的表达率显著大于非糖尿病粥样硬化血管及正常人群的血管(P<0.01)，非糖尿病粥样硬化血管与正常人群的血管亦有差异(P<0.05)。结论 血管壁AGEs的免疫组化定性研究更直观地反映血管组织糖基化的程度，进一步说明AGEs在糖尿病并发症中所起的重要作用。
【关键词】 糖尿病 免疫组化研究 糖尿病并发症 糖基化代谢终末产物 动脉粥样硬化
血管重建(remodeling)是糖尿病并发症的重要病理基础，糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGEs)是引起血管重建的重要机制之一[1-3]。AGEs结构稳定，因此组织中AGEs可以反映糖尿病硬化血管非酶糖化和程度。本文采用AGEs多克隆抗体，进行血管壁AGEs的免疫组化分析，旨在研究糖尿病动脉粥样硬化血管壁糖化的程度。探讨过度的糖基化终末产物的堆积对血管的损害。
1 材料和方法
1.1 材料
A组16例非糖尿病者无动脉粥样硬化动脉血管、B组16例非糖尿病者动脉粥样硬化动脉血管和C组16例糖尿病者动脉硬化动脉血管蜡块为大庆市龙南医院病理科手术标本。
1.2 实验方法
采用免疫组织化学法检测AGEs在血管壁的分布情况,抗多克隆AGEs系日本和光纯药工业株式会社公司多克隆抗体(HSA-AGEs抗体)商品名ヮユモト(KH001)，S-P及DAB试剂盒购自SantaCruz公司。切片脱腊后，按S-P免疫组化试剂盒步骤进行。DAB显色，抗HSA-AGEs稀释度为1:100。阴性对照用PBS代替抗HSA-AGEs抗体。阳性反应物(+)Maillard反应物(AGE)AGE-タニパヮ(AGE-BSA，HSA，Hb,Collagen)阴性反应物(-)Maillard反应前期生成非修饰タニパヮ(BSA，HSA，Hb,Collagen)。
1.3 统计分析
采用SPSS10.0统计软计包,进行χ2检验。
2 结果
2.1 分析不同组别阳性率的差异结果
动脉壁AGEs的免疫组化研究结果,在亲和层析纯化前,HSA-AGEs抗血清与HSA-AGEs、HSA、BSA-AGEs和BSA间均有交叉反应；经纯化后，HSA-AGEs抗体仅与HSA-AGEs和BSA-AGEs有反应，与HSA和BSA则无反应[4]。
2.2 光镜观察
2型糖尿病粥样硬化血管横截面的组织切片上，内膜及内膜下层AGES呈强阳性反应，而中膜AGEs的阳性反应且分布比较均匀，呈条索状。而非糖尿病者无动脉硬化，血管横截面的组织切片上，内膜、内膜下层及中膜AGEs呈阴性反应。非糖尿病动脉硬化血管横截面的组织切片上，内膜及内膜下层AGES呈阳性反应，中膜AGES的阳性反应分布均匀，亦呈条索状。结果见表1。表1 AGEs在上述三组标本中的表达(略)注：C与A、B组比较P<0.01,B与A比较P<0.05,C与B组比较P<0.05。
3 讨论
动脉粥样硬化病变的重要的病理特征之一是细胞外基质成分增加致使动脉壁增厚、变硬、弹性降低、脆性增加等。而AGEs增加了细胞外基质的生成或减少细胞外基质的降解。即抑制了胶原分子间正常的网络样结构。即AGEs在细胞外基质堆积，最终导致动脉壁增厚，弹性降低、功能失调。
糖基化终末产物是还原糖与蛋白质、氨基酸等的游离氨基通过一系列复杂的非酶促反应形成的结构多样的不可逆聚合物。AGEs对产生糖尿病并发症的作用途径可分为非受体途径和受体途径，而受体途径是AGEs引起糖尿病并发症主要和关键途径。AGEs的受体在多种细胞如巨噬细胞、内皮细胞、肾系膜细胞上均有发现[4]。本研究结果显示糖尿病动脉粥样硬化标本的免疫组化染色显示良好的AGEs与糖尿病动脉粥样硬化发病机制具有密切的相关性。AGEs与血管内皮细胞上AGEs受体结合后使血管壁通透性增加而不破坏其完整性导致内皮上AGEs大量沉积，且使内皮细胞表面抗凝酶的表达减少增加前凝血因子的活性，促进血栓形成[4]。
随着AGEs在血管壁的沉积，它能引起胶原纤维间过度的共价交联，这种交联使胶原纤维对蛋白酶类高度抵抗，降解缓慢，使得胶原纤维在组织中过度堆积，机械强度增加，血管硬化，顺应性降低[5]。此外，AGEs形成后即可产生或暴露大量活性基因。共价“浮获”多种血浆蛋白，如lgG、LDL等，并与之发生交联。血浆中的LDL亦可发生糖化修饰，生成AGE-LDL，从而引起LDL经其特异受体的清除障碍。Bucala等最近发现LDL中的载脂蛋白B(ApoB)的糖基化修饰部位正好是客观存在和LDL受体结合的部位。可见LDL的糖化修饰作用与高脂血症的发生关系密切。而血管内皮细胞下的LDL沉积则与粥样硬化的发生发展直接相关。
Kirstein等研究证实AGEs形成对单核细胞具有趋化活性：内皮细胞下的AGEs能选择性诱导单核细胞穿越完整的内皮细胞层。内皮细胞下的单核细胞一旦被激活，即能产生一系列介质，吸引并激活其他细胞，引起血管壁结构改变。其中的内皮细胞生长因子的表达最为重要，它能够促进平滑肌细胞有丝分裂活性，被认为在增殖性动脉粥样硬化的发展过程中起中心作用[6]。
长期高血糖导致的代谢紊乱，如过度的非酶糖化，多元醇代谢失衡、肌醇、磷脂代谢紊乱等，可以引起血管重建。糖尿病时组织中非酶糖化普遍存在，过度的AGEs堆积对机体组织结构有广泛的损害[1-3]。AGEs的检测方法有荧光法、免疫化学法和免疫组织化学法[7-8]。免疫化学法和免疫组织化学法所应用的AGEs抗体有多克隆抗体和单克隆抗体两类。本文采用多克隆抗体作主动脉壁AGEs的免疫组化研究，是考虑到AGEs是一类具有相同免疫特性和结构特性的化合物，但其抗原决定簇尚未确定[3、5]，应用AGEs多克隆抗体能校完整地反映AGEs的总量和非酶糖化程度。另一方面，由于非荧光性AGEs的存在[9]，免疫组织化学法较荧光法能更特异、更精确地测量AGEs的含量。世界卫生组织指出，随着糖尿病人的寿命的延长，糖尿病人慢性并发症已成为威胁糖尿病人生命的主要原因。随着AGEs的化学结构进一步明确，检测方法的不断完善，AGEs在糖尿病人慢性并发症发病机制中的作用将更为明确。从而可以做到对糖尿病人慢性并发症的早期诊断和有效防治。通过组断或减轻非酶糖化，是预防糖尿病人慢性并发症的关键。寻找理想的非酶糖化抑制剂是今后的一个重要课题。
参 考 文 献
[1]Brownlee M,Cerami A,Vlassara H.Advanced glycosylation end products in the tissue and the biochemical basis of diabetic complications[J].N Engl J Med,1988,318:315-132
[2]Monnier V.Nonenzymatic glycosylation the Maillard reaction and the aging process[J].J Gerontology,1990,45:13105-13111
[3]Brownlee M.Lilly.glycation and diabetic complications[J].Diabetes,1994,43:836-841
[4]Nalcamura Y,Horii Y,Nishino T,et al.Immunohistochemical location of advanced glycosylation end products in coronary atheroma and cardiactissue in diabetes mellitus[J].American Journal of Pathology,1993，143:1649
[5]Bucala R,Mitchell R,Amold K,et al.Indefication of the major site of apoliprotein B modification by advanced glycosylation end products blocking uptake by low density lipoprotein receptor[J].J Bilo chem,1995，270:10828
[6]Beisswenge PJ,Madita Z,Curphey TJ,et al.Formation of immunochemical advanced glycosylation end products precedes and correlates with early manifestation of renal and retinal disease in diabetes[J].Diabetes,1995,45:824
[7]Beisswenger PJ,Madita Z,Curphey TJ,et al.Formation of immunochemical advanced glycosylation end products precedes and correlates with early manifestation of renal and retinal disease in diabetes[J].Diabetes,1995,45:824
[8]Mitsuhashi T,Nakayama H,Itoh T,et al.Immunochemical detection of advanced glycation end products in renal cortex from STZ-Induced diabetic rat[J].Diabetes,1993,42:826
[9]Nakavama H,Mitsuhasni T,KuwaiimaS,et al.Immunochemical detection of advanced glycation end products in lens crystallins from streptozocin-induced diabetic rats[J].Diabetes,1993,42:345-350
作者单位：黑龙江省大庆油田总医院集团龙南医院, 百拇医药(王福银 王伟)
【关键词】 糖尿病 免疫组化研究 糖尿病并发症 糖基化代谢终末产物 动脉粥样硬化
血管重建(remodeling)是糖尿病并发症的重要病理基础，糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGEs)是引起血管重建的重要机制之一[1-3]。AGEs结构稳定，因此组织中AGEs可以反映糖尿病硬化血管非酶糖化和程度。本文采用AGEs多克隆抗体，进行血管壁AGEs的免疫组化分析，旨在研究糖尿病动脉粥样硬化血管壁糖化的程度。探讨过度的糖基化终末产物的堆积对血管的损害。
1 材料和方法
1.1 材料
A组16例非糖尿病者无动脉粥样硬化动脉血管、B组16例非糖尿病者动脉粥样硬化动脉血管和C组16例糖尿病者动脉硬化动脉血管蜡块为大庆市龙南医院病理科手术标本。
1.2 实验方法
采用免疫组织化学法检测AGEs在血管壁的分布情况,抗多克隆AGEs系日本和光纯药工业株式会社公司多克隆抗体(HSA-AGEs抗体)商品名ヮユモト(KH001)，S-P及DAB试剂盒购自SantaCruz公司。切片脱腊后，按S-P免疫组化试剂盒步骤进行。DAB显色，抗HSA-AGEs稀释度为1:100。阴性对照用PBS代替抗HSA-AGEs抗体。阳性反应物(+)Maillard反应物(AGE)AGE-タニパヮ(AGE-BSA，HSA，Hb,Collagen)阴性反应物(-)Maillard反应前期生成非修饰タニパヮ(BSA，HSA，Hb,Collagen)。
1.3 统计分析
采用SPSS10.0统计软计包,进行χ2检验。
2 结果
2.1 分析不同组别阳性率的差异结果
动脉壁AGEs的免疫组化研究结果,在亲和层析纯化前,HSA-AGEs抗血清与HSA-AGEs、HSA、BSA-AGEs和BSA间均有交叉反应；经纯化后，HSA-AGEs抗体仅与HSA-AGEs和BSA-AGEs有反应，与HSA和BSA则无反应[4]。
2.2 光镜观察
2型糖尿病粥样硬化血管横截面的组织切片上，内膜及内膜下层AGES呈强阳性反应，而中膜AGEs的阳性反应且分布比较均匀，呈条索状。而非糖尿病者无动脉硬化，血管横截面的组织切片上，内膜、内膜下层及中膜AGEs呈阴性反应。非糖尿病动脉硬化血管横截面的组织切片上，内膜及内膜下层AGES呈阳性反应，中膜AGES的阳性反应分布均匀，亦呈条索状。结果见表1。表1 AGEs在上述三组标本中的表达(略)注：C与A、B组比较P<0.01,B与A比较P<0.05,C与B组比较P<0.05。
3 讨论
动脉粥样硬化病变的重要的病理特征之一是细胞外基质成分增加致使动脉壁增厚、变硬、弹性降低、脆性增加等。而AGEs增加了细胞外基质的生成或减少细胞外基质的降解。即抑制了胶原分子间正常的网络样结构。即AGEs在细胞外基质堆积，最终导致动脉壁增厚，弹性降低、功能失调。
糖基化终末产物是还原糖与蛋白质、氨基酸等的游离氨基通过一系列复杂的非酶促反应形成的结构多样的不可逆聚合物。AGEs对产生糖尿病并发症的作用途径可分为非受体途径和受体途径，而受体途径是AGEs引起糖尿病并发症主要和关键途径。AGEs的受体在多种细胞如巨噬细胞、内皮细胞、肾系膜细胞上均有发现[4]。本研究结果显示糖尿病动脉粥样硬化标本的免疫组化染色显示良好的AGEs与糖尿病动脉粥样硬化发病机制具有密切的相关性。AGEs与血管内皮细胞上AGEs受体结合后使血管壁通透性增加而不破坏其完整性导致内皮上AGEs大量沉积，且使内皮细胞表面抗凝酶的表达减少增加前凝血因子的活性，促进血栓形成[4]。
随着AGEs在血管壁的沉积，它能引起胶原纤维间过度的共价交联，这种交联使胶原纤维对蛋白酶类高度抵抗，降解缓慢，使得胶原纤维在组织中过度堆积，机械强度增加，血管硬化，顺应性降低[5]。此外，AGEs形成后即可产生或暴露大量活性基因。共价“浮获”多种血浆蛋白，如lgG、LDL等，并与之发生交联。血浆中的LDL亦可发生糖化修饰，生成AGE-LDL，从而引起LDL经其特异受体的清除障碍。Bucala等最近发现LDL中的载脂蛋白B(ApoB)的糖基化修饰部位正好是客观存在和LDL受体结合的部位。可见LDL的糖化修饰作用与高脂血症的发生关系密切。而血管内皮细胞下的LDL沉积则与粥样硬化的发生发展直接相关。
Kirstein等研究证实AGEs形成对单核细胞具有趋化活性：内皮细胞下的AGEs能选择性诱导单核细胞穿越完整的内皮细胞层。内皮细胞下的单核细胞一旦被激活，即能产生一系列介质，吸引并激活其他细胞，引起血管壁结构改变。其中的内皮细胞生长因子的表达最为重要，它能够促进平滑肌细胞有丝分裂活性，被认为在增殖性动脉粥样硬化的发展过程中起中心作用[6]。
长期高血糖导致的代谢紊乱，如过度的非酶糖化，多元醇代谢失衡、肌醇、磷脂代谢紊乱等，可以引起血管重建。糖尿病时组织中非酶糖化普遍存在，过度的AGEs堆积对机体组织结构有广泛的损害[1-3]。AGEs的检测方法有荧光法、免疫化学法和免疫组织化学法[7-8]。免疫化学法和免疫组织化学法所应用的AGEs抗体有多克隆抗体和单克隆抗体两类。本文采用多克隆抗体作主动脉壁AGEs的免疫组化研究，是考虑到AGEs是一类具有相同免疫特性和结构特性的化合物，但其抗原决定簇尚未确定[3、5]，应用AGEs多克隆抗体能校完整地反映AGEs的总量和非酶糖化程度。另一方面，由于非荧光性AGEs的存在[9]，免疫组织化学法较荧光法能更特异、更精确地测量AGEs的含量。世界卫生组织指出，随着糖尿病人的寿命的延长，糖尿病人慢性并发症已成为威胁糖尿病人生命的主要原因。随着AGEs的化学结构进一步明确，检测方法的不断完善，AGEs在糖尿病人慢性并发症发病机制中的作用将更为明确。从而可以做到对糖尿病人慢性并发症的早期诊断和有效防治。通过组断或减轻非酶糖化，是预防糖尿病人慢性并发症的关键。寻找理想的非酶糖化抑制剂是今后的一个重要课题。
参 考 文 献
[1]Brownlee M,Cerami A,Vlassara H.Advanced glycosylation end products in the tissue and the biochemical basis of diabetic complications[J].N Engl J Med,1988,318:315-132
[2]Monnier V.Nonenzymatic glycosylation the Maillard reaction and the aging process[J].J Gerontology,1990,45:13105-13111
[3]Brownlee M.Lilly.glycation and diabetic complications[J].Diabetes,1994,43:836-841
[4]Nalcamura Y,Horii Y,Nishino T,et al.Immunohistochemical location of advanced glycosylation end products in coronary atheroma and cardiactissue in diabetes mellitus[J].American Journal of Pathology,1993，143:1649
[5]Bucala R,Mitchell R,Amold K,et al.Indefication of the major site of apoliprotein B modification by advanced glycosylation end products blocking uptake by low density lipoprotein receptor[J].J Bilo chem,1995，270:10828
[6]Beisswenge PJ,Madita Z,Curphey TJ,et al.Formation of immunochemical advanced glycosylation end products precedes and correlates with early manifestation of renal and retinal disease in diabetes[J].Diabetes,1995,45:824
[7]Beisswenger PJ,Madita Z,Curphey TJ,et al.Formation of immunochemical advanced glycosylation end products precedes and correlates with early manifestation of renal and retinal disease in diabetes[J].Diabetes,1995,45:824
[8]Mitsuhashi T,Nakayama H,Itoh T,et al.Immunochemical detection of advanced glycation end products in renal cortex from STZ-Induced diabetic rat[J].Diabetes,1993,42:826
[9]Nakavama H,Mitsuhasni T,KuwaiimaS,et al.Immunochemical detection of advanced glycation end products in lens crystallins from streptozocin-induced diabetic rats[J].Diabetes,1993,42:345-350
作者单位：黑龙江省大庆油田总医院集团龙南医院, 百拇医药(王福银 王伟)