氧应激在TNFα诱导血管内皮细胞HO-1基因表达中的作用
【摘要】目的 探讨氧应激在肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导血管内皮细胞血红素氧化酶-1(HO-1)基因表达中的作用。方法 RT-PCR法检测小鼠脑血管内皮细胞(BVEC)中HO-1 mRNA表达，用氧化-还原敏感的荧光探针2,7-Dichlorofluorescein(DCF)检测细胞内氧化-还原水平。结果 TNFα(5ng/ml)作用24h后，BVEC中HO-1的mRNA表达增加136%，但小分子抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC，20mmol/L)能明显阻断TNFα对HO-1mRNA表达的诱导作用；TNFα处理24h BVEC的氧应激水平明显升高，但可被NAC明显抑制(P<0.05)。结论 ROS部分介导了TNFα对HO-1基因表达的诱导作用。
【关键词】 氧应激 肿瘤坏死因子α 血管内皮细胞 血红素氧化酶-1
Roles of Oxygen Stress on TNFα-induced Expression of Heme Oxygenase-1 Gene in Vascular Endothelial Cells
Lin Yu,et al.
(Department of Pharmacology,Qiqihar Medical College,Heilongjiang Province,161042)
【Abstract】 Objective To investigate the roles of oxidative stress on tumor necrosis factor α(TNFα)-induced expression of HO-1 gene in vascular endothelial cells.Methods The expression of the HO-1 mRNA in Brain Vascular Endothelial Cells(BVEC)was measured by RT-PCR methods; The oxidative stress was measured in the cells by using 2,7-Dichlorofluor-escein(DCF) diacetate as probe.Results Stimulation for 24h by TNFα(5ng/ml) caused an increase of 136% in the mRNA expression of the HO-1,but this induced by TNFαwas blocked by NAC(20mmol/L).Enhanced oxidative stress was found in the TNFα-treated cells at 24h,and that was also inhibited by NAC(P<0.05).Conclusions ROS may play a major role in the TNFα-induced up-regulation of HO-1 gene.
【Key words】 Oxidative stress Tumor necrosis factor Vascular endothelial cells Heme oxygenase-1
血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是一应激蛋白，是血红素降解的限速酶。最近的研究表明，HO代谢血红素生成的与气体信号分子NO功能相似的细胞信使CO和抗氧化剂胆绿素和胆红素，它们在心血管系统中有重要的作用[1]。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNFα)是一多效的细胞因子，在许多急性和慢性炎症中有重要的作用。最近研究表明TNFα能诱导血管内皮细胞HO-1基因表达，可是下游信号机制还不清楚。文献报道TNFα可使细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)增加[2]。ROS作为细胞内第二信使，参与信号转导途径调节，并最终影响基因转录和蛋白翻译后修饰，但目前并不清楚ROS在TNFα诱导内皮细胞HO-1基因表达中的作用。本实验利用小鼠脑血管内皮细胞(Brain Vascular Endothelial Cells，BVEC)探讨氧应激在TNFα引起HO-1基因表达中的作用。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和材料
小鼠脑血管内皮细胞由中日友好医院临床医学研究所惠赠，DMEM培养基和胰蛋白酶购于Gibco公司，ECGS购于B&D公司，rmTNFα购于R&D公司，NAC和DCF为Sigma公司产品，其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 脑血管内皮细胞的培养和处理
细胞按常规方法复苏、换液、传代，将细胞接种于6孔板内，待培养至90%融合后用TNFα(5ng/ml)或NAC(20mmol/L)处理，同时设立对照组。
1.3 HO-1mRNA表达的检测
采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞HO-1mRNA的表达。细胞传至第三代，接种到六孔板中，培养至细胞铺满90%后加入TNFα(5ng/ml)或先用小分子抗氧化剂NAC(20mmol/L)预处理1h，然后再加入TNFα作用24h。用TRIZOL试剂提取总RNA，测定OD260/OD280值进行RNA纯度及含量计算。取2μg总RNA进行逆转录反应。反应体系为25μL，含mmol/L Tris-HCl(Ph8.3)50，MgCl2 2，KCl 30，DTT 10，dNTPs 0.5，5μmol/L的随机引物和50U的逆转录酶(MMLV)。37℃反应60min。取2μl逆转录产物进行PCR反应，反应体系25μl。引物5’-ACAGATGGCGTCACTTCGTCAG-3’(上游)和5’-AAACACAGGGAGTGGGCTAGG-3’(下游)用以检测HO-1基因mRNA的表达，扩增片段长度为318bp。同时设置GAPDH作为内参照，其上游引物为5’-GTGGAGCCAAAAGGGTCATC-3’，下游5’-GACAACCTGGTCCTCAGTGTAGC-3’，扩增片段长度为506bp。反应条件为预变性94℃3min，94℃45s，55℃1min，72℃45s，循环28次，末端延伸72℃5min。PCR产物上样于2%琼脂糖凝胶进行电泳，UV照相和密度扫描。
1.4 细胞内氧化-还原状态的检测
采用DCF检测细胞内的氧化-还原状态。DCF是一种分子荧光探针，它以二乙酯的形式进入细胞,在细胞内被ROS介导的氧化作用转变为强荧光物质，其发射荧光强度反映氧应激水平。于测定ROS前，在经过上述处理的BVEC中加入50μmol/L DCF，作用50min。用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集至1.5ml EP管中，细胞用Hank’s 液洗2次，用1mL Hank’s 液重悬细胞，然后用荧光分光光度计测定荧光强度(fluorescence inten-sity，FI)，其激发波长为488nm,发射波长为510nm。
1.5 统计学处理
实验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较用Student’s test。
2 结果
2.1 抗氧化剂NAC对TNFα诱导BVEC中HO-1 mRNA 表达的影响
与正常对照组比较，TNFα作用于BVEC 24h后HO-1 mRNA表达增加136%，而20mmol/L的NAC预处理能明显抑制TNFα对HO-1 mRNA表达的诱导作用(图1)。
2.2 TNFα对BVEC内氧化-还原状态的影响和抗氧化剂NAC的抑制作用 TNFα作用于BVEC 24h，荧光强度增高明显增高(P<0.05)，而预先经NAC处理后，TNFα刺激不再致BVEC内的氧应激水平升高(图2)。
3 讨论
血管内皮是血液和平滑肌之间的屏障，具有分泌多种活性物质、感受刺激和转导信号的作用。正常内皮细胞能合成和分泌多种活性因子参与维持体内如凝血和抗凝血、血管舒张与收缩、等各方面的平衡。各种病理因素作用于血管内皮细胞使其功能发生障碍，是引起高血压、动脉粥样硬化、血栓等心脑血管疾病的主要原因[3]。HO是体内一种多功能微粒体氧化酶，催化血红素分解，生成信号分子CO和胆绿素。胆绿素可被进一步还原为胆红素，是重要的抗氧化剂。HO-1属于诱导性的HO，可被炎症介质、氧化剂和重金属离子等诱导表达[4]。
TNFα是具有多种生物学效应的细胞因子，动脉粥样硬化(AS)斑块中TNFα阳性率高达90%，且与AS的严重程度成正比[5]。有文献报道TNFα可以引起血管内皮细胞HO-1的表达，本研究也验证了这一结果，但有关TNFα通过何种途径增加HO-1的表达水平尚未见报道。本实验观察到TNFα可使内皮细胞中的氧应激水平升高和HO-1的mRNA表达增加，而抗氧化剂NAC可阻断TNFα引起的氧应激水平升高，也可阻断TNFα诱导的血管内皮细胞HO-1表达。上述结果提示，ROS在TNFα诱导内皮细胞HO-1基因表达中可能起主要作用。
近年来，ROS在血管内皮细胞损伤中的作用逐渐受到重视。ROS的过度产生或与其清除防御机制的失衡能够导致氧化应激，损害血管内皮细胞的功能，甚至导致细胞凋亡或坏死[6]。ROS主要通过调节氧化-还原敏感的转录因子影响基因的表达。细胞内对氧化-还原敏感的转录因子包括NF-κB和AP-1。HO-1基因启动子区域也含有这两个转录因子的结合位点，但ROS是否通过这两个转录因子最终介导了TNFα对内皮细胞HO-1基因表达的诱导作用，尚需实验证实。
参 考 文 献
[1]Maines MD.The heme oxygenase system:a regulator of second messenger gases[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,1997,37:517-554
[2]Chandrasekar B,Colston JT,Rosa SD，et al.TNF-aloha and H2O2 induced IL-18 and IL-18Rbeta expression in cardiomyocytes via NF-kappaBactivation[J].Biochem Biophys Res Commun,2003,303(4):1152-1158
[3]Rubanyi GM.The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and disease[J].J Cardiovasc Pharmacol，1993,22(Sup):1-14
[4]Soares MP,Seldon MP,Gregoure IP,et al.Heme oxygenase-1 modulates the expression of adhesion molecules associated with endothelial cell activation[J].J Immunol,2004,172(6):3553-3563
[5]Young JL,Liby P,Schonbeck U.Cytokines in the pathogenesis of atherosclerosis[J].Thromb Haemost,2002,88(4):554-567
[6]Li JM,Shah AM.Mechanism of endothelial cell NADPH oxidase activation by angiotensin II[J].Bio Chem.2003,278:12094-12100
作者单位：齐齐哈尔医学院药理教研室(林宇、许莉)
中国协和医科大学基础医学院(王小明), http://www.100md.com(林宇 许莉 王小明)
【关键词】 氧应激 肿瘤坏死因子α 血管内皮细胞 血红素氧化酶-1
Roles of Oxygen Stress on TNFα-induced Expression of Heme Oxygenase-1 Gene in Vascular Endothelial Cells
Lin Yu,et al.
(Department of Pharmacology,Qiqihar Medical College,Heilongjiang Province,161042)
【Abstract】 Objective To investigate the roles of oxidative stress on tumor necrosis factor α(TNFα)-induced expression of HO-1 gene in vascular endothelial cells.Methods The expression of the HO-1 mRNA in Brain Vascular Endothelial Cells(BVEC)was measured by RT-PCR methods; The oxidative stress was measured in the cells by using 2,7-Dichlorofluor-escein(DCF) diacetate as probe.Results Stimulation for 24h by TNFα(5ng/ml) caused an increase of 136% in the mRNA expression of the HO-1,but this induced by TNFαwas blocked by NAC(20mmol/L).Enhanced oxidative stress was found in the TNFα-treated cells at 24h,and that was also inhibited by NAC(P<0.05).Conclusions ROS may play a major role in the TNFα-induced up-regulation of HO-1 gene.
【Key words】 Oxidative stress Tumor necrosis factor Vascular endothelial cells Heme oxygenase-1
血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是一应激蛋白，是血红素降解的限速酶。最近的研究表明，HO代谢血红素生成的与气体信号分子NO功能相似的细胞信使CO和抗氧化剂胆绿素和胆红素，它们在心血管系统中有重要的作用[1]。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNFα)是一多效的细胞因子，在许多急性和慢性炎症中有重要的作用。最近研究表明TNFα能诱导血管内皮细胞HO-1基因表达，可是下游信号机制还不清楚。文献报道TNFα可使细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)增加[2]。ROS作为细胞内第二信使，参与信号转导途径调节，并最终影响基因转录和蛋白翻译后修饰，但目前并不清楚ROS在TNFα诱导内皮细胞HO-1基因表达中的作用。本实验利用小鼠脑血管内皮细胞(Brain Vascular Endothelial Cells，BVEC)探讨氧应激在TNFα引起HO-1基因表达中的作用。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和材料
小鼠脑血管内皮细胞由中日友好医院临床医学研究所惠赠，DMEM培养基和胰蛋白酶购于Gibco公司，ECGS购于B&D公司，rmTNFα购于R&D公司，NAC和DCF为Sigma公司产品，其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 脑血管内皮细胞的培养和处理
细胞按常规方法复苏、换液、传代，将细胞接种于6孔板内，待培养至90%融合后用TNFα(5ng/ml)或NAC(20mmol/L)处理，同时设立对照组。
1.3 HO-1mRNA表达的检测
采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞HO-1mRNA的表达。细胞传至第三代，接种到六孔板中，培养至细胞铺满90%后加入TNFα(5ng/ml)或先用小分子抗氧化剂NAC(20mmol/L)预处理1h，然后再加入TNFα作用24h。用TRIZOL试剂提取总RNA，测定OD260/OD280值进行RNA纯度及含量计算。取2μg总RNA进行逆转录反应。反应体系为25μL，含mmol/L Tris-HCl(Ph8.3)50，MgCl2 2，KCl 30，DTT 10，dNTPs 0.5，5μmol/L的随机引物和50U的逆转录酶(MMLV)。37℃反应60min。取2μl逆转录产物进行PCR反应，反应体系25μl。引物5’-ACAGATGGCGTCACTTCGTCAG-3’(上游)和5’-AAACACAGGGAGTGGGCTAGG-3’(下游)用以检测HO-1基因mRNA的表达，扩增片段长度为318bp。同时设置GAPDH作为内参照，其上游引物为5’-GTGGAGCCAAAAGGGTCATC-3’，下游5’-GACAACCTGGTCCTCAGTGTAGC-3’，扩增片段长度为506bp。反应条件为预变性94℃3min，94℃45s，55℃1min，72℃45s，循环28次，末端延伸72℃5min。PCR产物上样于2%琼脂糖凝胶进行电泳，UV照相和密度扫描。
1.4 细胞内氧化-还原状态的检测
采用DCF检测细胞内的氧化-还原状态。DCF是一种分子荧光探针，它以二乙酯的形式进入细胞,在细胞内被ROS介导的氧化作用转变为强荧光物质，其发射荧光强度反映氧应激水平。于测定ROS前，在经过上述处理的BVEC中加入50μmol/L DCF，作用50min。用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集至1.5ml EP管中，细胞用Hank’s 液洗2次，用1mL Hank’s 液重悬细胞，然后用荧光分光光度计测定荧光强度(fluorescence inten-sity，FI)，其激发波长为488nm,发射波长为510nm。
1.5 统计学处理
实验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较用Student’s test。
2 结果
2.1 抗氧化剂NAC对TNFα诱导BVEC中HO-1 mRNA 表达的影响
与正常对照组比较，TNFα作用于BVEC 24h后HO-1 mRNA表达增加136%，而20mmol/L的NAC预处理能明显抑制TNFα对HO-1 mRNA表达的诱导作用(图1)。
2.2 TNFα对BVEC内氧化-还原状态的影响和抗氧化剂NAC的抑制作用 TNFα作用于BVEC 24h，荧光强度增高明显增高(P<0.05)，而预先经NAC处理后，TNFα刺激不再致BVEC内的氧应激水平升高(图2)。
3 讨论
血管内皮是血液和平滑肌之间的屏障，具有分泌多种活性物质、感受刺激和转导信号的作用。正常内皮细胞能合成和分泌多种活性因子参与维持体内如凝血和抗凝血、血管舒张与收缩、等各方面的平衡。各种病理因素作用于血管内皮细胞使其功能发生障碍，是引起高血压、动脉粥样硬化、血栓等心脑血管疾病的主要原因[3]。HO是体内一种多功能微粒体氧化酶，催化血红素分解，生成信号分子CO和胆绿素。胆绿素可被进一步还原为胆红素，是重要的抗氧化剂。HO-1属于诱导性的HO，可被炎症介质、氧化剂和重金属离子等诱导表达[4]。
TNFα是具有多种生物学效应的细胞因子，动脉粥样硬化(AS)斑块中TNFα阳性率高达90%，且与AS的严重程度成正比[5]。有文献报道TNFα可以引起血管内皮细胞HO-1的表达，本研究也验证了这一结果，但有关TNFα通过何种途径增加HO-1的表达水平尚未见报道。本实验观察到TNFα可使内皮细胞中的氧应激水平升高和HO-1的mRNA表达增加，而抗氧化剂NAC可阻断TNFα引起的氧应激水平升高，也可阻断TNFα诱导的血管内皮细胞HO-1表达。上述结果提示，ROS在TNFα诱导内皮细胞HO-1基因表达中可能起主要作用。
近年来，ROS在血管内皮细胞损伤中的作用逐渐受到重视。ROS的过度产生或与其清除防御机制的失衡能够导致氧化应激，损害血管内皮细胞的功能，甚至导致细胞凋亡或坏死[6]。ROS主要通过调节氧化-还原敏感的转录因子影响基因的表达。细胞内对氧化-还原敏感的转录因子包括NF-κB和AP-1。HO-1基因启动子区域也含有这两个转录因子的结合位点，但ROS是否通过这两个转录因子最终介导了TNFα对内皮细胞HO-1基因表达的诱导作用，尚需实验证实。
参 考 文 献
[1]Maines MD.The heme oxygenase system:a regulator of second messenger gases[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,1997,37:517-554
[2]Chandrasekar B,Colston JT,Rosa SD，et al.TNF-aloha and H2O2 induced IL-18 and IL-18Rbeta expression in cardiomyocytes via NF-kappaBactivation[J].Biochem Biophys Res Commun,2003,303(4):1152-1158
[3]Rubanyi GM.The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and disease[J].J Cardiovasc Pharmacol，1993,22(Sup):1-14
[4]Soares MP,Seldon MP,Gregoure IP,et al.Heme oxygenase-1 modulates the expression of adhesion molecules associated with endothelial cell activation[J].J Immunol,2004,172(6):3553-3563
[5]Young JL,Liby P,Schonbeck U.Cytokines in the pathogenesis of atherosclerosis[J].Thromb Haemost,2002,88(4):554-567
[6]Li JM,Shah AM.Mechanism of endothelial cell NADPH oxidase activation by angiotensin II[J].Bio Chem.2003,278:12094-12100
作者单位：齐齐哈尔医学院药理教研室(林宇、许莉)
中国协和医科大学基础医学院(王小明), http://www.100md.com(林宇 许莉 王小明)