铁皮石斛_化学；_石斛碱_生物合成；_基因文库_

铁皮石斛互补脱氧核糖核酸表达文库的构建及分析

http://www.100md.com 《广州中医药大学学报》 2006年第1期

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     摘要：【目的】构建铁皮石斛互补脱氧核糖核酸(cDNA)表达文库，为克隆石斛活性成分生物合成相关功能基因的全长奠定基础。【方法】以Trizol一步法从4年生的铁皮石斛中提取总RNA，分离纯化mRNA，LD_PCR(long distance polymerase chain reaction)法反转录合成双链cDNA，以λTripIEX2为载体，构建铁皮石斛cDNA文库，文库滴度以每mL含噬菌斑形成单位(pfu)的数目来表示，PCR扩增鉴定插入片段。【结果】成功地构建了铁皮石斛cDNA表达文库，原始文库的噬菌斑滴度为43×105?pfu/mL，总克隆数为31×105，重组率为976%，扩增后文库总滴度为68×109?pfu/mL，对随机挑取的噬菌斑进行PCR鉴定，结果插入片段多分布在05～20?kb之间，绝大部分在12～17?kb左右。【结论】文库质量鉴定结果表明，所构建的铁皮石斛cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。

    关键词：铁皮石斛/化学；石斛碱/生物合成；基因文库

    中药功能基因的研究逐渐成为中药现代化研究的一个热点，因为功能基因和次生代谢酶基因决定了有效成分的结构与功能，是中药现代化的关键环节之一[1]。在植物中药功能基因研究中，与基因组测序和表达序列标记(expressed sequence tag，ESTs)测序相比，药用活性成分生物合成相关基因的研究更受到重视，克隆基因的数量呈上升趋势，预示着天然产物后基因组时代的开启及一些天然产物生产方式的可能变革。人们期望克隆中药有效成分的功能基因，并通过基因工程与化学的有机结合而形成新的基因药物。

    石斛为名贵中药材，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身等功效。石斛碱是石斛药材中最重要的活性成分之一，也是最早从石斛中分离出来的化合物[2-3]，为分离、克隆石斛碱相关功能基因，本文构建了铁皮石斛互补脱氧核糖核酸(cDNA)表达文库，为克隆全长石斛碱生物合成相关功能基因并进行功能鉴定奠定基础。

    1 材料与方法

    11 材料供试铁皮石斛采自云南大理，由中国科学院华南植物研究所叶秀嶙研究员提供，保种于本实验室。

    12 主要试剂与仪器 Trizol试剂酶购自Gibco公司；信使核糖核酸(mRNA)分离纯化试剂盒购自Promega公司；cDNA文库试剂盒购自Clontech公司；Sfi I购自Biolabs公司；焦碳酸二乙脂(DEPC)购自上海生工公司(Amresco分装)；其他常规生化试剂均为分析纯 ......

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