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编号:11315788
ILKsiRNADNA表达载体的构建
http://www.100md.com 《东南大学学报(医学版)》 2006年第6期
小干扰RNA;质粒;整合素连接激酶;构建,,]小干扰RNA;质粒;整合素连接激酶;构建,1材料与方法,2结果,3讨论,[参考文献]
     [摘要]目的:构建针对整合素连接激酶(ILK)mRNA的小干扰RNA(siRNA)表达载体,为抑制ILK在哺乳动物细胞内表达、研究其功能奠定基础。方法:合成含靶向ILK基因siRNA转录模板的茎环结构,与两端分别有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的Psilencer 3.1质粒连接,大肠杆菌中扩增,测序鉴定。结果:转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,重组质粒电泳初步说明质粒构建成功,测序结果表明Psilencer 3.1酶切位点BamHⅠ、HindⅢ之间有64 bp的插入片段,其序列与所设计、合成的ILKsiRNA转录模板序列一致。结论:siRNA转录模板完整正确地插入Psilencer 3.1质粒中。

    [关键词]小干扰RNA;质粒;整合素连接激酶;构建

    自1998年Fire等[1]用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术阻断特定基因的表达以来,RNA干扰(RNA interference,RNAi)已发展成为一种经济、快捷、高效抑制基因表达的有力工具。siRNA是一种19个碱基互补配对、两端分别有两个碱基突出的2123nt的双链RNA,可以与细胞内核酶形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silence complex,RISC)。在其中一条RNA链的引导下,RISC特异性降解与siRNA同源的mRNA[2]。siRNA制备方法有多种,各有其优缺点,但若是在哺乳动物细胞内持续稳定表达siRNA,长久抑制靶基因,以小的茎环结构RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体的方法和稳定筛选的技术最为有效[34]。整合素连接激酶(integrin linked kinase,ILK)是Hannigan等[5]于1996年首先发现的一种能与整合素结合的具有452个氨基酸残基的Ser/Thr蛋白激酶。有研究表明,ILK在肾小管上皮细胞间充质转分化(epithelialmesenchymal transition,EMT)中发挥了重要作用[6]。本研究拟构建一个ILKsiRNA表达载体,用此载体转染肾小管上皮细胞株,为应用RNAi技术抑制ILK表达,进一步研究ILK在肾小管EMT中的作用提供物质基础和技术支持。

     1 材料与方法

    1.1 材料Psilencer 3.1 H1 Hygro 即用型线性质粒购自Ambion公司 ......

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