含RIZ1 PR结构域融合蛋白的原核表达、提纯与功能分析
RIZ1蛋白；PR结构域；表达载体；组蛋白甲基化作用,,]RIZ1蛋白；PR结构域；表达载体；组蛋白甲基化作用,含RIZ1PR结构域融合蛋白的原核表达、提纯与功能分析,1材料与方法,2结果,3讨
[摘要]目的:表达与提纯RIZ1第1个至第200个氨基酸含PR结构域的活性GST融合蛋白质(GSTPR200融合蛋白)。方法:设计引物以含人RIZ1 cDNA全序列的pRIZ1 RH质粒为模板克隆获得目的基因片段，测序核对后经EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切，以正确阅读框架插入相同酶切的pGEX6P3中，经转染与IPTG诱导表达筛选到阳性大肠杆菌克隆并提纯该融合蛋白质。分别采用SDSPAGE蛋白电泳法、质谱分析法及组蛋白甲基化转移酶(HMT)测定法鉴定其性质与功能。结果：获得的纯化融合蛋白质相对分子质量约为47 000，其CPM值明显高于对照组(P<001)，且与作用时间呈正相关。结论:所构建的融合蛋白原核表达系统能有效表达活性GSTPR200融合蛋白，可供大量提取作进一步研究。[关键词]RIZ1蛋白；PR结构域；表达载体；组蛋白甲基化作用
RIZ1是功能性筛选能与视网膜母细胞瘤(RB)肿瘤抑制因子相结合的蛋白质时分离出来的基因。已发现由于不同启动子的作用，RIZ1可以表达两种蛋白产物，即氨基端含有PR结构域的全长产物RIZ1(1719个氨基酸)，以及除缺少RIZ1氨基末端200个氨基酸(包含PR结构域)外其余序列与RIZ1完全相同的RIZ2[1]。研究表明，RIZ1而非RIZ2具有肿瘤抑制特性。一般来说，RIZ1定位于人染色体1p36，为多种不同类型人癌组织所缺失[2]。许多人类肿瘤，如肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤、肺癌、黑素瘤、骨肉瘤的组织中出现RIZ1而非RIZ2表达沉默[35]。我们初步研究也发现，人乳腺癌组织中存在RIZ1 mRNA表达的改变[6]。人癌组织和细胞株中RIZ1错义失活性突变均出现在PR结构域内或其附近[7]。在乳腺癌细胞系、肝癌细胞系中由腺病毒介导的RIZ1表达可以造成细胞G2M期阻滞和(或)细胞凋亡[35]。更重要的是基因敲除鼠若无RIZ1表达而仅有RIZ2表达，则易发生胃癌和B细胞淋巴瘤[7]。通过以上研究可以确定PR结构域与肿瘤的发生有直接联系，因此，目前认为RIZ1抑制肿瘤的作用与其PR结构域有关。为了更好地研究RIZ1 PR结构域的功能与结构，我们采用基因工程技术合成并提纯了RIZ1氨基末端含PR结构域的200个氨基酸的融合蛋白，并初步探讨了其体外功能，现报道如下。
1 材料与方法
11 材料pRIZ1 RH质粒由本研究组保存；原核表达载体质粒pGEX6P3购自Amersham Biosciences公司，是一种融合蛋白表达载体，含一个可编码谷胱甘肽S转移酶(GST)的读码框架 ......
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