双亲嵌段共聚物P103对牛血清白蛋白构象的影响
摘要 利用傅立叶变换红外光谱和傅立叶变换拉曼光谱研究了牛血清白蛋白(BSA)与双亲嵌段共聚物P103作用过程中蛋白质构象的变化规律。研究表明，当P103浓度较低时，BSA二级结构变化不大，当P103浓度为16 g/L或以上时，α螺旋结构由45.9%降至40%以下，β折叠结构升高，由6.1%增至17%左右，同时无规结构略微下降。P103的加入主要改变BSA分子内部氢键的结合方式，使α螺旋结构转变为β折叠结构；P103的加入还影响BSA中氨基酸侧链的微环境变化和蛋白质二硫键的构象变化。
关键词 双亲嵌段共聚物，牛血清白蛋白，傅利叶变换红外光谱，傅利叶变换拉曼光谱
1 引言
双亲嵌段共聚物聚氧乙烯聚氧丙烯聚氧乙烯(简写为PEOPPOPEO)是一类非离子型高分子表面活性剂，它是由亲水性的聚合物链段和亲油性的聚合物链段通过共价键结合在一起的高分子化合物，结构式如下：
H[CH2-CH2-O]m-[CH(CH3)-CH2-O]n-[CH2-CH2-O]mH作为一种非离子型表面活性剂，PEOPPOPEO双亲嵌段共聚物与蛋白质的相互作用较弱，对蛋白质的结构和构象的影响较小，有利于PEOPPOPEO双亲嵌段共聚物在生物体系的应用，例如双亲嵌段共聚物吸附在固体表面后，可以阻止蛋白质的吸附，这一特性应用于药物载体、分离过程的膜和隐形眼镜的材料等[1]。系统的进行双亲嵌段共聚物水溶液体系弱相互作用的研究，一方面可以促进嵌段共聚物理论研究领域的发展，另一方面将推动双亲嵌段共聚物在医药、生物化工、生态环境等方面的应用，并扩展新的应用领域。本实验室从1997年起开展PEOPPOPEO双亲嵌段共聚物的研究工作，从分子水平研究了双亲嵌段共聚物之间的相互作用，提出温度依赖的聚合物胶团形成机理，并对盐、小分子有机物和蛋白质对双亲嵌段共聚物物化性质的影响进行了初步探索，为系统研究双亲嵌段共聚物复杂体系的相互作用打下了基础[2～4]。本研究的主要目的是利用FTIR和FTRaman技术，研究牛血清白蛋白与双亲嵌段共聚物P103作用过程中蛋白质构象的变化规律，分析和了解蛋白质与嵌段共聚物P103之间的相互作用。
2 实验部分
2.1 试剂和仪器牛血清蛋白(BSA，美国Sigma公司)，纯度98%；嵌段共聚物P103：BASF公司生产，未处理直接使用。VECTOR22傅立叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司)，BaF2晶体窗片，扫描次数64次，分辨率2 cm-1；RFS100傅立叶变换拉曼光谱仪(德国Bruker公司)，分辨率2 cm-1，激光功率400 mW，扫描次数2000次。谱图使用OPUS软件进行数据处理，包括水峰差减、去卷积和曲线拟合等处理方法。
2.2 样品制备 所有溶液均用pH值为7的磷酸缓冲溶液配置。配置BSA和Pluronic P103磷酸缓冲液母液，于4℃冰箱中密封放置。测量之前将BSA母液分别与不同浓度的Pluronic P103母液混合，保持混合液中BSA的最终浓度红外为10 g/L，拉曼光谱为100 g/L，混合液于4℃冰箱中密封放置12 h后测量。
3 结果与讨论
3.1 FTIR光谱分析双亲嵌段共聚物P103对BSA二级结构的影响将10 g/L BSA水溶液红外谱图进行水峰差减可以获得蛋白质的酰胺Ⅰ带谱图，如图1所示，是一个无明显特征的宽峰；对酰胺Ⅰ带去卷积处理获得的去卷积谱图有许多复杂的组分峰[6]，分别位于1620、1630、1645、1653、1662、1674和1680 cm-1附近，蛋白质的理论计算和模型实验都证实，酰胺Ⅰ区中的α螺旋结构的峰位于1650～1660 cm-1之间，1653 cm-1峰是外部的α螺旋结构，1662 cm-1峰是内部的α螺旋结构；β折叠结构在酰胺Ⅰ区中的位置一般在1620和1680 cm-1附近；位于1630 cm-1的谱带是连接α螺旋结构的小片段，1645 cm-1是无规卷曲结构，1674 cm-1左右谱带是转角结构，本研究将1630、1645和1674 cm-1这三部分谱峰都归结为无规结构。根据去卷积谱图的组分峰对酰胺Ⅰ带谱图进行曲线拟和，获得各个子峰的峰面积，各个子峰的峰面积占总的峰面积的百分比就是各种二级结构所占的百分比(图1)。实验中所测得BSA的二级结构组成为：45.9%α螺旋结构、6.1%β折叠结构和48%的无规则结构。
图1 BSA的酰胺Ⅰ带的水峰差减谱带、去卷积谱带和拟合谱带(略)
Fig.1 Substraction spectra, deconvoluted spectra and fitted spectra of amide band of bovine serum albumin (BSA)
1. 减谱(substraction spectra); 2. 去卷积谱(deconvoluted spectra); 3. 拟合谱(fitted spectra)。
在BSA水溶液中分别加入不同浓度的双亲嵌段共聚物P103，当P103与BSA混匀后立刻测量时，BSA的酰胺Ⅰ带没有发生任何变化。图2是P103与BSA混合均匀后放置12 h测量得到的BSA酰胺Ⅰ带的谱图，可以看出，即使二者相互作用12 h后测量，BSA酰胺Ⅰ带的谱峰峰形和峰位仍然变化不大，只是略微向低波数移动，谱峰稍微变宽，说明P103对BSA二级结构的影响较弱。对不同Pluronic P103浓度下的BSA酰胺Ⅰ带进行水峰差减，去卷积和曲线拟合，可以获得不同Pluronic P103浓度下BSA二级结构的变化规律，如图3所示。
图2 BSA在不同P103浓度下的酰胺Ⅰ带谱图(12 h)(略)
Fig.2 Amide band of BSA in various concentration of Pluronic P103 (12 h)
P103: a. 0 g/L; b. 8 g/L; c. 16 g/L; d. 24 g/L; e. 32 g/L; f. 40 g/L.
图3 双亲嵌段共聚物P103的浓度对BSA二级结构的影响(略)
Fig.3 Effect of poly(ethylene oxide)poly(propylene oxide)poly(ethylene oxide) (Pluronic P103) concentrations on the secondary structure of BSA
a.α螺旋(αhelix); b.β折叠(βsheet)； c.无规卷曲(random coil)。
由图3可知，当P103浓度为8 g/L时，BSA的二级结构几乎没有什么变化，当加入的P103浓度为16 g/L或以上时，α螺旋结构由45.9%降低至40%以下，α螺旋结构的降低伴随着β折叠结构的升高，由6.1%增加至17%左右，同时无规结构略微下降。P103的加入主要改变了BSA分子内部氢键的结合方式，蛋白质由α螺旋结构转变为β折叠结构，基本上不导致BSA内部氢键的破裂。3.2 FTRaman分析双亲嵌段共聚物P103对BSA构象的影响图4是40 g/L P103，100 g/L BSA以及二者混合液的拉曼谱图经过水峰差减的谱图，由图4可见，不受双亲嵌段共聚物P103干扰的BSA谱带主要有二硫键的伸缩振动谱带(510 cm-1)、苯丙氨酸的特征谱带(1004 cm-1)、酪氨酸的特征谱带(1210 cm-1)和色氨酸的特征谱带(1553 cm-1)。比较了单纯BSA的拉曼谱带和BSA中加入P103的拉曼谱带中氨基酸侧链的特征谱带。由图5可见，苯丙氨酸1004 cm-1谱带峰强减小并且略微向高波数移动，说明加入Pluronic P103之后苯丙氨酸所处环境的疏水性降低，苯丙氨酸向蛋白质的表面移动；酪氨酸1210 cm-1谱带略微向高波数移动而且峰强略微增加，说明酪氨酸所处的微环境变化不大，而色氨酸1553 cm-1谱带的峰强增加并且略微向低波数移动，说明色氨酸所处的环境疏水性增加，色氨酸在Pluronic P103加入之后更加埋藏在蛋白质的内部。SS伸缩振动频率对蛋白质的构象变化非常敏感，拉曼光谱被广泛的应用于探测蛋白质和多肽中的二硫键的构象。对大量已知结构的模型化合物研究证明，二硫键的对称伸缩振动频率与CαCβSSCβCα中的碳原子构象有关。当这些碳原子的构象呈扭曲扭曲扭曲(ggg)时ν(SS)出现在510附近，构象为扭曲扭曲反式(ggt)时，出现在525 cm-1附近，而构象为反式扭曲反式(tgt)时，出现在540 cm-1附近。
图4 BSA水溶液的拉曼差减光谱、BSA溶于P103水溶液中的拉曼差减光谱和P103水溶液的拉曼差减光谱(略)
Fig.4 Raman substraction spectra of three aqueous solutions: BSA, BSA and P103, P103
图5 BSA水溶液的拉曼差减光谱和BSA溶于P103水溶液中的拉曼差减光谱(略)
Fig.5 Raman substraction spectra of BSA, BSA and P103
图6比较了BSA二硫键振动谱带在加入双亲嵌段共聚物P103前后的变化情况。未加入双亲嵌段共聚物P103时，BSA的拉曼光谱中只出现510左右的SS伸缩振动谱带，推断BSA的二硫键只存在ggg构象。当加入双亲嵌段共聚物P103之后，二硫键的振动谱带强度变弱，并且在520 cm-1附近出现了一个肩峰，是二硫键的扭曲扭曲反式(ggt)构象。对加入Pluronic P103之后的二硫键振动谱带进行曲线拟合获得两个子峰，分别位于520 cm-1和505 cm-1，这两个峰的峰强之比就是扭曲(扭曲扭曲g(gg)构象与扭曲扭曲反式(ggt)构象之比；BSA有17个二硫键，因此纯BSA有17个ggg构象的二硫键，而加入Pluronic P103之后，BSA有11个二硫键是ggg构象，另外6个二硫键是ggt构象。双亲嵌段共聚物的加入影响了蛋白质的三级结构，进而影响蛋白质中的侧链基团所处的微环境和蛋白质中二硫键的构象，而影响蛋白质三级结构的主要作用力是疏水相互作用，说明双亲嵌段共聚物与蛋白质之间存在疏水相互作用。由于双亲嵌段共聚物与BSA之间的疏水相互作用，导致维系蛋白质三级结构的疏水相互作用的变化，进而引起蛋白质构象的变化。
图6 纯BSA的SS拉曼振动谱带和加入Pluronic P103的BSA的SS拉曼振动谱带(略)
Fig.6 SSstretching mode of BSA and BSA+P103
References
1 Tan J S， Butterfield D E， Voycheck C L， Caldwell K D， Li J T. Biomaterials， 1993, 14(11): 823~833
2 Guo Chen(郭 晨), Liu Huizhou(刘会洲), Wang Jing(王 靖)， Chen Jiayong(陈家镛). Journal of Colloid and Interface Science, 1999, 209(2): 368~373
3 Wang Jing(王 靖)，Guo Chen(郭 晨)，Liu Huizhou(刘会洲). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2001, 29(1)：35~37
4 Su Y L, Wang J， Liu H Z. Langmuir, 2002, 18(14): 5370~5374
5 Liu H Z, Yang W J， Chen J Y. Biochemical Engineering Journal, 1998, 2(3): 187~196
6 Gasset M, Mancheno J M, Laynez J, Lacadena J, FernandezBallester G, del Pozo A M, Onaderra M, Gavilanes J G. Biochmica et Biophysica, 1995, 1252: 126~134
本文系国家自然科学基金(No. 20273075)、国家自然科学基金创新研究群体科学基金(No. 20221603)和国家自然科学基金重大基金项目(No. 20490200)资助
(中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室分离科学与工程实验室，北京 100080)
(中国科学院研究生院，北京 100049), 百拇医药(王靖 郭晨 梁向峰 郑丽丽 陈澍 马俊鹤 刘会洲)
关键词 双亲嵌段共聚物，牛血清白蛋白，傅利叶变换红外光谱，傅利叶变换拉曼光谱
1 引言
双亲嵌段共聚物聚氧乙烯聚氧丙烯聚氧乙烯(简写为PEOPPOPEO)是一类非离子型高分子表面活性剂，它是由亲水性的聚合物链段和亲油性的聚合物链段通过共价键结合在一起的高分子化合物，结构式如下：
H[CH2-CH2-O]m-[CH(CH3)-CH2-O]n-[CH2-CH2-O]mH作为一种非离子型表面活性剂，PEOPPOPEO双亲嵌段共聚物与蛋白质的相互作用较弱，对蛋白质的结构和构象的影响较小，有利于PEOPPOPEO双亲嵌段共聚物在生物体系的应用，例如双亲嵌段共聚物吸附在固体表面后，可以阻止蛋白质的吸附，这一特性应用于药物载体、分离过程的膜和隐形眼镜的材料等[1]。系统的进行双亲嵌段共聚物水溶液体系弱相互作用的研究，一方面可以促进嵌段共聚物理论研究领域的发展，另一方面将推动双亲嵌段共聚物在医药、生物化工、生态环境等方面的应用，并扩展新的应用领域。本实验室从1997年起开展PEOPPOPEO双亲嵌段共聚物的研究工作，从分子水平研究了双亲嵌段共聚物之间的相互作用，提出温度依赖的聚合物胶团形成机理，并对盐、小分子有机物和蛋白质对双亲嵌段共聚物物化性质的影响进行了初步探索，为系统研究双亲嵌段共聚物复杂体系的相互作用打下了基础[2～4]。本研究的主要目的是利用FTIR和FTRaman技术，研究牛血清白蛋白与双亲嵌段共聚物P103作用过程中蛋白质构象的变化规律，分析和了解蛋白质与嵌段共聚物P103之间的相互作用。
2 实验部分
2.1 试剂和仪器牛血清蛋白(BSA，美国Sigma公司)，纯度98%；嵌段共聚物P103：BASF公司生产，未处理直接使用。VECTOR22傅立叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司)，BaF2晶体窗片，扫描次数64次，分辨率2 cm-1；RFS100傅立叶变换拉曼光谱仪(德国Bruker公司)，分辨率2 cm-1，激光功率400 mW，扫描次数2000次。谱图使用OPUS软件进行数据处理，包括水峰差减、去卷积和曲线拟合等处理方法。
2.2 样品制备 所有溶液均用pH值为7的磷酸缓冲溶液配置。配置BSA和Pluronic P103磷酸缓冲液母液，于4℃冰箱中密封放置。测量之前将BSA母液分别与不同浓度的Pluronic P103母液混合，保持混合液中BSA的最终浓度红外为10 g/L，拉曼光谱为100 g/L，混合液于4℃冰箱中密封放置12 h后测量。
3 结果与讨论
3.1 FTIR光谱分析双亲嵌段共聚物P103对BSA二级结构的影响将10 g/L BSA水溶液红外谱图进行水峰差减可以获得蛋白质的酰胺Ⅰ带谱图，如图1所示，是一个无明显特征的宽峰；对酰胺Ⅰ带去卷积处理获得的去卷积谱图有许多复杂的组分峰[6]，分别位于1620、1630、1645、1653、1662、1674和1680 cm-1附近，蛋白质的理论计算和模型实验都证实，酰胺Ⅰ区中的α螺旋结构的峰位于1650～1660 cm-1之间，1653 cm-1峰是外部的α螺旋结构，1662 cm-1峰是内部的α螺旋结构；β折叠结构在酰胺Ⅰ区中的位置一般在1620和1680 cm-1附近；位于1630 cm-1的谱带是连接α螺旋结构的小片段，1645 cm-1是无规卷曲结构，1674 cm-1左右谱带是转角结构，本研究将1630、1645和1674 cm-1这三部分谱峰都归结为无规结构。根据去卷积谱图的组分峰对酰胺Ⅰ带谱图进行曲线拟和，获得各个子峰的峰面积，各个子峰的峰面积占总的峰面积的百分比就是各种二级结构所占的百分比(图1)。实验中所测得BSA的二级结构组成为：45.9%α螺旋结构、6.1%β折叠结构和48%的无规则结构。
图1 BSA的酰胺Ⅰ带的水峰差减谱带、去卷积谱带和拟合谱带(略)
Fig.1 Substraction spectra, deconvoluted spectra and fitted spectra of amide band of bovine serum albumin (BSA)
1. 减谱(substraction spectra); 2. 去卷积谱(deconvoluted spectra); 3. 拟合谱(fitted spectra)。
在BSA水溶液中分别加入不同浓度的双亲嵌段共聚物P103，当P103与BSA混匀后立刻测量时，BSA的酰胺Ⅰ带没有发生任何变化。图2是P103与BSA混合均匀后放置12 h测量得到的BSA酰胺Ⅰ带的谱图，可以看出，即使二者相互作用12 h后测量，BSA酰胺Ⅰ带的谱峰峰形和峰位仍然变化不大，只是略微向低波数移动，谱峰稍微变宽，说明P103对BSA二级结构的影响较弱。对不同Pluronic P103浓度下的BSA酰胺Ⅰ带进行水峰差减，去卷积和曲线拟合，可以获得不同Pluronic P103浓度下BSA二级结构的变化规律，如图3所示。
图2 BSA在不同P103浓度下的酰胺Ⅰ带谱图(12 h)(略)
Fig.2 Amide band of BSA in various concentration of Pluronic P103 (12 h)
P103: a. 0 g/L; b. 8 g/L; c. 16 g/L; d. 24 g/L; e. 32 g/L; f. 40 g/L.
图3 双亲嵌段共聚物P103的浓度对BSA二级结构的影响(略)
Fig.3 Effect of poly(ethylene oxide)poly(propylene oxide)poly(ethylene oxide) (Pluronic P103) concentrations on the secondary structure of BSA
a.α螺旋(αhelix); b.β折叠(βsheet)； c.无规卷曲(random coil)。
由图3可知，当P103浓度为8 g/L时，BSA的二级结构几乎没有什么变化，当加入的P103浓度为16 g/L或以上时，α螺旋结构由45.9%降低至40%以下，α螺旋结构的降低伴随着β折叠结构的升高，由6.1%增加至17%左右，同时无规结构略微下降。P103的加入主要改变了BSA分子内部氢键的结合方式，蛋白质由α螺旋结构转变为β折叠结构，基本上不导致BSA内部氢键的破裂。3.2 FTRaman分析双亲嵌段共聚物P103对BSA构象的影响图4是40 g/L P103，100 g/L BSA以及二者混合液的拉曼谱图经过水峰差减的谱图，由图4可见，不受双亲嵌段共聚物P103干扰的BSA谱带主要有二硫键的伸缩振动谱带(510 cm-1)、苯丙氨酸的特征谱带(1004 cm-1)、酪氨酸的特征谱带(1210 cm-1)和色氨酸的特征谱带(1553 cm-1)。比较了单纯BSA的拉曼谱带和BSA中加入P103的拉曼谱带中氨基酸侧链的特征谱带。由图5可见，苯丙氨酸1004 cm-1谱带峰强减小并且略微向高波数移动，说明加入Pluronic P103之后苯丙氨酸所处环境的疏水性降低，苯丙氨酸向蛋白质的表面移动；酪氨酸1210 cm-1谱带略微向高波数移动而且峰强略微增加，说明酪氨酸所处的微环境变化不大，而色氨酸1553 cm-1谱带的峰强增加并且略微向低波数移动，说明色氨酸所处的环境疏水性增加，色氨酸在Pluronic P103加入之后更加埋藏在蛋白质的内部。SS伸缩振动频率对蛋白质的构象变化非常敏感，拉曼光谱被广泛的应用于探测蛋白质和多肽中的二硫键的构象。对大量已知结构的模型化合物研究证明，二硫键的对称伸缩振动频率与CαCβSSCβCα中的碳原子构象有关。当这些碳原子的构象呈扭曲扭曲扭曲(ggg)时ν(SS)出现在510附近，构象为扭曲扭曲反式(ggt)时，出现在525 cm-1附近，而构象为反式扭曲反式(tgt)时，出现在540 cm-1附近。
图4 BSA水溶液的拉曼差减光谱、BSA溶于P103水溶液中的拉曼差减光谱和P103水溶液的拉曼差减光谱(略)
Fig.4 Raman substraction spectra of three aqueous solutions: BSA, BSA and P103, P103
图5 BSA水溶液的拉曼差减光谱和BSA溶于P103水溶液中的拉曼差减光谱(略)
Fig.5 Raman substraction spectra of BSA, BSA and P103
图6比较了BSA二硫键振动谱带在加入双亲嵌段共聚物P103前后的变化情况。未加入双亲嵌段共聚物P103时，BSA的拉曼光谱中只出现510左右的SS伸缩振动谱带，推断BSA的二硫键只存在ggg构象。当加入双亲嵌段共聚物P103之后，二硫键的振动谱带强度变弱，并且在520 cm-1附近出现了一个肩峰，是二硫键的扭曲扭曲反式(ggt)构象。对加入Pluronic P103之后的二硫键振动谱带进行曲线拟合获得两个子峰，分别位于520 cm-1和505 cm-1，这两个峰的峰强之比就是扭曲(扭曲扭曲g(gg)构象与扭曲扭曲反式(ggt)构象之比；BSA有17个二硫键，因此纯BSA有17个ggg构象的二硫键，而加入Pluronic P103之后，BSA有11个二硫键是ggg构象，另外6个二硫键是ggt构象。双亲嵌段共聚物的加入影响了蛋白质的三级结构，进而影响蛋白质中的侧链基团所处的微环境和蛋白质中二硫键的构象，而影响蛋白质三级结构的主要作用力是疏水相互作用，说明双亲嵌段共聚物与蛋白质之间存在疏水相互作用。由于双亲嵌段共聚物与BSA之间的疏水相互作用，导致维系蛋白质三级结构的疏水相互作用的变化，进而引起蛋白质构象的变化。
图6 纯BSA的SS拉曼振动谱带和加入Pluronic P103的BSA的SS拉曼振动谱带(略)
Fig.6 SSstretching mode of BSA and BSA+P103
References
1 Tan J S， Butterfield D E， Voycheck C L， Caldwell K D， Li J T. Biomaterials， 1993, 14(11): 823~833
2 Guo Chen(郭 晨), Liu Huizhou(刘会洲), Wang Jing(王 靖)， Chen Jiayong(陈家镛). Journal of Colloid and Interface Science, 1999, 209(2): 368~373
3 Wang Jing(王 靖)，Guo Chen(郭 晨)，Liu Huizhou(刘会洲). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2001, 29(1)：35~37
4 Su Y L, Wang J， Liu H Z. Langmuir, 2002, 18(14): 5370~5374
5 Liu H Z, Yang W J， Chen J Y. Biochemical Engineering Journal, 1998, 2(3): 187~196
6 Gasset M, Mancheno J M, Laynez J, Lacadena J, FernandezBallester G, del Pozo A M, Onaderra M, Gavilanes J G. Biochmica et Biophysica, 1995, 1252: 126~134
本文系国家自然科学基金(No. 20273075)、国家自然科学基金创新研究群体科学基金(No. 20221603)和国家自然科学基金重大基金项目(No. 20490200)资助
(中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室分离科学与工程实验室，北京 100080)
(中国科学院研究生院，北京 100049), 百拇医药(王靖 郭晨 梁向峰 郑丽丽 陈澍 马俊鹤 刘会洲)