密度感知系统研究——为控制PA耐药提供新思路
密度感知系统(QS)通过细胞-细胞间的信号传递在细菌形成生物被膜中起到重要的作用，而生物被膜(BBF)的形成是铜绿假单胞菌(PA，俗称绿脓杆菌)产生耐药的主要途径之一。近年来，国内外学者对QS系统在BBF形成中的分子机制进行了深入研究，为控制PA耐药的产生提供了新思路。
■QS对PA基因有调控作用
多项研究证实，铜绿假单胞菌(PA)中许多基因是由密度感知系统(QS)调控的，其中包括许多调控毒力因子表达的基因。PA基因测序的完成和微阵列技术的应用，使人们对QS能有一个更加系统和完整的评价。
三项不同的研究利用微阵列技术对PA中由QS调控的转录组学进行了研究。研究结果显示，很大一部分基因是由QS调控的，并且PA中3%~7%的开放读码框受到了影响。其中一项实验数据表明，这些被诱导的基因比对照组多五倍甚至更多，而另两项的实验显示，所有的基因均被QS所诱导。在这些实验中仅有几个基因只在三组实验中的一组鉴定出来，但大量的基因在两个以及更多的实验中得到了鉴定确认，并且有97个被诱导基因在三个实验中都得到了确认。尽管在分析QS调控的转录组学时采用不同的分析方法会造成一些差异，但是大量的基因显示是由QS调控的，这在三组实验报道中是相同的。
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QS对绝大多数基因的调控是基于某种假设或未知的功能。然而，那些其余的基因则具有编码膜蛋白、未知功能酶、转录蛋白、分泌酶等，在细胞中由它们参与的功能广泛，包括双组分调控系统、能量代谢、小分子转运以及外排装置。在这三项研究中发现，这些大量已知功能基因可能是作为毒力因子，另外有几个被鉴定的基因也应该归于此类。
为明确QS因子和QS调控基因之间的关联，研究分析了这些QS调控基因是否包含可以和Las和RhlR结合的相同序列。令人惊奇的是，结果发现大约只有7%的QS调控基因的上游有类似Las和RhlR结合域，这说明QS调控基因是通过间接机制与之结合的。这个发现符合QS调控的许多基因经常被视为转录调节子和双组分调节系统的成员这一结论。通过诱导这些调节因子，QS可以间接的影响很多调控基因表达的机制，同时也可以解释为什么可供QS调节子结合的特定区域比较少。
上述研究的数据表明，QS在PA中发挥着广泛作用，但是QS调控转录组学还有待完善。而且，虽然已知很多基因是由QS调控的，但是在不同的实验条件下，被QS调控的基因是有区别的。
, 百拇医药
■QS成为治疗PA感染新靶位
目前PA多重耐药性问题日益普遍，现有的抗菌药物也不能根治PA引起的感染。所以，寻找一种新的治疗机制已成为许多研究的热点。既然QS在PA中调控一系列因子，缺少了QS的菌株其毒力也弱化，因此，有学者提出将QS作为抑制PA感染的新靶位。研究发现，在QS中有几处可作为调控的重要环节：a、LasR和RhlR的活化，b、AHLs的形成和活性，c、lasR/lasI和rhlR/rhlI的表达。
最可能抑制LasR和RhlR的活化的机制是利用AHLs类似物作为3OC12-AHSL和C4-AHSL的拮抗剂，这些类似物从结构上要跟PA产生的AHLs分子相似并能与LasR和RhlR蛋白结合。一项最近的研究证实，利用报告分析法鉴定一组带有氢结合受体的苯胺环结构化合物能与3O-C12-AHSL竞争结合LasR蛋白并抑制其活化及弹性蛋白酶的产生。类似研究在阐释一些可能有拮抗作用的药物时是非常有用的，并能在AHLs与LasR/RhlR如何相互作用方面提高认识水平。另外一些研究集中在卤代呋喃酮化合物，这种化合物能抑制许多QS诱导产生的因子。利用微点阵分析技术对用此化合物处理的PA时发现，80%被抑制的基因是由QS调控的，因此也显示卤代呋喃酮化合物对QS的特异性。这些化合物以及其他类似物为我们治疗PA感染提供了广阔的想象空间。
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关于AHLs的形成和活性，一旦AHLs到了胞外环境中，它们就有可能成为一个潜在的被破坏和灭活的靶位。有研究发现，当使用AHLs特异性抗体与胞外的AHLs结合后，可抑制AHLs与真核细胞的相互作用，阻止AHLs返回细胞内激活同类转录调控子。最近还有许多研究鉴定出由芽孢杆菌属等产生的内酯酶类，这些酶能破坏内酯环并产生一些无功能分子，这些无功能分子是不能激活同类转录调控子的。当这些酶在PA中产生时，AHLs的产量以及毒力因子的表达会显著降低。虽然这些酶类不是理想的治疗手段，但是仍然为我们研究QS提供了强大的工具。
自从在PA中发现了QS后，大量的研究集中在AHLs产生机制上面。LasI/RhlI合酶利用氨基酸和脂肪酸来合成AHLs，其中高丝氨酸内酯环主要来自于S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，而酰基链主要来源于菌内的酰基载体蛋白。虽然LasI在选择酰基链时优先选择12碳长度酰基链，但也可以选择一些不同长度的酰基链。体外研究发现，当脂肪酸合成改变时，导致短链的LasI饱和并导致有活性的3OC12-AHSL产量减少，这说明LasI对环境条件是非常敏感的，控制LasI的底物会明显影响AHLs的功能。
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至于lasR/lasI和rhlR/rhlI的表达，考虑到QS在PA中所调控的因子是如此之广，也就不奇怪它为何是自我调控的方式了。在一些报道中，许多因子参与调控QS的表达，有些因子的功能还不太详细，但这些因子都有可能成为QS的潜在靶位。目前可以抑制QS的方法有反义核苷酸技术和RNAi技术，这种技术可通过特异地与lasR/lasI和rhlR/rhlI转录体结合来抑制基因的表达。虽然这些技术本身有很多困难和障碍，比如说，细胞壁的通透性和转运方法的有效性等等，但是这些技术还是为抗PA感染药物研发提供新的途径。
■蛋白组学助力QS研究
随着PA基因组测序计划的完成，使人们应用相关技术包括蛋白组学来研究此致病菌的能力大大增强。这些方法的应用为解释PA为何能在各种不良环境中生存以及对高水平抗生素内在性耐药等长期困扰学术界的问题提供了更好的答案。
由于PA中很多开放读码框没有一个明确的功能，学者对它们的功能产生了很大的兴趣。在PA中，等位基因所占比率并不是很高，这说明单独用基因复制说明其基因组的复杂性是不够的。相反，这些开放读码框或许可以代表基因参与PA中独特的生化反应，这也使这些微生物能完成次级代谢功能。有学者认为通过这些途径可以使PA从一些特异的环境资源中获得养份，这也使得其能在各种不利环境中得以生存繁衍，所以PA被认为迄今为止发现的最“善变”的原核生物。面对这些独有的开放读码框，需要对其在不同环境下的基因和蛋白表达作全面的研究。
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利用差异蛋白质组学比较野生株PAO1和变异株PAO1-JP2能得到QS调控蛋白已得到广泛共识。国外学者对这两株菌的胞内、胞外、以及胞膜上的蛋白差异进行了研究。研究发现，在1971个蛋白位点中有723个位点表达异常(上调或下调是原来的2.5倍或更高)。
值得注意的是，PAO1-JP2菌株在培养时加入AHLs后蛋白位点的恢复也仅仅是部分性的。如果只对这些能被恢复的位点进行观察时，会发现由QS调控的蛋白位点占所有监测到的蛋白位点的23.7%。有意思的是，有些蛋白在野生株中表达是微弱的，但在双变异株加入AHLs后表达大大增强。相对于野生株来说，双变异株中蛋白表达的总量要明显少于野生株。这在分泌蛋白方面是最显著的，在野生株2-DE凝胶上显示有14%的蛋白位点在变异株中是找不到的。最近，PAO1的密度感知系统的调节子通过转录组学已被绘制出来，这对深入了解QS起到了非常重要的作用。
对PA的后基因组分析仍然是一个艰巨的任务，通过双相凝胶电泳和质谱来解析和检测未知蛋白仍然有待提高。通常一小块儿银染2-D凝胶包含大约500fmol蛋白质即可由质谱分析出来。除了双相凝胶电泳其他分离蛋白技术也有发展和应用，编码同位素亲和标记物(ICAT)就是一种特殊的标记和比对蛋白样品的方法。
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但是蛋白组学方法作为新生事物也有一定的缺点和局限性，如成本昂贵；难以鉴定细胞核组织中的每一个蛋白质，特别是对低丰度蛋白的检测仍然是个难题；处于动态之中的蛋白质分析试验重复性差等等。
■大环内酯类可抑制QS
由于缺乏杀菌和抑菌活性，大环内酯类通常不用于抗PA。然而，最近许多研究表明，大环内酯类药物(如克拉霉素、阿奇霉素)在治疗慢性PA感染患者中发挥了重要作用，其具体机制可能包括此类药物本身具有一定的抗炎作用并且它能调控细菌毒力因子以及引起宿主防御反应。然而，究竟大环内酯类是不是通过一种不依赖细菌生长减少和总蛋白生成减少的机制来抑制细菌胞外蛋白酶的生成，这在目前是有争议的。
在PA中，las和rhl密度感知系统调控许多胞外毒力因子，如弹性蛋白酶和鼠李糖脂等。在这两个系统中，每个系统包括一个编码转录激活子基因-lasR和rhlR，和一个编码自动诱导剂合成酶基因lasI和rhlI，其中自动诱导剂合成酶用来合成3OC12-AHSL和C4-AH鄄SL。然而，QS在慢性感染的发病机理方面的重要性是不清楚的。解放军总医院临床药理研究室的科研人员观察了不同结构大环内酯类药物对PA生物被膜的影响，研究结果发现大环内酯类药物可减少细菌的黏附，防止细菌生物被膜的形成。国外有研究发现，用亚抑制浓度的琥乙红霉素培养PA时，弹性蛋白酶和鼠李糖脂比对照组要少，并且发现AHLs的产量也是比对照组要低。
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在Davies的实验中第一次阐述了细胞内信号联系对PA生物被膜形成的影响。他通过激光共聚焦电镜观察了野生株PAO1和lasI变异株的生物被膜形成情况，发现lasI变异株的厚度在同样的培养环境中要比野生株薄。他们分析推测这可能是胞外多糖受lasI和rhlI表达的影响。虽然已经知道胞外多糖可以保护生物被膜中的细胞不与抗菌药物接触，QS能以多大程度影响多糖的形成仍然是未知的。虽然QS在抗菌药物耐药性方面的作用尚不明确，但专家推测生物被膜的生长可导致早期应激反应，而应激反应是耐药的一个主要原因。应激反应是由启动子-RpoS介导的，而RpoS在PA中是由QS调控的。大环内酯类药物通过抑制QS为我们在治疗PA慢性感染提供了一个新思路。
(李聪然 钱皎)
▲链接
铜绿假单胞菌(PA)是一种临床上最常见的引起严重院内获得性感染的条件致病菌。由PA引起的医院内感染高达30%以上，而呼吸道感染率更高，居病原菌之首。
PA主要通过以下5种途径产生耐药：产生抗生素灭活酶或抗生素修饰酶；改变抗菌药物作用的靶位；膜屏障；主动外排，限制药物到达其作用靶位；形成生物被膜。PA通过形成生物被膜(biofilm，BBF)能够持续地将浮游的细菌保护起来便于细菌繁殖，是慢性或持续性感染的原因之一。
密度感知系统(QS)是指细菌通过感知其群体的细胞密度来调控特定的基因活化与表达，通过感知周围“同伴”的存在，并达到一定的密度才开始表现出一定的行为。1994年，FuquaWC在对海洋弧菌的研究中，首次提出了密度感知系统的概念。目前普遍认为QS是一种有进化优势的机制。它代表了一种细菌为控制能感应自身密度的特殊基因而专用的交流系统。, http://www.100md.com(李聪然；钱皎)
■QS对PA基因有调控作用
多项研究证实，铜绿假单胞菌(PA)中许多基因是由密度感知系统(QS)调控的，其中包括许多调控毒力因子表达的基因。PA基因测序的完成和微阵列技术的应用，使人们对QS能有一个更加系统和完整的评价。
三项不同的研究利用微阵列技术对PA中由QS调控的转录组学进行了研究。研究结果显示，很大一部分基因是由QS调控的，并且PA中3%~7%的开放读码框受到了影响。其中一项实验数据表明，这些被诱导的基因比对照组多五倍甚至更多，而另两项的实验显示，所有的基因均被QS所诱导。在这些实验中仅有几个基因只在三组实验中的一组鉴定出来，但大量的基因在两个以及更多的实验中得到了鉴定确认，并且有97个被诱导基因在三个实验中都得到了确认。尽管在分析QS调控的转录组学时采用不同的分析方法会造成一些差异，但是大量的基因显示是由QS调控的，这在三组实验报道中是相同的。
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QS对绝大多数基因的调控是基于某种假设或未知的功能。然而，那些其余的基因则具有编码膜蛋白、未知功能酶、转录蛋白、分泌酶等，在细胞中由它们参与的功能广泛，包括双组分调控系统、能量代谢、小分子转运以及外排装置。在这三项研究中发现，这些大量已知功能基因可能是作为毒力因子，另外有几个被鉴定的基因也应该归于此类。
为明确QS因子和QS调控基因之间的关联，研究分析了这些QS调控基因是否包含可以和Las和RhlR结合的相同序列。令人惊奇的是，结果发现大约只有7%的QS调控基因的上游有类似Las和RhlR结合域，这说明QS调控基因是通过间接机制与之结合的。这个发现符合QS调控的许多基因经常被视为转录调节子和双组分调节系统的成员这一结论。通过诱导这些调节因子，QS可以间接的影响很多调控基因表达的机制，同时也可以解释为什么可供QS调节子结合的特定区域比较少。
上述研究的数据表明，QS在PA中发挥着广泛作用，但是QS调控转录组学还有待完善。而且，虽然已知很多基因是由QS调控的，但是在不同的实验条件下，被QS调控的基因是有区别的。
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■QS成为治疗PA感染新靶位
目前PA多重耐药性问题日益普遍，现有的抗菌药物也不能根治PA引起的感染。所以，寻找一种新的治疗机制已成为许多研究的热点。既然QS在PA中调控一系列因子，缺少了QS的菌株其毒力也弱化，因此，有学者提出将QS作为抑制PA感染的新靶位。研究发现，在QS中有几处可作为调控的重要环节：a、LasR和RhlR的活化，b、AHLs的形成和活性，c、lasR/lasI和rhlR/rhlI的表达。
最可能抑制LasR和RhlR的活化的机制是利用AHLs类似物作为3OC12-AHSL和C4-AHSL的拮抗剂，这些类似物从结构上要跟PA产生的AHLs分子相似并能与LasR和RhlR蛋白结合。一项最近的研究证实，利用报告分析法鉴定一组带有氢结合受体的苯胺环结构化合物能与3O-C12-AHSL竞争结合LasR蛋白并抑制其活化及弹性蛋白酶的产生。类似研究在阐释一些可能有拮抗作用的药物时是非常有用的，并能在AHLs与LasR/RhlR如何相互作用方面提高认识水平。另外一些研究集中在卤代呋喃酮化合物，这种化合物能抑制许多QS诱导产生的因子。利用微点阵分析技术对用此化合物处理的PA时发现，80%被抑制的基因是由QS调控的，因此也显示卤代呋喃酮化合物对QS的特异性。这些化合物以及其他类似物为我们治疗PA感染提供了广阔的想象空间。
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关于AHLs的形成和活性，一旦AHLs到了胞外环境中，它们就有可能成为一个潜在的被破坏和灭活的靶位。有研究发现，当使用AHLs特异性抗体与胞外的AHLs结合后，可抑制AHLs与真核细胞的相互作用，阻止AHLs返回细胞内激活同类转录调控子。最近还有许多研究鉴定出由芽孢杆菌属等产生的内酯酶类，这些酶能破坏内酯环并产生一些无功能分子，这些无功能分子是不能激活同类转录调控子的。当这些酶在PA中产生时，AHLs的产量以及毒力因子的表达会显著降低。虽然这些酶类不是理想的治疗手段，但是仍然为我们研究QS提供了强大的工具。
自从在PA中发现了QS后，大量的研究集中在AHLs产生机制上面。LasI/RhlI合酶利用氨基酸和脂肪酸来合成AHLs，其中高丝氨酸内酯环主要来自于S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，而酰基链主要来源于菌内的酰基载体蛋白。虽然LasI在选择酰基链时优先选择12碳长度酰基链，但也可以选择一些不同长度的酰基链。体外研究发现，当脂肪酸合成改变时，导致短链的LasI饱和并导致有活性的3OC12-AHSL产量减少，这说明LasI对环境条件是非常敏感的，控制LasI的底物会明显影响AHLs的功能。
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至于lasR/lasI和rhlR/rhlI的表达，考虑到QS在PA中所调控的因子是如此之广，也就不奇怪它为何是自我调控的方式了。在一些报道中，许多因子参与调控QS的表达，有些因子的功能还不太详细，但这些因子都有可能成为QS的潜在靶位。目前可以抑制QS的方法有反义核苷酸技术和RNAi技术，这种技术可通过特异地与lasR/lasI和rhlR/rhlI转录体结合来抑制基因的表达。虽然这些技术本身有很多困难和障碍，比如说，细胞壁的通透性和转运方法的有效性等等，但是这些技术还是为抗PA感染药物研发提供新的途径。
■蛋白组学助力QS研究
随着PA基因组测序计划的完成，使人们应用相关技术包括蛋白组学来研究此致病菌的能力大大增强。这些方法的应用为解释PA为何能在各种不良环境中生存以及对高水平抗生素内在性耐药等长期困扰学术界的问题提供了更好的答案。
由于PA中很多开放读码框没有一个明确的功能，学者对它们的功能产生了很大的兴趣。在PA中，等位基因所占比率并不是很高，这说明单独用基因复制说明其基因组的复杂性是不够的。相反，这些开放读码框或许可以代表基因参与PA中独特的生化反应，这也使这些微生物能完成次级代谢功能。有学者认为通过这些途径可以使PA从一些特异的环境资源中获得养份，这也使得其能在各种不利环境中得以生存繁衍，所以PA被认为迄今为止发现的最“善变”的原核生物。面对这些独有的开放读码框，需要对其在不同环境下的基因和蛋白表达作全面的研究。
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利用差异蛋白质组学比较野生株PAO1和变异株PAO1-JP2能得到QS调控蛋白已得到广泛共识。国外学者对这两株菌的胞内、胞外、以及胞膜上的蛋白差异进行了研究。研究发现，在1971个蛋白位点中有723个位点表达异常(上调或下调是原来的2.5倍或更高)。
值得注意的是，PAO1-JP2菌株在培养时加入AHLs后蛋白位点的恢复也仅仅是部分性的。如果只对这些能被恢复的位点进行观察时，会发现由QS调控的蛋白位点占所有监测到的蛋白位点的23.7%。有意思的是，有些蛋白在野生株中表达是微弱的，但在双变异株加入AHLs后表达大大增强。相对于野生株来说，双变异株中蛋白表达的总量要明显少于野生株。这在分泌蛋白方面是最显著的，在野生株2-DE凝胶上显示有14%的蛋白位点在变异株中是找不到的。最近，PAO1的密度感知系统的调节子通过转录组学已被绘制出来，这对深入了解QS起到了非常重要的作用。
对PA的后基因组分析仍然是一个艰巨的任务，通过双相凝胶电泳和质谱来解析和检测未知蛋白仍然有待提高。通常一小块儿银染2-D凝胶包含大约500fmol蛋白质即可由质谱分析出来。除了双相凝胶电泳其他分离蛋白技术也有发展和应用，编码同位素亲和标记物(ICAT)就是一种特殊的标记和比对蛋白样品的方法。
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但是蛋白组学方法作为新生事物也有一定的缺点和局限性，如成本昂贵；难以鉴定细胞核组织中的每一个蛋白质，特别是对低丰度蛋白的检测仍然是个难题；处于动态之中的蛋白质分析试验重复性差等等。
■大环内酯类可抑制QS
由于缺乏杀菌和抑菌活性，大环内酯类通常不用于抗PA。然而，最近许多研究表明，大环内酯类药物(如克拉霉素、阿奇霉素)在治疗慢性PA感染患者中发挥了重要作用，其具体机制可能包括此类药物本身具有一定的抗炎作用并且它能调控细菌毒力因子以及引起宿主防御反应。然而，究竟大环内酯类是不是通过一种不依赖细菌生长减少和总蛋白生成减少的机制来抑制细菌胞外蛋白酶的生成，这在目前是有争议的。
在PA中，las和rhl密度感知系统调控许多胞外毒力因子，如弹性蛋白酶和鼠李糖脂等。在这两个系统中，每个系统包括一个编码转录激活子基因-lasR和rhlR，和一个编码自动诱导剂合成酶基因lasI和rhlI，其中自动诱导剂合成酶用来合成3OC12-AHSL和C4-AH鄄SL。然而，QS在慢性感染的发病机理方面的重要性是不清楚的。解放军总医院临床药理研究室的科研人员观察了不同结构大环内酯类药物对PA生物被膜的影响，研究结果发现大环内酯类药物可减少细菌的黏附，防止细菌生物被膜的形成。国外有研究发现，用亚抑制浓度的琥乙红霉素培养PA时，弹性蛋白酶和鼠李糖脂比对照组要少，并且发现AHLs的产量也是比对照组要低。
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在Davies的实验中第一次阐述了细胞内信号联系对PA生物被膜形成的影响。他通过激光共聚焦电镜观察了野生株PAO1和lasI变异株的生物被膜形成情况，发现lasI变异株的厚度在同样的培养环境中要比野生株薄。他们分析推测这可能是胞外多糖受lasI和rhlI表达的影响。虽然已经知道胞外多糖可以保护生物被膜中的细胞不与抗菌药物接触，QS能以多大程度影响多糖的形成仍然是未知的。虽然QS在抗菌药物耐药性方面的作用尚不明确，但专家推测生物被膜的生长可导致早期应激反应，而应激反应是耐药的一个主要原因。应激反应是由启动子-RpoS介导的，而RpoS在PA中是由QS调控的。大环内酯类药物通过抑制QS为我们在治疗PA慢性感染提供了一个新思路。
(李聪然 钱皎)
▲链接
铜绿假单胞菌(PA)是一种临床上最常见的引起严重院内获得性感染的条件致病菌。由PA引起的医院内感染高达30%以上，而呼吸道感染率更高，居病原菌之首。
PA主要通过以下5种途径产生耐药：产生抗生素灭活酶或抗生素修饰酶；改变抗菌药物作用的靶位；膜屏障；主动外排，限制药物到达其作用靶位；形成生物被膜。PA通过形成生物被膜(biofilm，BBF)能够持续地将浮游的细菌保护起来便于细菌繁殖，是慢性或持续性感染的原因之一。
密度感知系统(QS)是指细菌通过感知其群体的细胞密度来调控特定的基因活化与表达，通过感知周围“同伴”的存在，并达到一定的密度才开始表现出一定的行为。1994年，FuquaWC在对海洋弧菌的研究中，首次提出了密度感知系统的概念。目前普遍认为QS是一种有进化优势的机制。它代表了一种细菌为控制能感应自身密度的特殊基因而专用的交流系统。, http://www.100md.com(李聪然；钱皎)