db/db自发性糖尿病小鼠颌下腺EGFR的表达及细胞凋亡关系的研究
Relationship between EGFR expression and cell apoptosis in submandibular gland of db/db mutant diabetic mice
LIU HongYan, MENG QingLi, GAO FuLu, DONG FuSheng, WANG ChunYan, SONG XiaoChen
Department of Stomatology, Affiliated Hospital, Department of Histology and Embryology, Chengde Medical College, Chengde 067000，China, Hospital of Stomatology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China, Outpatient Department, Goverment of Chengde City, Chengde 067000, China
【Abstract】 AIM: To observe the expression of EGFR and the distribution of apoptotic cells in submandibular gland of db/db mutant diabetic mice and to explore their relationship. METHODS: Submandibular glands were harvested from the selected 3, 4, 6, 8, 10 monthold db/db diabetic mice (n=25) and the agematched db/+m normal mice (n=25); Every age subgroup included 5 mice. The expression of EGFR and the distribution of apoptotic cells were observed by using immunohistochemistry and TUNEL.The results were analyzed statistically. RESULTS: EGFR was expressed and apoptotic cells were presented in submandibular gland from both diabetic mice and control mice. The percentage of EGFRimmunopositive cells and the number of apoptotic cells were significantly higher in diabetic mice than those of control mice, and they showed increasing tendency as disease progressed in diabetic groups. CONCLUSION: EGFRimmunopositive cells increase with the development of the disease, which may lead to the apoptosis of epithelial cells. The increase of apoptotic cells demonstrates that diabetes mellitus can induce apoptosis, which may be the reason of submandibular gland atrophy.
【Keywords】 diabetes mellitus; mice; submandibular gland; gene; apoptosis
【摘要】 目的：观察db/db自发性糖尿病小鼠颌下腺中表皮生长因子受体(EGFR)的表达及其与细胞凋亡的关系. 方法： 选取3，4，6，8，10月龄db/db糖尿病小鼠及相应月龄的db/+m正常小鼠颌下腺，应用SP免疫组织化学方法染色及TUNEL原位标记后进行图像分析，统计EGFR及凋亡细胞在颌下腺组织内表达(分布)的细胞阳性率. 结果：EGFR及凋亡细胞在对照组及糖尿病组颌下腺中均有表达(分布). db/db糖尿病小鼠颌下腺EGFR及凋亡细胞阳性率随病程延长均呈增高趋势，且显著高于对照组. 结论：EGFR表达增多，说明糖尿病时EGFR作为多效应受体，被激活后可能诱导了颌下腺的细胞凋亡. 凋亡细胞阳性率的显著增高，提示糖尿病是加剧颌下腺腺体萎缩，功能受损的原因.
【关键词】 糖尿病；小鼠；颌下腺；基因；细胞凋亡
0引言
糖尿病(Diabetes mellitus)是危害人类健康的常见病及多发病，糖尿病随病情发展，可造成多个器官细胞增殖与凋亡的平衡破坏，导致器官的损伤及功能障碍. 颌下腺作为较大的唾液腺能产生多种生物活性物质，对人体各种功能起重要调节作用，迄今颌下腺与糖尿病的关系目前研究较少，本实验应用SP 免疫组化及TUNEL原位标记，对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的表达及凋亡细胞阳性率的变化进行动态观察,为糖尿病的临床治疗及基础研究提供实验依据.
1材料和方法
1.1材料引进日本C57BL/Ksj-db/+m转基因小鼠200只，雌雄各半，无菌级，分笼饲养于无菌包中，自由摄食(钴60照射饲料),饮水(高压消毒蒸馏水),近亲(兄妹)交配. 该小鼠的第4号染色体受单一劣性糖尿病基因支配，并与肥胖基因连锁在一起，与浅色毛基因分离，两个连锁基因与浅色毛基因在传代中遵循基因的自由组合和分离规律. db/代表肥胖和糖尿病基因,m代表浅色毛基因，db/+m型为糖尿病和肥胖基因携带者，其表型正常，故两个基因型为db/+m的小鼠产生的后代(雌雄纯合子个体)中，25%发生糖尿病和肥胖，即db/db型糖尿病鼠. 选取3，4，6，8，10月龄db/db型小鼠，即表型肥胖、血糖高于10 mmol/L小鼠,作为糖尿病组. 对照组选取相应月龄的同种db/+m小鼠. 每组5只.
1.2方法
1.2.1血糖及体质量测定每次测量血糖时，先用天平称其体质量，再断尾取血，并用美国强生微型血糖仪测定血糖值(每次测量血糖时间为上午9时、空腹).
1.2.2标本制备20 mL/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,开胸,经左心尖部插管入主动脉，剪开右心耳，生理盐水灌注至血液全部排出后，40 mL/L多聚甲醛磷酸缓冲液300 mL灌流固定，取颌下腺. 将标本固定于40 mL/L多聚甲醛液中24 h，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，做连续切片，切片厚度为6 μm，每隔30张取相邻5张，作免疫组化染色及TUNEL原位标记.
1.2.3SP免疫组化染色基本步骤为：切片脱蜡后，经下行酒精至水，30 mL/L甲醇过氧化氢液室温下孵育20 min, 以清除内源性过氧化物酶的活性 ； 0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)微波炉内抗原修复，滴加100 mL/L正常山羊血清孵育30 min；滴加1∶50兔抗鼠的EGFR(购于北京中山生物技术有限公司)一抗4℃孵育过夜；滴加生物素标记的二抗工作液(1∶200), 孵育30 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素(三抗1∶200), 37℃温箱湿盒内孵育30 min；DAB过氧化氢显色剂显色5~8 min，光镜下观测. 阴性对照用PBS替代一抗,其余步骤同上.
1.2.4TUNEL原位标记程序切片脱蜡后，经下行酒精至水；3 mL/L甲醇过氧化氢液室温下孵育30 min； 滴加反应液，37℃温箱湿盒内孵育1 h；滴加POD，37℃温箱湿盒内孵育40 min；DAB过氧化氢显色，光镜下监视；自来水充分冲洗，终止显色；苏木精复染核；盐酸酒精分色；梯度酒精脱水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ各20 min透明；中性树胶封固. 阴性对照用0.01 mol/L PBS替代反应液，其余步骤同上.
对EGFR免疫组化染色的切片及TUNEL原位标记的凋亡细胞切片，其结果判定按照Jin等[1]描述的方法，每张切片随机观察至少300个细胞，计算阳性率. 数据处理采用析因实验设计的方差分析，采用Duncan多组极差检验进行多重比较.
2结果
2.1SP免疫组织化学染色EGFR在对照组及糖尿病组颌下腺的导管及腺泡细胞中均有表达，尤以颗粒曲管中表达最强，染色颗粒呈棕黄色主要位于上述细胞的顶部胞质部分. 方差分析：同月龄比较，对照组与糖尿病组的细胞阳性率，糖尿病组表达均高于对照组. 差异有统计学意义(表1)显示(P<0.01).
表1同月龄糖尿病组与对照组EGFR,凋亡细胞阳性率的比较(略)
bP<0.01 vs对照.
对照组与糖尿病组组内不同月龄比较，EGFR细胞阳性率，对照组随月龄增大呈增强趋势，糖尿病组随着病程延长也呈增强趋势. 糖尿病组表达强于对照组(图1).
2.2TUNEL检测凋亡细胞的结果凋亡细胞在对照组及糖尿病组的导管细胞、腺泡细胞中均有分布，导管细胞中分布较多. 阳性反应物质分布在导管细胞、腺泡细胞的细胞核中，可见完整的细胞膜，胞质皱缩，部分细胞核浓缩深染. 方差分析：同月龄比较，糖尿病组凋亡细胞的阳性率高于对照组. 差异有统计学意义(表1)显示(P<0.01).
对照组与糖尿病组组内不同月龄比较，凋亡细胞阳性率对照组随月龄增大、糖尿病组随着病程延长均呈增强趋势，糖尿病组凋亡细胞的阳性率高于对照组(图2).
A: 4月龄糖尿病组; B: 6月龄糖尿病组; C: 10月龄糖尿病组; D: 10月龄对照组.
图1两组EGFR的表达SP ×200(略)
A: 4月龄糖尿病组; B: 8月龄糖尿病组; C: 10月龄糖尿病组; D: 10月龄对照组.
图2两组的凋亡细胞观察SP ×200(略)
3讨论
目前2型糖尿病动物模型分3种：实验性糖尿病模型，自发性糖尿病模型，转基因动物模型[2]. 我们引进日本C57BL/Ksj-db/+m表型正常隐性基因小鼠，该小鼠因饲养于无菌包中，受外界因素影响小，且在自然情况下发病，故该动物模型性能稳定，实验结果更准确. 该模型与人的2型糖尿病近似，其应用价值更高，是研究及治疗人类2型糖尿病及其并发症的良好动物模型. EGFR存在于许多细胞表面，大多数正常细胞约有20 000~50 000个受体. EGF本身可诱导受体表达；EGFR本身具有蛋白激酶的活性. EGFR是多效应的信息传递者，被激活后能促进有丝分裂或诱导细胞凋亡[3]. 我们发现EGFR在对照组及糖尿病组颌下腺的导管及腺泡细胞中均有表达，阳性率糖尿病组高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)，尤以颗粒曲管中表达最强. 阳性反应物质主要位于导管及腺泡细胞的细胞质中.
同月龄相比，糖尿病组EGFR阳性率的表达均高于同龄对照组，，有显著性差异(P<0.01)，这说明糖尿病时颌下腺EGFR表达增强；组内不同月龄相比，对照组随月龄增大、糖尿病组随病程延长EGFR的表达均增加. 这说明糖尿病、衰老本身作为一种损伤形式，刺激颌下腺，引起颌下腺EGFR水平的增高，可能诱导了颌下腺的细胞凋亡，致使糖尿病时腺体萎缩、分泌功能减低这与组织学观察到的糖尿病时颌下腺组织萎缩，腺实质细胞形态的破坏相一致. 与临床上的唾液减少，口干、口渴现象相吻合.
本研究结果与刘志红等[4]应用免疫组织化学定量分析，对EGF，EGFR进行观察，发现NIDDM肾病患者肾小管上的EGF, EGFR量明显高于正常人，提示肾小管上的EGF，EGFR含量增多可能与糖尿病肾病的肾小管病变的发生有一定联系的结论相一致. 我们采用TUNEL末端标记检测技术，发现在糖尿病组及对照组的导管细胞及腺泡细胞中均有凋亡细胞分布，糖尿病组凋亡细胞阳性率高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)，尤以导管细胞中多见，阳性反应物存在于导管细胞、腺泡细胞的胞核中.
同月龄比较，糖尿病组凋亡细胞阳性率高于对照组，有显著性差异(P<0.01)，这说明糖尿病时颌下腺细胞的凋亡情况比正常状态下更强烈；组内不同月龄比较，对照组与糖尿病组随月龄增大，凋亡细胞阳性率均增加. 这一结果说明，随月龄增大及糖尿病病程的延长，颌下腺细胞凋亡均增强.
本实验表明糖尿病、EGFR对细胞凋亡均有促进作用. 这与组织学观察到的糖尿病时颌下腺组织萎缩，腺实质细胞形态的破坏、临床出现更为严重的颌下腺功能减退，口干、口渴现象加重相一致.
【参考文献】
[1] Jin YT, Kayser S, Kemp BL, et al. The prognostic significance of the biomarkers p21WAFI/CIPI, p53, and bcl2 in laryngeal squamous cell carcinoma[J]. Cancer, 1998, 82(11):2159-2165.
[2] 孙子林. Ⅱ型糖尿病动物模型及其进展[J]. 实验动物科学及管理, 1999,16(2)：44-46.
[3] 葛奎，青春，陆树良，等. 表皮生长因子受体与糖尿病创面难愈[J]. 中国临床康复，2003，7(6)：944-945.
[4] 刘志红，黎磊石，王庆文，等. 非胰岛素依赖型糖尿病肾病肾组织中EGF、EGFR和IGF1R的检测及其意义[J]. 中华内分泌杂志，1994，10(2)：67-70.
编辑黄良田
(承德医学院：附属医院口腔科，组织胚胎学教研室，河北 承德 067000，河北医科大学口腔医院，河北 石家庄 050000，承德市政府门诊部，河北 承德 067000), http://www.100md.com(刘红艳，孟庆丽，高福禄，董福生，王春燕，宋晓晨)
LIU HongYan, MENG QingLi, GAO FuLu, DONG FuSheng, WANG ChunYan, SONG XiaoChen
Department of Stomatology, Affiliated Hospital, Department of Histology and Embryology, Chengde Medical College, Chengde 067000，China, Hospital of Stomatology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China, Outpatient Department, Goverment of Chengde City, Chengde 067000, China
【Abstract】 AIM: To observe the expression of EGFR and the distribution of apoptotic cells in submandibular gland of db/db mutant diabetic mice and to explore their relationship. METHODS: Submandibular glands were harvested from the selected 3, 4, 6, 8, 10 monthold db/db diabetic mice (n=25) and the agematched db/+m normal mice (n=25); Every age subgroup included 5 mice. The expression of EGFR and the distribution of apoptotic cells were observed by using immunohistochemistry and TUNEL.The results were analyzed statistically. RESULTS: EGFR was expressed and apoptotic cells were presented in submandibular gland from both diabetic mice and control mice. The percentage of EGFRimmunopositive cells and the number of apoptotic cells were significantly higher in diabetic mice than those of control mice, and they showed increasing tendency as disease progressed in diabetic groups. CONCLUSION: EGFRimmunopositive cells increase with the development of the disease, which may lead to the apoptosis of epithelial cells. The increase of apoptotic cells demonstrates that diabetes mellitus can induce apoptosis, which may be the reason of submandibular gland atrophy.
【Keywords】 diabetes mellitus; mice; submandibular gland; gene; apoptosis
【摘要】 目的：观察db/db自发性糖尿病小鼠颌下腺中表皮生长因子受体(EGFR)的表达及其与细胞凋亡的关系. 方法： 选取3，4，6，8，10月龄db/db糖尿病小鼠及相应月龄的db/+m正常小鼠颌下腺，应用SP免疫组织化学方法染色及TUNEL原位标记后进行图像分析，统计EGFR及凋亡细胞在颌下腺组织内表达(分布)的细胞阳性率. 结果：EGFR及凋亡细胞在对照组及糖尿病组颌下腺中均有表达(分布). db/db糖尿病小鼠颌下腺EGFR及凋亡细胞阳性率随病程延长均呈增高趋势，且显著高于对照组. 结论：EGFR表达增多，说明糖尿病时EGFR作为多效应受体，被激活后可能诱导了颌下腺的细胞凋亡. 凋亡细胞阳性率的显著增高，提示糖尿病是加剧颌下腺腺体萎缩，功能受损的原因.
【关键词】 糖尿病；小鼠；颌下腺；基因；细胞凋亡
0引言
糖尿病(Diabetes mellitus)是危害人类健康的常见病及多发病，糖尿病随病情发展，可造成多个器官细胞增殖与凋亡的平衡破坏，导致器官的损伤及功能障碍. 颌下腺作为较大的唾液腺能产生多种生物活性物质，对人体各种功能起重要调节作用，迄今颌下腺与糖尿病的关系目前研究较少，本实验应用SP 免疫组化及TUNEL原位标记，对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的表达及凋亡细胞阳性率的变化进行动态观察,为糖尿病的临床治疗及基础研究提供实验依据.
1材料和方法
1.1材料引进日本C57BL/Ksj-db/+m转基因小鼠200只，雌雄各半，无菌级，分笼饲养于无菌包中，自由摄食(钴60照射饲料),饮水(高压消毒蒸馏水),近亲(兄妹)交配. 该小鼠的第4号染色体受单一劣性糖尿病基因支配，并与肥胖基因连锁在一起，与浅色毛基因分离，两个连锁基因与浅色毛基因在传代中遵循基因的自由组合和分离规律. db/代表肥胖和糖尿病基因,m代表浅色毛基因，db/+m型为糖尿病和肥胖基因携带者，其表型正常，故两个基因型为db/+m的小鼠产生的后代(雌雄纯合子个体)中，25%发生糖尿病和肥胖，即db/db型糖尿病鼠. 选取3，4，6，8，10月龄db/db型小鼠，即表型肥胖、血糖高于10 mmol/L小鼠,作为糖尿病组. 对照组选取相应月龄的同种db/+m小鼠. 每组5只.
1.2方法
1.2.1血糖及体质量测定每次测量血糖时，先用天平称其体质量，再断尾取血，并用美国强生微型血糖仪测定血糖值(每次测量血糖时间为上午9时、空腹).
1.2.2标本制备20 mL/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,开胸,经左心尖部插管入主动脉，剪开右心耳，生理盐水灌注至血液全部排出后，40 mL/L多聚甲醛磷酸缓冲液300 mL灌流固定，取颌下腺. 将标本固定于40 mL/L多聚甲醛液中24 h，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，做连续切片，切片厚度为6 μm，每隔30张取相邻5张，作免疫组化染色及TUNEL原位标记.
1.2.3SP免疫组化染色基本步骤为：切片脱蜡后，经下行酒精至水，30 mL/L甲醇过氧化氢液室温下孵育20 min, 以清除内源性过氧化物酶的活性 ； 0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)微波炉内抗原修复，滴加100 mL/L正常山羊血清孵育30 min；滴加1∶50兔抗鼠的EGFR(购于北京中山生物技术有限公司)一抗4℃孵育过夜；滴加生物素标记的二抗工作液(1∶200), 孵育30 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素(三抗1∶200), 37℃温箱湿盒内孵育30 min；DAB过氧化氢显色剂显色5~8 min，光镜下观测. 阴性对照用PBS替代一抗,其余步骤同上.
1.2.4TUNEL原位标记程序切片脱蜡后，经下行酒精至水；3 mL/L甲醇过氧化氢液室温下孵育30 min； 滴加反应液，37℃温箱湿盒内孵育1 h；滴加POD，37℃温箱湿盒内孵育40 min；DAB过氧化氢显色，光镜下监视；自来水充分冲洗，终止显色；苏木精复染核；盐酸酒精分色；梯度酒精脱水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ各20 min透明；中性树胶封固. 阴性对照用0.01 mol/L PBS替代反应液，其余步骤同上.
对EGFR免疫组化染色的切片及TUNEL原位标记的凋亡细胞切片，其结果判定按照Jin等[1]描述的方法，每张切片随机观察至少300个细胞，计算阳性率. 数据处理采用析因实验设计的方差分析，采用Duncan多组极差检验进行多重比较.
2结果
2.1SP免疫组织化学染色EGFR在对照组及糖尿病组颌下腺的导管及腺泡细胞中均有表达，尤以颗粒曲管中表达最强，染色颗粒呈棕黄色主要位于上述细胞的顶部胞质部分. 方差分析：同月龄比较，对照组与糖尿病组的细胞阳性率，糖尿病组表达均高于对照组. 差异有统计学意义(表1)显示(P<0.01).
表1同月龄糖尿病组与对照组EGFR,凋亡细胞阳性率的比较(略)
bP<0.01 vs对照.
对照组与糖尿病组组内不同月龄比较，EGFR细胞阳性率，对照组随月龄增大呈增强趋势，糖尿病组随着病程延长也呈增强趋势. 糖尿病组表达强于对照组(图1).
2.2TUNEL检测凋亡细胞的结果凋亡细胞在对照组及糖尿病组的导管细胞、腺泡细胞中均有分布，导管细胞中分布较多. 阳性反应物质分布在导管细胞、腺泡细胞的细胞核中，可见完整的细胞膜，胞质皱缩，部分细胞核浓缩深染. 方差分析：同月龄比较，糖尿病组凋亡细胞的阳性率高于对照组. 差异有统计学意义(表1)显示(P<0.01).
对照组与糖尿病组组内不同月龄比较，凋亡细胞阳性率对照组随月龄增大、糖尿病组随着病程延长均呈增强趋势，糖尿病组凋亡细胞的阳性率高于对照组(图2).
A: 4月龄糖尿病组; B: 6月龄糖尿病组; C: 10月龄糖尿病组; D: 10月龄对照组.
图1两组EGFR的表达SP ×200(略)
A: 4月龄糖尿病组; B: 8月龄糖尿病组; C: 10月龄糖尿病组; D: 10月龄对照组.
图2两组的凋亡细胞观察SP ×200(略)
3讨论
目前2型糖尿病动物模型分3种：实验性糖尿病模型，自发性糖尿病模型，转基因动物模型[2]. 我们引进日本C57BL/Ksj-db/+m表型正常隐性基因小鼠，该小鼠因饲养于无菌包中，受外界因素影响小，且在自然情况下发病，故该动物模型性能稳定，实验结果更准确. 该模型与人的2型糖尿病近似，其应用价值更高，是研究及治疗人类2型糖尿病及其并发症的良好动物模型. EGFR存在于许多细胞表面，大多数正常细胞约有20 000~50 000个受体. EGF本身可诱导受体表达；EGFR本身具有蛋白激酶的活性. EGFR是多效应的信息传递者，被激活后能促进有丝分裂或诱导细胞凋亡[3]. 我们发现EGFR在对照组及糖尿病组颌下腺的导管及腺泡细胞中均有表达，阳性率糖尿病组高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)，尤以颗粒曲管中表达最强. 阳性反应物质主要位于导管及腺泡细胞的细胞质中.
同月龄相比，糖尿病组EGFR阳性率的表达均高于同龄对照组，，有显著性差异(P<0.01)，这说明糖尿病时颌下腺EGFR表达增强；组内不同月龄相比，对照组随月龄增大、糖尿病组随病程延长EGFR的表达均增加. 这说明糖尿病、衰老本身作为一种损伤形式，刺激颌下腺，引起颌下腺EGFR水平的增高，可能诱导了颌下腺的细胞凋亡，致使糖尿病时腺体萎缩、分泌功能减低这与组织学观察到的糖尿病时颌下腺组织萎缩，腺实质细胞形态的破坏相一致. 与临床上的唾液减少，口干、口渴现象相吻合.
本研究结果与刘志红等[4]应用免疫组织化学定量分析，对EGF，EGFR进行观察，发现NIDDM肾病患者肾小管上的EGF, EGFR量明显高于正常人，提示肾小管上的EGF，EGFR含量增多可能与糖尿病肾病的肾小管病变的发生有一定联系的结论相一致. 我们采用TUNEL末端标记检测技术，发现在糖尿病组及对照组的导管细胞及腺泡细胞中均有凋亡细胞分布，糖尿病组凋亡细胞阳性率高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)，尤以导管细胞中多见，阳性反应物存在于导管细胞、腺泡细胞的胞核中.
同月龄比较，糖尿病组凋亡细胞阳性率高于对照组，有显著性差异(P<0.01)，这说明糖尿病时颌下腺细胞的凋亡情况比正常状态下更强烈；组内不同月龄比较，对照组与糖尿病组随月龄增大，凋亡细胞阳性率均增加. 这一结果说明，随月龄增大及糖尿病病程的延长，颌下腺细胞凋亡均增强.
本实验表明糖尿病、EGFR对细胞凋亡均有促进作用. 这与组织学观察到的糖尿病时颌下腺组织萎缩，腺实质细胞形态的破坏、临床出现更为严重的颌下腺功能减退，口干、口渴现象加重相一致.
【参考文献】
[1] Jin YT, Kayser S, Kemp BL, et al. The prognostic significance of the biomarkers p21WAFI/CIPI, p53, and bcl2 in laryngeal squamous cell carcinoma[J]. Cancer, 1998, 82(11):2159-2165.
[2] 孙子林. Ⅱ型糖尿病动物模型及其进展[J]. 实验动物科学及管理, 1999,16(2)：44-46.
[3] 葛奎，青春，陆树良，等. 表皮生长因子受体与糖尿病创面难愈[J]. 中国临床康复，2003，7(6)：944-945.
[4] 刘志红，黎磊石，王庆文，等. 非胰岛素依赖型糖尿病肾病肾组织中EGF、EGFR和IGF1R的检测及其意义[J]. 中华内分泌杂志，1994，10(2)：67-70.
编辑黄良田
(承德医学院：附属医院口腔科，组织胚胎学教研室，河北 承德 067000，河北医科大学口腔医院，河北 石家庄 050000，承德市政府门诊部，河北 承德 067000), http://www.100md.com(刘红艳，孟庆丽，高福禄，董福生，王春燕，宋晓晨)