基因工程抗体联合紫杉醇对BT474细胞的促凋亡作用
Apoptotic effect of the combined treatment of engineered antibody with paclitaxel on BT474 cells
YIN Huijing, CHENG Liansheng*, DUAN Jialong*
Lab of Molecular Genetics, School of Life Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036; Lab of Cellular & Molecular Immunology, School of Life Science, Chinese University of Science and Technology, Heifei 230027, China
[Abstract] AIM: To explore the apoptotic effect of the combined treatment of antip185c-erbB-2/neu engineered antibody with paclitaxel on p185overexpressing human malignant breast cancer cell lines BT474 and to study its emerging mechanism. METHODS: The prohibitory effect of engineeded antibody plus paclitaxel on BT474 cells was assessed by MTS assay. The number of apoptotic cells was detected by Annexin VFITC/PI. DNA content and cell cycle distribution were determined by FCM; DNAbinding activity of NFκB was demonstrated by EMSA. RESULTS: Antip185c-erbB-2/neu engineered antibody plus paclitaxel resulted in synergistic effect on proliferative inhibiton of BT474 cells, which was mediated via apoptotic induction and caused cell cycle to arrest at G1 phase remarkably. Furthermore, the combined treatment of the engineered antibody with paclitaxel effectively suppressed the activation of NFκB in BT474 cells. CONCLUSION: The combined treatment of antip185c-erbB-2/neu engineered antibody with paclitaxel rendered p185overexpressing human malignant breast cancer cells BT474 more susceptible to paclitaxelinduced apoptosis by the effective suppression of NFκB activation.
[Keywords]p185c-erbB-2/neu; engineered antibody; paclitaxel; apoptosis; NFκB; breast cancer
[摘 要] 目的: 探讨抗p185c-erbB-2/neu基因工程抗体联合紫杉醇促进p185过表达的人乳腺癌细胞系BT474凋亡的效应及其机制。方法: 采用MTS法检测基因工程抗体联合紫杉醇对BT474细胞增殖的抑制作用。用AnnexinVFITC/PI法检测BT474细胞的凋亡率; 以流式细胞术(FCM)分析DNA含量及细胞周期分布; 用EMSA分析NFκB的活化水平。结果: 基因工程抗体联合紫杉醇对BT474细胞增殖的抑制作用具有协同效应, 并可诱导细胞凋亡, 将细胞阻滞在G1期; 并可显著抑制BT474细胞中NFκB的活化。结论: 紫杉醇诱导乳腺癌细胞BT474凋亡的同时, 可活化NFκB。基因工程抗体联合紫杉醇是通过抑制NFκB的活化而增强紫杉醇诱导癌细胞凋亡的作用。
[关键词]p185c-erbB-2/neu; 基因工程抗体; 紫杉醇; 凋亡; NFκB; 乳腺癌
原癌基因Her2/cerbB2/neu编码的跨膜糖蛋白p185的过表达, 易导致细胞的癌变, 并且与肿瘤的发生、 迁移等密切相关。据统计, 约30%乳腺癌患者的肿瘤组织中p185呈过表达, 这类患者对化疗不敏感、 治愈率低、 预后较差[1]。目前治疗乳腺癌最主要的是化学疗法, 而化疗药物中首推紫杉醇, 但p185过表达的肿瘤恶性程度高、 迁移性和侵润性强,因而折扣了很多包括紫杉醇在内的化疗药物的疗效。由于p185位于肿瘤细胞表面, 药物容易接近, 所以是一个癌症治疗的很好的靶抗原。本研究旨在探讨过表达p185的乳腺癌细胞对紫杉醇产生耐药性的机制, 以及紫杉醇与抗p185cerbB2/neu基因工程抗体联用克服过表达p185的乳腺癌对化疗药物耐药性的作用。
1 材料和方法
1.1 材料 抗p185c-erbB-2/neu基因工程抗体由中国科技大学刘兢教授研究组构建[2]。p185过表达的人乳腺癌细胞系BT474、 p185低表达的人乳腺癌细胞系MCF7购自ATCC公司。胎牛血清(FBS)、 DMEM培养基购自Gibco公司。紫杉醇、 PI、 Braford试剂购自Sigma公司。MTS试剂盒、 EMSA试剂盒购自Promega公司。AnnexinVFITC/PI凋亡检测试剂盒购自Pharmingen公司。[γ-32P]ATP购自北京福瑞生物工程公司。NFκB双链探针序列(5′AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C3′)由Promega公司合成。ELx800酶标读数仪购自BIOTEK公司。流式细胞仪购自Becton Dickinson公司。
1.2 方法
1.2.1 抑制BT474细胞增殖的检测 将BT474细胞置于含100 mL/L FBS的DEME培养液中, 在37℃、 50 mL/L CO2及饱和湿度条件下培养, 每2 d换液1次, 5 d传代1次。收集对数生长期的BT474细胞, 用含10 mL/L FBS的DEME培养液稀释成5×107个/L, 接种于96孔板中, 每孔100 μL。待细胞完全贴壁(24 h)后分组换液、 加药。基因工程抗体和紫杉醇于临用前, 用含10 mL/L FBS的DEME培养液稀释。①抗体组(分3个亚组): 分别加入终浓度为0.2、 1.0、 5.0 mg/L的基因工程抗体; ②紫杉醇组(分3个亚组): 分别加入终浓度为0.01、 0.05、 0.25 mg/L的紫杉醇; ③联用组(分9个亚组): 分别加入终浓度为02+001、 02+005、 02+025、 10+001、 10+005、 10+025、 50+001、 50+005、 50+025 mg/L的抗体+紫杉醇; ④细胞对照组: 将BT474细胞的原培养液替换成含10 mL/L FBS的DEME培养液。另外, 设HER2阴性细胞作为对照, MCF7细胞的接种(同前述), 细胞贴壁后分组换液, ①抗体组(同前述); ②细胞对照组: 将MCF7细胞的原培养液替换成含10 mL/L FBS的DEME培养液。每个亚组均设3个复孔, 每孔100 μL。药物作用72 h后, 按MTS试剂盒的说明书进行操作。再继续培养4 h, 用酶标仪于波长490 nm测定吸光度(A)值。细胞增殖的抑制率=(1-实验组的A490值/细胞对照组的A490值)×100%。药物联用的效应q=E(A+B)/[EA+(1-EA)×EB], 其中E(A+B)为联用的抑制率(%), EA、 EB为单用的抑制率(%)。q>115者表明联用呈协同效应; q=085~115者表明联用呈叠加效应; q<085者表明联用呈拮抗效应[3]。
1.2.2 细胞凋亡率的AnnexinVFITC/PI法检测 收集对数生长期的BT474细胞, 按6×107个/L细胞接种于75 mL的培养瓶中, 每瓶5 mL。细胞密度达到80%时, 分组换液、 加药。①抗体组: 加入终浓度为5.0 mg/L的基因工程抗体; ②紫杉醇组: 加入终浓度为025 mg/L的紫杉醇; ③联用组: 加入终浓度为50 mg/L的基因工程抗体+025 mg/L的紫杉醇; ④细胞对照组: 将BT474细胞的原培养液替换成含10 mL/L FBS的DEME培养液。每组均设3个平行的瓶, 每瓶5 mL。药物作用72 h后, 用预冷的PBS洗细胞两次, 每瓶加入1 mL预冷的PBS, 用细胞刮刀刮下单层细胞并移入1.5 mL的离心管中, 于4℃以1000 r/min离心10 min。弃上清, 在细胞沉淀中加入适量预冷的PBS将细胞密度调整到1×109个/L, 按照AnnexinVFITC/PI凋亡检测试剂盒的说明书进行操作, 用FCM分析细胞的凋亡率。
1.2.3 DNA含量及细胞周期分布的FACS分析 实验步骤基本同122, 仅在使用AnnexinVFITC/PI凋亡检测试剂盒时, 细胞只用PI单染。
1.2.4 NFκB活化水平的EMSA分析 (1)细胞核蛋白的制备和浓度测定: 细胞接种和分组均同1.2.2。药物作用72 h后, 分别用预冷的PBS洗细胞2次, 每瓶加入1 mL预冷的PBS, 用细胞刮刀刮下单层细胞并移入1.5 mL离心管中, 于4℃以4000 r/min离心2 min。弃上清, 在细胞沉淀中加入500 μL buffer A(10 mmol/L HEPESKOH pH7.9, 15 mmol/L MgCl2、 10 mmol/L KCl、 05 mmol/L DTT及02 mmol/L PMSF), 置冰浴中5 min, 再加入500 μL的buffer B(即buffer A中再加入10 mL/L NP40)混匀后, 再置冰浴中5 min, 离心(同前述)。弃上清, 在细胞沉淀中加入1 mL buffer C(即将buffer B中的10 mL/L NP40改为5 mL/L NP40)洗涤后离心(同前述)。弃上清, 将细胞沉淀悬浮于50 μL buffer D(20mmol/L HEPESKOH pH79, 15mmol/L MgCl2、 420mmol/L NaCl、 02 mmol/L EDTA、 250 mL/L甘油、 05 mmol/L DTT及02 mmol/L PMSF), 置冰浴中30 min (期间涡旋搅拌), 于4℃以14 000 r/min离心2min。收集上清液, 用Bradford试剂测定核蛋白的浓度, 并用buffer D将浓度全部调至1.0mg/L,于-80℃冻存。(2)NFκB探针的标记、 纯化及EMSA实验: 严格按照EMSA试剂盒的说明书进行操作。
1.2.5 统计学处理 数据用x±s表示, 组间比较采用SAS(90)统计软件进行oneway ANOVA、 t检验及Pearson分析, P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 抗体、 紫杉醇对BT474细胞增殖的抑制作用 抗体组及紫杉醇组的抑制率均随着剂量的增加而升高(P<001 vs BT474细胞对照组)。联用组在抗体的浓度相同的情况下, 抑制率随紫杉醇剂量的增加而升高(P<001 vs 抗体单用组); 在紫杉醇的浓度相同的情况下, 抑制率随抗体剂量的增加而升高(P<001 vs 紫杉醇单用组); 联用组的抑制率均显著高于相对应的单用组(P<001), 如单用50 mg/L抗体的抑制率为15879%, 单用025 mg/L紫杉醇的抑制率为15543%; 而将二者联用的抑制率可达67587%。表明两药联用具有协同效应(图1)。另外, 不同剂量的抗体对HER2阴性细胞MCF7的抑制作用差异无统计学意义(P>005, 图2)。
图1 抗体、紫杉醇及二者联用对BT474细胞增殖的抑制作用(略)
Fig 1 Inhibitory effect on proliferation of BT474 cells treated with antibody, TAX and antibody+TAX, respectively
A-C: Antibody (02, 10, 50 mg/L); D-F: TAX (001, 005, 025 mg/L); G-O: Antibody+TAX (02+001, 02+005, 02+025, 10+001, 10+005, 10+025, 50+001, 50+005, 50+025 mg/L); bP<001 vs antibody group or TAX group accordingly.
图2 抗体对MCF7细胞增殖的抑制作用(略)
Fig 2 Inhibitory effect of antibody on proliferation of MCF7 cells
2.2 细胞凋亡的AnnexinVFITC/PI法检测 AnnexinVFITC/PI法检测表明, 细胞对照组、 抗体组、 紫杉醇组以及联用组BT474细胞的凋亡率, 分别为131%、 728%、 957%及3779%。其中抗体组、 紫杉醇组及联用组BT474细胞的凋亡率均明显高于细胞对照组(P<001), 联用组又明显高于抗体组和紫杉醇组(P<001, 图3)。
图3 抗体、 紫杉醇及二者联用诱导BT474细胞凋亡的AnnexinVFITC/PI法检测(略)
Fig 3 Detection of apoptosis of BT474 cells induced with antibody, TAX and antibody+TAX by AnnexinVPITC/PI
A: Control group; B: Antibody group; C: TAX group; D: Antibody+TAX group.
2.3 DNA含量及细胞周期分布的FCM分析 与细胞对照组相比较, 抗体组中的细胞被阻滞在G1期, 紫杉醇组中的细胞被阻滞在G2期, 联用组中的细胞被阻滞在G1期。其中联用组中G1期的细胞所占百分比明显高于细胞对照组和抗体组(P<001), 并在亚G1期形成亚二倍体峰(凋亡峰, 图4)。
图4 抗体、 紫杉醇及二者联用对DNA含量和细胞周期分布的影响(略)
Fig 4 Effects of treatment with antibody, TAX and antibody+TAX, respectively on DNA content and cell cycle distribution
A: Control group; B: Antibody group; C: TAX group; D: Antibody+TAX group.
2.4 NFκB活化的EMSA分析 根据图5中凝胶迁移滞后带的强弱可判断NFκB的活化水平。与细胞对照组(图5a)相比较, 联用组中NFκB的活化明显被抑制(图5d); 但紫杉醇组中NFκB的活化明显增强(图5c)。
图5 抗体、 紫杉醇及二者联用对BT474细胞中NFκB活化的EMSA检测(略)
Fig 5 Detection of NFκB activation in BT474 cells treated with antibody, TAX and antibody+TAX by EMSA
a: Positive control group; b: Antibody group; c: TAX group; d: Antibody+TAX group; e: Negative control group.
3 讨论
化疗药物治疗乳腺癌的主要机制是诱导癌细胞凋亡。NFκB是一种重要的凋亡拮抗因子, 自1996年Wang等[4]最先发现NFκB是TNF和化疗药物诱导癌细胞凋亡耐受的主要蛋白后, 又有研究表明, 化疗药物在诱导癌细胞凋亡的同时可活化NFκB, 从而启动一系列与细胞存活有关的抗凋亡基因的表达, 使癌细胞对化疗药物产生耐药性。近年有研究表明[5], p185过表达的癌症与NFκB活化的关系十分密切。我们首先采用MTS法探讨了抗p185c-erbB-2/neu基因工程抗体与紫杉醇联用对BT474细胞增殖的抑制作用, q值提示二者联用具有协同效应。协同效应的解释可能为: (1)基因工程抗体作用于p185受体介导的信号通路, 紫杉醇作用于Fas/FasL通路, 二者的协同效应是作用于不同靶点的效果叠加[6]; (2)紫杉醇使癌细胞的p185受体功能性上调, 从而增加了癌细胞对基因工程抗体的敏感性[7]。AnnexinVFITC/PI法检测凋亡细胞的结果提示, BT474细胞增殖的抑制可能是通过诱导其凋亡而实现的。根据FCM分析的结果, 推测抗体与紫杉醇联用很可能导致DNA受损, 刺激p53的表达及活化并促进细胞周期激酶抑制子p21/WAF1复合体的表达, 故将细胞阻滞在G1期[8]。EMSA的结果表明, 紫杉醇可诱导BT474细胞中NFκB的活化, 若与基因工程抗体联用则可明显抑制NFκB活化, 表明化疗药物诱导NFκB的活化可能是导致癌细胞产生耐药性的原因之一。
致谢: 感谢中国科技大学生命科学学院刘兢教授、 肖卫华教授、 吴缅教授、 王取南博士后、 窦震博士后、 朱的娥博士、 洪靖君博士、 洪波硕士、 董艳秋实验师以及同位素实验中心负责人丁俐丽老师对实验的支持与帮助。
参考文献:
[1] Wilson CA, Cajulis EE, Green JL, et al. HER2 overexpression differentially alters transforming growth factorbeta responses in luminal versus mesenchymal human breast cancer cells[J]. Breast Cancer Res, 2005, 7(6): 1058-1079.
[2] Cheng LS, Liu AP,Yang JH, et al. Construction, expression and characterization of the engineering antibody against tumor surface antigen, p185c-erbB-2[J]. Cell Res, 2003, 13(1): 35-48.
[3] Shao ZM, Shen ZZ, Liu CH, et al. Curcumin exerts multiple suppressive effects on human breast carcinoma cells[J]. Int J Cancer, 2002, 98(2): 234-240.
[4] Wang CY, Mayo MW, Baldwin AS, et al. TNF and cancer therapyinduced apoptosis: potentiation by inhibition of NFkappaB[J]. Science, 1996, 274(5288): 784-787.
[5] Biswas DK, Shi Q, Baily S, et al. NFkappa B activation in human breast cancer specimens and its role in cell proliferation and apoptosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(27): 10137-10142.
[6] Baselga J, Norton L, Albanell J, et al. Recombinant humanized antiHER2 antibody (Herceptin) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts[J]. Cancer Res, 1998, 58(13): 2825-2831.
[7] Blagosklonny MV, Schulte TW, Nguyen P, et al. Taxol induction of p21WAF1 and p53 requires craf1[J]. Cancer Res, 1995, 55(20): 4623-4626.
[8] Hoti N, Zhu DE, Song Z, et al. p53dependent apoptotic mechanism of a new designer bimetallic compound triphenyl tin benzimidazolethiol copper chloride (TPTCuCl2): in vivo studies in Wistar rats as well as in vitro studies in human cervical cancer cells[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2004, 311(1): 22-33.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30400078);安徽省自然科学基金资助项目(050430201)
(安徽农业大学生命科学学院分子遗传学实验室, 安徽 合肥230036; 中国科学技术大学生命科学学院细胞与分子免疫学实验室, 安徽 合肥 230027), 百拇医药(尹荟菁, 程联胜, 段家龙)
YIN Huijing, CHENG Liansheng*, DUAN Jialong*
Lab of Molecular Genetics, School of Life Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036; Lab of Cellular & Molecular Immunology, School of Life Science, Chinese University of Science and Technology, Heifei 230027, China
[Abstract] AIM: To explore the apoptotic effect of the combined treatment of antip185c-erbB-2/neu engineered antibody with paclitaxel on p185overexpressing human malignant breast cancer cell lines BT474 and to study its emerging mechanism. METHODS: The prohibitory effect of engineeded antibody plus paclitaxel on BT474 cells was assessed by MTS assay. The number of apoptotic cells was detected by Annexin VFITC/PI. DNA content and cell cycle distribution were determined by FCM; DNAbinding activity of NFκB was demonstrated by EMSA. RESULTS: Antip185c-erbB-2/neu engineered antibody plus paclitaxel resulted in synergistic effect on proliferative inhibiton of BT474 cells, which was mediated via apoptotic induction and caused cell cycle to arrest at G1 phase remarkably. Furthermore, the combined treatment of the engineered antibody with paclitaxel effectively suppressed the activation of NFκB in BT474 cells. CONCLUSION: The combined treatment of antip185c-erbB-2/neu engineered antibody with paclitaxel rendered p185overexpressing human malignant breast cancer cells BT474 more susceptible to paclitaxelinduced apoptosis by the effective suppression of NFκB activation.
[Keywords]p185c-erbB-2/neu; engineered antibody; paclitaxel; apoptosis; NFκB; breast cancer
[摘 要] 目的: 探讨抗p185c-erbB-2/neu基因工程抗体联合紫杉醇促进p185过表达的人乳腺癌细胞系BT474凋亡的效应及其机制。方法: 采用MTS法检测基因工程抗体联合紫杉醇对BT474细胞增殖的抑制作用。用AnnexinVFITC/PI法检测BT474细胞的凋亡率; 以流式细胞术(FCM)分析DNA含量及细胞周期分布; 用EMSA分析NFκB的活化水平。结果: 基因工程抗体联合紫杉醇对BT474细胞增殖的抑制作用具有协同效应, 并可诱导细胞凋亡, 将细胞阻滞在G1期; 并可显著抑制BT474细胞中NFκB的活化。结论: 紫杉醇诱导乳腺癌细胞BT474凋亡的同时, 可活化NFκB。基因工程抗体联合紫杉醇是通过抑制NFκB的活化而增强紫杉醇诱导癌细胞凋亡的作用。
[关键词]p185c-erbB-2/neu; 基因工程抗体; 紫杉醇; 凋亡; NFκB; 乳腺癌
原癌基因Her2/cerbB2/neu编码的跨膜糖蛋白p185的过表达, 易导致细胞的癌变, 并且与肿瘤的发生、 迁移等密切相关。据统计, 约30%乳腺癌患者的肿瘤组织中p185呈过表达, 这类患者对化疗不敏感、 治愈率低、 预后较差[1]。目前治疗乳腺癌最主要的是化学疗法, 而化疗药物中首推紫杉醇, 但p185过表达的肿瘤恶性程度高、 迁移性和侵润性强,因而折扣了很多包括紫杉醇在内的化疗药物的疗效。由于p185位于肿瘤细胞表面, 药物容易接近, 所以是一个癌症治疗的很好的靶抗原。本研究旨在探讨过表达p185的乳腺癌细胞对紫杉醇产生耐药性的机制, 以及紫杉醇与抗p185cerbB2/neu基因工程抗体联用克服过表达p185的乳腺癌对化疗药物耐药性的作用。
1 材料和方法
1.1 材料 抗p185c-erbB-2/neu基因工程抗体由中国科技大学刘兢教授研究组构建[2]。p185过表达的人乳腺癌细胞系BT474、 p185低表达的人乳腺癌细胞系MCF7购自ATCC公司。胎牛血清(FBS)、 DMEM培养基购自Gibco公司。紫杉醇、 PI、 Braford试剂购自Sigma公司。MTS试剂盒、 EMSA试剂盒购自Promega公司。AnnexinVFITC/PI凋亡检测试剂盒购自Pharmingen公司。[γ-32P]ATP购自北京福瑞生物工程公司。NFκB双链探针序列(5′AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C3′)由Promega公司合成。ELx800酶标读数仪购自BIOTEK公司。流式细胞仪购自Becton Dickinson公司。
1.2 方法
1.2.1 抑制BT474细胞增殖的检测 将BT474细胞置于含100 mL/L FBS的DEME培养液中, 在37℃、 50 mL/L CO2及饱和湿度条件下培养, 每2 d换液1次, 5 d传代1次。收集对数生长期的BT474细胞, 用含10 mL/L FBS的DEME培养液稀释成5×107个/L, 接种于96孔板中, 每孔100 μL。待细胞完全贴壁(24 h)后分组换液、 加药。基因工程抗体和紫杉醇于临用前, 用含10 mL/L FBS的DEME培养液稀释。①抗体组(分3个亚组): 分别加入终浓度为0.2、 1.0、 5.0 mg/L的基因工程抗体; ②紫杉醇组(分3个亚组): 分别加入终浓度为0.01、 0.05、 0.25 mg/L的紫杉醇; ③联用组(分9个亚组): 分别加入终浓度为02+001、 02+005、 02+025、 10+001、 10+005、 10+025、 50+001、 50+005、 50+025 mg/L的抗体+紫杉醇; ④细胞对照组: 将BT474细胞的原培养液替换成含10 mL/L FBS的DEME培养液。另外, 设HER2阴性细胞作为对照, MCF7细胞的接种(同前述), 细胞贴壁后分组换液, ①抗体组(同前述); ②细胞对照组: 将MCF7细胞的原培养液替换成含10 mL/L FBS的DEME培养液。每个亚组均设3个复孔, 每孔100 μL。药物作用72 h后, 按MTS试剂盒的说明书进行操作。再继续培养4 h, 用酶标仪于波长490 nm测定吸光度(A)值。细胞增殖的抑制率=(1-实验组的A490值/细胞对照组的A490值)×100%。药物联用的效应q=E(A+B)/[EA+(1-EA)×EB], 其中E(A+B)为联用的抑制率(%), EA、 EB为单用的抑制率(%)。q>115者表明联用呈协同效应; q=085~115者表明联用呈叠加效应; q<085者表明联用呈拮抗效应[3]。
1.2.2 细胞凋亡率的AnnexinVFITC/PI法检测 收集对数生长期的BT474细胞, 按6×107个/L细胞接种于75 mL的培养瓶中, 每瓶5 mL。细胞密度达到80%时, 分组换液、 加药。①抗体组: 加入终浓度为5.0 mg/L的基因工程抗体; ②紫杉醇组: 加入终浓度为025 mg/L的紫杉醇; ③联用组: 加入终浓度为50 mg/L的基因工程抗体+025 mg/L的紫杉醇; ④细胞对照组: 将BT474细胞的原培养液替换成含10 mL/L FBS的DEME培养液。每组均设3个平行的瓶, 每瓶5 mL。药物作用72 h后, 用预冷的PBS洗细胞两次, 每瓶加入1 mL预冷的PBS, 用细胞刮刀刮下单层细胞并移入1.5 mL的离心管中, 于4℃以1000 r/min离心10 min。弃上清, 在细胞沉淀中加入适量预冷的PBS将细胞密度调整到1×109个/L, 按照AnnexinVFITC/PI凋亡检测试剂盒的说明书进行操作, 用FCM分析细胞的凋亡率。
1.2.3 DNA含量及细胞周期分布的FACS分析 实验步骤基本同122, 仅在使用AnnexinVFITC/PI凋亡检测试剂盒时, 细胞只用PI单染。
1.2.4 NFκB活化水平的EMSA分析 (1)细胞核蛋白的制备和浓度测定: 细胞接种和分组均同1.2.2。药物作用72 h后, 分别用预冷的PBS洗细胞2次, 每瓶加入1 mL预冷的PBS, 用细胞刮刀刮下单层细胞并移入1.5 mL离心管中, 于4℃以4000 r/min离心2 min。弃上清, 在细胞沉淀中加入500 μL buffer A(10 mmol/L HEPESKOH pH7.9, 15 mmol/L MgCl2、 10 mmol/L KCl、 05 mmol/L DTT及02 mmol/L PMSF), 置冰浴中5 min, 再加入500 μL的buffer B(即buffer A中再加入10 mL/L NP40)混匀后, 再置冰浴中5 min, 离心(同前述)。弃上清, 在细胞沉淀中加入1 mL buffer C(即将buffer B中的10 mL/L NP40改为5 mL/L NP40)洗涤后离心(同前述)。弃上清, 将细胞沉淀悬浮于50 μL buffer D(20mmol/L HEPESKOH pH79, 15mmol/L MgCl2、 420mmol/L NaCl、 02 mmol/L EDTA、 250 mL/L甘油、 05 mmol/L DTT及02 mmol/L PMSF), 置冰浴中30 min (期间涡旋搅拌), 于4℃以14 000 r/min离心2min。收集上清液, 用Bradford试剂测定核蛋白的浓度, 并用buffer D将浓度全部调至1.0mg/L,于-80℃冻存。(2)NFκB探针的标记、 纯化及EMSA实验: 严格按照EMSA试剂盒的说明书进行操作。
1.2.5 统计学处理 数据用x±s表示, 组间比较采用SAS(90)统计软件进行oneway ANOVA、 t检验及Pearson分析, P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 抗体、 紫杉醇对BT474细胞增殖的抑制作用 抗体组及紫杉醇组的抑制率均随着剂量的增加而升高(P<001 vs BT474细胞对照组)。联用组在抗体的浓度相同的情况下, 抑制率随紫杉醇剂量的增加而升高(P<001 vs 抗体单用组); 在紫杉醇的浓度相同的情况下, 抑制率随抗体剂量的增加而升高(P<001 vs 紫杉醇单用组); 联用组的抑制率均显著高于相对应的单用组(P<001), 如单用50 mg/L抗体的抑制率为15879%, 单用025 mg/L紫杉醇的抑制率为15543%; 而将二者联用的抑制率可达67587%。表明两药联用具有协同效应(图1)。另外, 不同剂量的抗体对HER2阴性细胞MCF7的抑制作用差异无统计学意义(P>005, 图2)。
图1 抗体、紫杉醇及二者联用对BT474细胞增殖的抑制作用(略)
Fig 1 Inhibitory effect on proliferation of BT474 cells treated with antibody, TAX and antibody+TAX, respectively
A-C: Antibody (02, 10, 50 mg/L); D-F: TAX (001, 005, 025 mg/L); G-O: Antibody+TAX (02+001, 02+005, 02+025, 10+001, 10+005, 10+025, 50+001, 50+005, 50+025 mg/L); bP<001 vs antibody group or TAX group accordingly.
图2 抗体对MCF7细胞增殖的抑制作用(略)
Fig 2 Inhibitory effect of antibody on proliferation of MCF7 cells
2.2 细胞凋亡的AnnexinVFITC/PI法检测 AnnexinVFITC/PI法检测表明, 细胞对照组、 抗体组、 紫杉醇组以及联用组BT474细胞的凋亡率, 分别为131%、 728%、 957%及3779%。其中抗体组、 紫杉醇组及联用组BT474细胞的凋亡率均明显高于细胞对照组(P<001), 联用组又明显高于抗体组和紫杉醇组(P<001, 图3)。
图3 抗体、 紫杉醇及二者联用诱导BT474细胞凋亡的AnnexinVFITC/PI法检测(略)
Fig 3 Detection of apoptosis of BT474 cells induced with antibody, TAX and antibody+TAX by AnnexinVPITC/PI
A: Control group; B: Antibody group; C: TAX group; D: Antibody+TAX group.
2.3 DNA含量及细胞周期分布的FCM分析 与细胞对照组相比较, 抗体组中的细胞被阻滞在G1期, 紫杉醇组中的细胞被阻滞在G2期, 联用组中的细胞被阻滞在G1期。其中联用组中G1期的细胞所占百分比明显高于细胞对照组和抗体组(P<001), 并在亚G1期形成亚二倍体峰(凋亡峰, 图4)。
图4 抗体、 紫杉醇及二者联用对DNA含量和细胞周期分布的影响(略)
Fig 4 Effects of treatment with antibody, TAX and antibody+TAX, respectively on DNA content and cell cycle distribution
A: Control group; B: Antibody group; C: TAX group; D: Antibody+TAX group.
2.4 NFκB活化的EMSA分析 根据图5中凝胶迁移滞后带的强弱可判断NFκB的活化水平。与细胞对照组(图5a)相比较, 联用组中NFκB的活化明显被抑制(图5d); 但紫杉醇组中NFκB的活化明显增强(图5c)。
图5 抗体、 紫杉醇及二者联用对BT474细胞中NFκB活化的EMSA检测(略)
Fig 5 Detection of NFκB activation in BT474 cells treated with antibody, TAX and antibody+TAX by EMSA
a: Positive control group; b: Antibody group; c: TAX group; d: Antibody+TAX group; e: Negative control group.
3 讨论
化疗药物治疗乳腺癌的主要机制是诱导癌细胞凋亡。NFκB是一种重要的凋亡拮抗因子, 自1996年Wang等[4]最先发现NFκB是TNF和化疗药物诱导癌细胞凋亡耐受的主要蛋白后, 又有研究表明, 化疗药物在诱导癌细胞凋亡的同时可活化NFκB, 从而启动一系列与细胞存活有关的抗凋亡基因的表达, 使癌细胞对化疗药物产生耐药性。近年有研究表明[5], p185过表达的癌症与NFκB活化的关系十分密切。我们首先采用MTS法探讨了抗p185c-erbB-2/neu基因工程抗体与紫杉醇联用对BT474细胞增殖的抑制作用, q值提示二者联用具有协同效应。协同效应的解释可能为: (1)基因工程抗体作用于p185受体介导的信号通路, 紫杉醇作用于Fas/FasL通路, 二者的协同效应是作用于不同靶点的效果叠加[6]; (2)紫杉醇使癌细胞的p185受体功能性上调, 从而增加了癌细胞对基因工程抗体的敏感性[7]。AnnexinVFITC/PI法检测凋亡细胞的结果提示, BT474细胞增殖的抑制可能是通过诱导其凋亡而实现的。根据FCM分析的结果, 推测抗体与紫杉醇联用很可能导致DNA受损, 刺激p53的表达及活化并促进细胞周期激酶抑制子p21/WAF1复合体的表达, 故将细胞阻滞在G1期[8]。EMSA的结果表明, 紫杉醇可诱导BT474细胞中NFκB的活化, 若与基因工程抗体联用则可明显抑制NFκB活化, 表明化疗药物诱导NFκB的活化可能是导致癌细胞产生耐药性的原因之一。
致谢: 感谢中国科技大学生命科学学院刘兢教授、 肖卫华教授、 吴缅教授、 王取南博士后、 窦震博士后、 朱的娥博士、 洪靖君博士、 洪波硕士、 董艳秋实验师以及同位素实验中心负责人丁俐丽老师对实验的支持与帮助。
参考文献:
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基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30400078);安徽省自然科学基金资助项目(050430201)
(安徽农业大学生命科学学院分子遗传学实验室, 安徽 合肥230036; 中国科学技术大学生命科学学院细胞与分子免疫学实验室, 安徽 合肥 230027), 百拇医药(尹荟菁, 程联胜, 段家龙)