小鼠抗人细胞色素P450 1A2合成肽抗血清的制备与鉴定
\[摘 要\] 目的: 制备小鼠抗人细胞色素P450 1A2 (CYP1A2)抗体及其特性鉴定。方法: 利用生物信息学方法分析CYP1A2蛋白的序列, 根据4个指标(亲水性、 柔韧性、 抗原性及表面性)选择欲合成的多肽序列, 设计、 合成CYP1A2多肽。将其与载体蛋白钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin, KLH)偶联, 免疫BALB/c雌性小鼠制备抗CYP1A2抗体。用间接ELISA法测定抗体的效价, Western blot鉴定其特异性。结果: 成功地获得针对小分子CYP1A2的抗体。该抗体效价为1∶16000, 可与CYP1A2合成肽及天然CYP1A2出现特异性反应。Western blot的结果显示, 该抗体识别的相应抗原的相对分子质量(Mr)为58000。结论: 合成的多肽KLH复合物具有免疫原性, 可用于制备相应的抗体。制备的小鼠抗CYP1A2合成肽抗体的效价高及特异性良好。
\[关键词\]CYP1A2; 合成肽; 抗体; 小鼠
CYP1A2和CYP1A1是CYP1A亚家族中仅有的两个成员\[1\], 它们在人体中的表达各有其组织特异性, CYP1A2主要在肝脏表达\[2\], 也有在脑组织中检出CYP1A2 mRNA而无蛋白表达的报道\[3\]。由于CYP1A2将某些杂环芳香族前致癌物激活代谢成致癌物, 例如CYP1A2催化的食物烹调过程中产生的2氨基1甲基6苯基亚氨基\[4, 5b\]吡啶的N2羟基化激活反应, 在化学致癌中起着非常重要的作用\[4], 因此, 研制CYP1A2抗体将对CYP1A2功能的研究以及抗癌药的研制、 开发具有重要的理论意义和临床价值。本研究中研制小鼠抗CYP1A2的抗体并进行了部分特性鉴定, 为后续的研究工作奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料 福氏佐剂及3,3,5,5四甲基联苯胺(TMB)均购自Sigma公司。HRP山羊抗小鼠IgG购自Jackson Immuno Research公司。牛血清白蛋白(BSA)购自Solarbio公司。硝酸纤维素膜购自BIORAD公司。ECL Plus购自Amersham Biosciences公司。其他试剂均为国产分析纯。电动玻璃匀浆机(DY891型)为宁波新芝生物科技股份有限公司产品。酶标仪(MK3)为Thermo公司产品。电泳槽(DYCZ24D型)、 电泳仪(DYY6B型)均为BIORAD公司产品。多肽合成及其与KLH、 BSA的联接由北京中科亚光生物有限公司完成。6周龄BALB/c雌性小鼠, 由哈尔滨医科大学动物中心提供。正常人肝脏组织, 由“人类肝脏蛋白质组计划”项目提供。
1.2 方法
1.2.1 CYP1A2抗原表位的分析 由SWISS PROT网站获知CYP1A2蛋白的序列, 然后利用DNAStar软件分析其序列的特点, 根据对其亲水性(hydrophilicity)、 柔韧性(flexibility)、 抗原性(antigenicity)及表面性(surface property)4个参数预测的结果, 确定351～365位15个氨基酸作为欲合成的多肽序列: GRERRPRLSDRPQLP。
1.2.2 CYP1A2多肽的合成及其与KLH和BSA的交联 CYP1A2多肽由北京中科亚光生物有限公司采用多肽自动合成仪合成; CYP1A2与KLH和BSA的交联采用戊二醛连接法\[5\], 将5 mg合成多肽分别加入7 mg KLH和BSA中, 边振荡边缓慢加入新鲜配制的3 g/L的戊二醛溶液(1 mL), 室温作用2 h。以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜。交联形成CYP1A2KLH、 CYP1A2BSA偶联物。
1.2.3 小鼠抗CYP1A2多肽抗体的制备\[6\] 取0.5 mg多肽KLH偶联物加250 μL的去离子水与等量的完全福氏佐剂充分乳化后, 于小鼠(2只)背部注射两点,每点约20 μg, 剩余的腹腔注射。3周后加强免疫, 剂量同前, 用不完全福氏佐剂充分乳化后, 注射于小鼠腹腔; 以后隔两周加强1次; 从第3次加强免疫开始, 每次免疫后7 d, 经尾静脉采血测定抗体的效价, 符合要求时, 用不加佐剂的多肽KLH腹腔注射再加强免疫1次, 3 d后取血, 分离血清后, 无菌分装保存于-80℃备用。
1.2.4 人肝脏微粒体蛋白制备 取10 g正常人的肝脏、 剪碎, 用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白后, 加入上述磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆。然后将肝匀浆依次于4℃以10000 g 离心30 min, 取上清液, 以30000 g离心60 min, 取上清液及100000 g离心60 min, 取粉红色沉淀后, 悬浮于磷酸钾盐缓冲液(含有200 mL/L甘油, 5 g/L胆酸钠, 2 mg/L抑肽酶, 2 mg/L亮肽素, 1 mg/L胃酶抑素及1 mmol/L苯甲基磺酰氟)中, 用Bradford法进行蛋白定量。分装后, 置于-80℃冰箱内贮存备用。
1.2.5 抗血清的特性鉴定 ①效价测定: 采用间接ELISA法。以1 mg/L多肽BSA偶联物包被酶标板, 依次加入不同浓度的鼠抗血清及1∶3000 HRP山羊抗小鼠IgG, 以TMB显色后, 用酶标仪测定A450值。②特异性鉴定: 采用Western blot分析。用2×SDS上样缓冲液悬浮制备的人肝脏微粒体蛋白、 多肽BSA及BSA, 于95℃加热7 min, 置于冰上冷却10 min。上样量为50 μg, 经SDSPAGE分离后, 以湿转法电转至硝酸纤维素膜上。经脱脂奶粉封闭(室温1 h)后, 依次滴加1∶1000稀释抗血清(4℃过夜, 以1 mL/L Tween20 TBS洗膜3次)及1∶10000 HRP山羊抗小鼠IgG(室温孵育1 h, 以1 mL/L Tween20 TBS洗膜3次)。用化学发光剂试剂盒(ECL Plus)处理5 min后, 于暗室曝光到X胶片上, 显影、 定影。
2 结果
2.1 CYP1A2的氨基酸序列分析 为了提高抗体的特异性, 尽可能地避免制备的抗体与细胞色素P450家族其他同源蛋白之间的交叉反应, 用DNAStar软件对蛋白序列进行分析(图1)。根据亲水性、 柔韧性、 抗原性及表面性4个参数预测的结果进行综合考虑, 选取欲合成的多肽序列为351～365位氨基酸(图中阴影区): GRERRPRLSDRPQLP。
图1 DNAstar软件对人CYP1A2蛋白序列参数的预测 略
2.2 抗血清的特性鉴定 ①效价测定: 间接ELISA法检测表明, 抗血清的效价为1∶16000。②抗体特异性鉴定: 以制备的人肝脏微粒体蛋白、 多肽BSA、 BSA作为抗原, 以小鼠抗血清作为一抗进行Western blot分析显示, 抗血清与人肝脏微粒体蛋白在Mr约为58000处出现1条清晰的带, 与CYP1A2的分子量相符; 与多肽BSA在Mr约为69000处出现1条清晰的带, 与BSA分子量相符; 而与BSA则无条带出现(图2)。说明所制备的抗体可识别含有半抗原的抗原表位的蛋白并能与天然CYP1A2蛋白结合。
图2 抗血清特异性的Western blot分析 略
3 讨论
随着人类基因组计划的完成,蛋白质研究已成为后基因组时代的重要任务。抗体是研究蛋白质的必不可少的工具之一, 在一种新的cDNA被克隆后, 根据推导出的氨基酸序列人工合成多肽并与载体偶联, 免疫制备其抗体, 是一个快速而有效的手段。抗原表位的选择是制备合成肽的关键。一般认为, 亲水性强和具有稳定构象的线性表位, 对于维持抗原的免疫反应性极其重要\[7\]。我们通过综合分析CYP1A2的亲水性、 柔韧性、 抗原性及表面性4个参数预测的结果, 最终确定以亲水性强、 抗原指数高、 表面性及柔韧性好的区域(即351～365位15个氨基酸)作为CYP1A2的抗原决定簇。但有些亲水肽段形成的抗原决定簇在变性条件下可受到破坏, 其抗体因而不能用于Western blot分析, 需要对抗体进行全面鉴定。鉴于KLH具有较强的免疫原性, 因而将合成肽与KLH的偶联作为抗原制备抗CYP1A2的抗体。虽然合成肽与载体蛋白偶联可增加免疫原性, 但也会产生一定的抗KLH抗体。所以, 在间接ELISA法中包被抗原用多肽BSA而不是多肽KLH, 以避免KLH的干扰。同样原因, 在Western blot实验中, 用多肽BSA作抗原, 这样在Mr约为69000处出现1条清晰的条带(与BSA的Mr相符合), 而以BSA作为抗原则无条带出现, 说明该抗血清可与CYP1A2合成肽特异性结合。用人肝微粒体蛋白作为抗原, 在Mr约为58000处可出现1条清晰的条带(与CYP1A2的Mr相符合), 说明该抗血清可与天然的CYP1A2结合, 而与其他细胞色素P450无交叉反应, 该抗血清虽未经纯化已显示出具有高度的特异性。诚然, 制备抗血清一般都免疫兔, 本实验中免疫小鼠制备抗血清的原因是小鼠所需抗原量较少。我们用少量抗原进行试验, 证明所设计和合成的多肽是成功的, 正在免疫兔大量制备抗血清以满足后续研究应用。
参考文献:
\[1\] Nebert DW, Jaiswal AK, Meyer UA, et al. Human P450 genes: evolution, regulation and possible role in carcinogenesis\[J\]. Biochem Soc Trans, 1987, 15(4): 586-589.
\[2\] Pelkonen O, Maenpaa J, Taavitsainen P, et al. Inhibition and induction of human cytochrome P450 (CYP) enzymes\[J\]. Xenobiotica, 1998, 28(12): 1203-1253.
\[3\] Farin FM, Omiecinski CJ. Regiospecific expression of cytochrome P450s and microsomal epoxide hydrolase in human brain tissue\[J\]. J Toxicol Envi ron Health, 1993, 40(223): 317-335.
\[4\] Cheung C, Ma X, Krausz KW, et al. Differential metabolism of 2amino1methyl6phenylimidazo\[4, 5b\] pyridine (PhIP) in mice humanized for CYP1A1 and CYP1A2\[J\]. Chem Res Toxicol, 2005, 18(9): 1471-1478.
\[5\] 洪孝庄, 孙曼霁. 蛋白质连接技术\[M\]. 北京: 中国医药科技出版社, 1993: 65-86
\[6\] 宋淑霞, 李妙颖, 侯志宏, 等. 抗人c2erbB2单克隆抗体的制备及其特异性鉴定\[J\]. 细胞与分子免疫学杂志, 2005, 21(3): 319-321.
\[7\] 刘松岩, 林世和, 刘淑玲, 等. 人类PrP合成肽抗原构建及应用\[J\]. 中国人兽共患病杂志, 2000, 16(4): 15-17.
作者简介: 武正华(1981-), 女, 山西文水人, 硕士生 Tel: 045186699384; Email: wuzhenghua_81@yahoo.com.cn
哈尔滨医科大学: 1药学院生物制药教研室; 2附属二院药学部; 3黑龙江省生物医药工程重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地, 黑龙江 哈尔滨 150086, http://www.100md.com(武正华1, 唐晓波1, 王志刚1, 纪宏宇2, 赵振营1, 朱大岭1, 2, 3)
\[关键词\]CYP1A2; 合成肽; 抗体; 小鼠
CYP1A2和CYP1A1是CYP1A亚家族中仅有的两个成员\[1\], 它们在人体中的表达各有其组织特异性, CYP1A2主要在肝脏表达\[2\], 也有在脑组织中检出CYP1A2 mRNA而无蛋白表达的报道\[3\]。由于CYP1A2将某些杂环芳香族前致癌物激活代谢成致癌物, 例如CYP1A2催化的食物烹调过程中产生的2氨基1甲基6苯基亚氨基\[4, 5b\]吡啶的N2羟基化激活反应, 在化学致癌中起着非常重要的作用\[4], 因此, 研制CYP1A2抗体将对CYP1A2功能的研究以及抗癌药的研制、 开发具有重要的理论意义和临床价值。本研究中研制小鼠抗CYP1A2的抗体并进行了部分特性鉴定, 为后续的研究工作奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料 福氏佐剂及3,3,5,5四甲基联苯胺(TMB)均购自Sigma公司。HRP山羊抗小鼠IgG购自Jackson Immuno Research公司。牛血清白蛋白(BSA)购自Solarbio公司。硝酸纤维素膜购自BIORAD公司。ECL Plus购自Amersham Biosciences公司。其他试剂均为国产分析纯。电动玻璃匀浆机(DY891型)为宁波新芝生物科技股份有限公司产品。酶标仪(MK3)为Thermo公司产品。电泳槽(DYCZ24D型)、 电泳仪(DYY6B型)均为BIORAD公司产品。多肽合成及其与KLH、 BSA的联接由北京中科亚光生物有限公司完成。6周龄BALB/c雌性小鼠, 由哈尔滨医科大学动物中心提供。正常人肝脏组织, 由“人类肝脏蛋白质组计划”项目提供。
1.2 方法
1.2.1 CYP1A2抗原表位的分析 由SWISS PROT网站获知CYP1A2蛋白的序列, 然后利用DNAStar软件分析其序列的特点, 根据对其亲水性(hydrophilicity)、 柔韧性(flexibility)、 抗原性(antigenicity)及表面性(surface property)4个参数预测的结果, 确定351～365位15个氨基酸作为欲合成的多肽序列: GRERRPRLSDRPQLP。
1.2.2 CYP1A2多肽的合成及其与KLH和BSA的交联 CYP1A2多肽由北京中科亚光生物有限公司采用多肽自动合成仪合成; CYP1A2与KLH和BSA的交联采用戊二醛连接法\[5\], 将5 mg合成多肽分别加入7 mg KLH和BSA中, 边振荡边缓慢加入新鲜配制的3 g/L的戊二醛溶液(1 mL), 室温作用2 h。以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜。交联形成CYP1A2KLH、 CYP1A2BSA偶联物。
1.2.3 小鼠抗CYP1A2多肽抗体的制备\[6\] 取0.5 mg多肽KLH偶联物加250 μL的去离子水与等量的完全福氏佐剂充分乳化后, 于小鼠(2只)背部注射两点,每点约20 μg, 剩余的腹腔注射。3周后加强免疫, 剂量同前, 用不完全福氏佐剂充分乳化后, 注射于小鼠腹腔; 以后隔两周加强1次; 从第3次加强免疫开始, 每次免疫后7 d, 经尾静脉采血测定抗体的效价, 符合要求时, 用不加佐剂的多肽KLH腹腔注射再加强免疫1次, 3 d后取血, 分离血清后, 无菌分装保存于-80℃备用。
1.2.4 人肝脏微粒体蛋白制备 取10 g正常人的肝脏、 剪碎, 用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白后, 加入上述磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆。然后将肝匀浆依次于4℃以10000 g 离心30 min, 取上清液, 以30000 g离心60 min, 取上清液及100000 g离心60 min, 取粉红色沉淀后, 悬浮于磷酸钾盐缓冲液(含有200 mL/L甘油, 5 g/L胆酸钠, 2 mg/L抑肽酶, 2 mg/L亮肽素, 1 mg/L胃酶抑素及1 mmol/L苯甲基磺酰氟)中, 用Bradford法进行蛋白定量。分装后, 置于-80℃冰箱内贮存备用。
1.2.5 抗血清的特性鉴定 ①效价测定: 采用间接ELISA法。以1 mg/L多肽BSA偶联物包被酶标板, 依次加入不同浓度的鼠抗血清及1∶3000 HRP山羊抗小鼠IgG, 以TMB显色后, 用酶标仪测定A450值。②特异性鉴定: 采用Western blot分析。用2×SDS上样缓冲液悬浮制备的人肝脏微粒体蛋白、 多肽BSA及BSA, 于95℃加热7 min, 置于冰上冷却10 min。上样量为50 μg, 经SDSPAGE分离后, 以湿转法电转至硝酸纤维素膜上。经脱脂奶粉封闭(室温1 h)后, 依次滴加1∶1000稀释抗血清(4℃过夜, 以1 mL/L Tween20 TBS洗膜3次)及1∶10000 HRP山羊抗小鼠IgG(室温孵育1 h, 以1 mL/L Tween20 TBS洗膜3次)。用化学发光剂试剂盒(ECL Plus)处理5 min后, 于暗室曝光到X胶片上, 显影、 定影。
2 结果
2.1 CYP1A2的氨基酸序列分析 为了提高抗体的特异性, 尽可能地避免制备的抗体与细胞色素P450家族其他同源蛋白之间的交叉反应, 用DNAStar软件对蛋白序列进行分析(图1)。根据亲水性、 柔韧性、 抗原性及表面性4个参数预测的结果进行综合考虑, 选取欲合成的多肽序列为351～365位氨基酸(图中阴影区): GRERRPRLSDRPQLP。
图1 DNAstar软件对人CYP1A2蛋白序列参数的预测 略
2.2 抗血清的特性鉴定 ①效价测定: 间接ELISA法检测表明, 抗血清的效价为1∶16000。②抗体特异性鉴定: 以制备的人肝脏微粒体蛋白、 多肽BSA、 BSA作为抗原, 以小鼠抗血清作为一抗进行Western blot分析显示, 抗血清与人肝脏微粒体蛋白在Mr约为58000处出现1条清晰的带, 与CYP1A2的分子量相符; 与多肽BSA在Mr约为69000处出现1条清晰的带, 与BSA分子量相符; 而与BSA则无条带出现(图2)。说明所制备的抗体可识别含有半抗原的抗原表位的蛋白并能与天然CYP1A2蛋白结合。
图2 抗血清特异性的Western blot分析 略
3 讨论
随着人类基因组计划的完成,蛋白质研究已成为后基因组时代的重要任务。抗体是研究蛋白质的必不可少的工具之一, 在一种新的cDNA被克隆后, 根据推导出的氨基酸序列人工合成多肽并与载体偶联, 免疫制备其抗体, 是一个快速而有效的手段。抗原表位的选择是制备合成肽的关键。一般认为, 亲水性强和具有稳定构象的线性表位, 对于维持抗原的免疫反应性极其重要\[7\]。我们通过综合分析CYP1A2的亲水性、 柔韧性、 抗原性及表面性4个参数预测的结果, 最终确定以亲水性强、 抗原指数高、 表面性及柔韧性好的区域(即351～365位15个氨基酸)作为CYP1A2的抗原决定簇。但有些亲水肽段形成的抗原决定簇在变性条件下可受到破坏, 其抗体因而不能用于Western blot分析, 需要对抗体进行全面鉴定。鉴于KLH具有较强的免疫原性, 因而将合成肽与KLH的偶联作为抗原制备抗CYP1A2的抗体。虽然合成肽与载体蛋白偶联可增加免疫原性, 但也会产生一定的抗KLH抗体。所以, 在间接ELISA法中包被抗原用多肽BSA而不是多肽KLH, 以避免KLH的干扰。同样原因, 在Western blot实验中, 用多肽BSA作抗原, 这样在Mr约为69000处出现1条清晰的条带(与BSA的Mr相符合), 而以BSA作为抗原则无条带出现, 说明该抗血清可与CYP1A2合成肽特异性结合。用人肝微粒体蛋白作为抗原, 在Mr约为58000处可出现1条清晰的条带(与CYP1A2的Mr相符合), 说明该抗血清可与天然的CYP1A2结合, 而与其他细胞色素P450无交叉反应, 该抗血清虽未经纯化已显示出具有高度的特异性。诚然, 制备抗血清一般都免疫兔, 本实验中免疫小鼠制备抗血清的原因是小鼠所需抗原量较少。我们用少量抗原进行试验, 证明所设计和合成的多肽是成功的, 正在免疫兔大量制备抗血清以满足后续研究应用。
参考文献:
\[1\] Nebert DW, Jaiswal AK, Meyer UA, et al. Human P450 genes: evolution, regulation and possible role in carcinogenesis\[J\]. Biochem Soc Trans, 1987, 15(4): 586-589.
\[2\] Pelkonen O, Maenpaa J, Taavitsainen P, et al. Inhibition and induction of human cytochrome P450 (CYP) enzymes\[J\]. Xenobiotica, 1998, 28(12): 1203-1253.
\[3\] Farin FM, Omiecinski CJ. Regiospecific expression of cytochrome P450s and microsomal epoxide hydrolase in human brain tissue\[J\]. J Toxicol Envi ron Health, 1993, 40(223): 317-335.
\[4\] Cheung C, Ma X, Krausz KW, et al. Differential metabolism of 2amino1methyl6phenylimidazo\[4, 5b\] pyridine (PhIP) in mice humanized for CYP1A1 and CYP1A2\[J\]. Chem Res Toxicol, 2005, 18(9): 1471-1478.
\[5\] 洪孝庄, 孙曼霁. 蛋白质连接技术\[M\]. 北京: 中国医药科技出版社, 1993: 65-86
\[6\] 宋淑霞, 李妙颖, 侯志宏, 等. 抗人c2erbB2单克隆抗体的制备及其特异性鉴定\[J\]. 细胞与分子免疫学杂志, 2005, 21(3): 319-321.
\[7\] 刘松岩, 林世和, 刘淑玲, 等. 人类PrP合成肽抗原构建及应用\[J\]. 中国人兽共患病杂志, 2000, 16(4): 15-17.
作者简介: 武正华(1981-), 女, 山西文水人, 硕士生 Tel: 045186699384; Email: wuzhenghua_81@yahoo.com.cn
哈尔滨医科大学: 1药学院生物制药教研室; 2附属二院药学部; 3黑龙江省生物医药工程重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地, 黑龙江 哈尔滨 150086, http://www.100md.com(武正华1, 唐晓波1, 王志刚1, 纪宏宇2, 赵振营1, 朱大岭1, 2, 3)