表皮生长因子受体蛋白质酪氨基酸激酶；

人表皮生长因子受体胞内酪氨酸激酶结构域原核表达

http://www.100md.com 《福建医科大学学报》 2006年第3期

表皮生长因子受体蛋白质酪氨基酸激酶；,基因表达；,原核细胞；,谷胱甘肽转移酶；,质粒；,大肠杆菌,,表皮生长因子受体蛋白质酪氨基酸激酶；,基因表达；,原核细胞；,谷胱甘肽转移酶；,质粒；,大肠杆菌,1材料与方法,2结果,3讨论,参考文献：

     摘要: 目的研究人表皮生长因子受体(EGFR)胞内酪氨酸激酶结构域的原核表达及纯化条件。方法构建原核表达人EGFR胞内酪氨酸激酶结构域的重组质粒pGEX/GSTEGFRTKD，在大肠杆菌中表达目的融合蛋白，通过在尿素中变性、在梯度尿素中透析复性，经GST融合蛋白纯化，肠激酶去除GST“标签”后获得人EGFR胞内酪氨酸激酶结构域蛋白。结果限制酶切分析和测序表明成功构建重组质粒pGEX/GSTEGFRTKD；SDSPAGE分析表明，异丙基硫代βD半乳糖苷诱导下可以表达融合蛋白GSTEGFRTKD，但以不溶性包涵体的形式存在。经尿素变性、梯度透析复性及去除GST“标签”后，获得重折叠的人EGFR胞内酪氨酸激酶结构域蛋白。结论在大肠杆菌中可成功表达人EGFR胞内酪氨酸激酶结构域蛋白。

    关键词: 表皮生长因子受体蛋白质酪氨基酸激酶；基因表达；原核细胞；谷胱甘肽转移酶；质粒；大肠杆菌

    表皮生长因子受体(EGFR)是目前抗肿瘤治疗的新靶点[12]。研究发现，EGFR在头颈肿瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌等实体肿瘤中有较高的表达[3]。EGFR结构包括一个胞外配体结合区域，一个跨膜区域和胞内酪氨酸激酶结构域(TKD)和羧基末端结构域，当配体如表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGFα)与EGFR胞外区域结合，可导致TKD活化，从而形成信号级联放大，产生不同的作用，包括细胞成熟、分化、转移及血管形成等[45]。

    由于EGFR在恶性肿瘤中常被过度表达，所以阻断其信号转导可抑制肿瘤生长[56]。目前，以EGFR家族TKD为靶点的抗肿瘤治疗已成为癌症研究的热点并且在多种肿瘤治疗中取得令人鼓舞的效果[78]。EGFRTKD是开发EGFR靶向抗肿瘤药物的重要蛋白，因而表达纯化该蛋白具有重要现实意义。笔者在构建EGFRTKD原核表达载体的基础上对其表达、纯化及复性作了进一步研究。

     1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌种与载体E.coli Top10感受态细胞和E.coli Bl21感受态细胞(伦敦大学国王学院头颈肿瘤研究室保存)。重组质粒pEFBOS/GSTEGFRTKD(以色列Weizmann科学研究所生物调控系Ami博士提供)；原核表达载体pGEX5x1(英国Amersham)。

    1.1.2 工具酶及制剂工具酶及DNA Marker(美国New England Biolabs)；溶菌酶、氨苄青霉素、谷胱甘肽琼脂糖珠(美国Sigma)；DNA凝胶回收试剂盒(荷兰QIAGEN)；SlideALyzer透析盒(美国Pierce)；肠激酶(美国Invitrogen)；异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG ......

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