牛血清白蛋白在超薄纳米二氧化钛膜表面的印迹与吸附
摘要 基于溶胶凝胶分子印迹方法，以溶胶二氧化钛TiO2为基质印迹了牛血清白蛋白分子。用1%的NaOH溶液可有效地除去纳米TiO2印迹膜中的模板分子。采用石英晶体微天平现场技术，研究了牛血清白蛋白在超薄纳米TiO2膜表面的吸附行为。研究表明，牛血清白蛋白在印迹膜和非印迹膜上的吸附量都随溶液浓度增加而增大，印迹膜具有吸附的特异性和可再生性，其吸附量是非印迹膜的3~5倍；在非印迹膜上的吸附符合Langmuir吸附模型，而在印迹膜上的吸附符合allosteric吸附模型；牛血清白蛋白在非印迹膜上的吸附量先随pH升高而增大，当pH 为5左右时达到最大值，随后吸附量又随pH的增大而减小；而在印迹膜上其吸附量仅随pH增大而增大。
关键词 牛血清白蛋白，分子印迹，石英晶体微天平，纳米二氧化钛
1 引言
分子印迹聚合物技术是指制备对某一特定分子(模板分子或印迹分子)具有选择性识别能力聚合物的技术，已应用于色谱分离、模拟酶催化以及生物传感器等领域[1~3]。采用高分子聚合物通常只能印记一些构象简单的小分子[4,5]，而对水溶性生物大分子如蛋白质、核酸等因为体积庞大、结构复杂、难以洗脱等因素，难以采用该方法对其进行分子印迹[6]。文献[7]报道了一种溶胶凝胶分子印迹技术，它是利用溶胶凝胶过程把模板分子引入到无机物网络结构中，形成一种刚性材料，可以克服有机聚合物的刚性和惰性差的缺点，成为分子印迹一个重要的研究方向。溶胶凝胶技术可制备超薄纳米膜，使得识别位点处在颗粒的表面，提高了模板分子和膜之间的结合效率[8]。采用溶胶凝胶分子印迹技术，Lee 等在TiO2表面印迹了几种羧酸，实验表明无机纳米材料是一种很好的分子印迹材料，具有比表面积大和良好的机械稳定性和热稳定性等优点[9,10]。本实验利用该技术在石英晶体微天平表面制备了牛血清白蛋白分子印迹的超薄纳米TiO2膜，研究了牛血清白蛋白在印迹膜与非印迹膜表面的吸附行为及影响因素。
2 实验部分
2.1 试剂与仪器牛血清白蛋白(BSA，美国Sigma公司)；锐钛矿型纳米TiO2溶胶(粒径5 nm，广州门德纳米科技有限公司)；其余试剂均为分析纯，实验用水为高纯水，用 0.01 mol/L 的NaOH和稀释了的HCl调节pH值。 石英晶体微天平(QCM，自制)；Protek C3100可编程通用计数器(韩国兴仓Protek)。
2.2 纳米TiO2膜的制备石英晶体两侧各有一 5 mm的银电极，用0.1 mol/L的NaOH溶液处理20 min，用水清洗数次。在100 μL 0.5%纳米TiO2溶胶中加入10 μL 500 mg/L的模板分子牛血清白蛋白，搅拌均匀后在冰箱中(4℃)存放12 h，用旋转涂膜法制备纳米TiO2印迹膜，再将印迹膜加热韧化，使作用位点发生重排以利于印迹分子的结合。用1%的NaOH溶液浸泡除去纳米TiO2印迹膜中的模板分子。同样用没有添加模板分子的纳米TiO2溶胶制备纳米TiO2非印迹膜。制得的纳米TiO2膜在300℃下烘烤1 h以增加膜的稳定性。
2.3 石英晶体微天平(QCM)测定BSA在TiO2膜上的吸附量用硅橡胶将石英晶体的一面封好使之只与空气接触，涂有膜的一面与待测液接触。用导线将电极连接在ICTTL振荡器上，检测器和振荡器放在金属盒中以避免周围电磁噪声。检测前，将制得的TiO2膜用UV光照射20 min后，再用水洗涤数次以除去表面吸附的杂质。室温下将0.01 mol/L的磷酸缓冲溶液加入到检测池中，待频率稳定后于检测池中注入一定体积的BSA溶液(溶于相同的pH的磷酸缓冲溶液)。可编程通用计数器Proteck C3100监测频率，记录的数据存于计算机中。基于Sauerbrey方程[11]，根据吸附前后QCM的频率变化值计算BSA在TiO2膜上的吸附量。
3 结果与讨论
3.1 BSA溶液在不同TiO2膜上的吸附图1为1500 mg/L 的BSA溶液(pH=6.1)在Ag电极、TiO2非印迹和印迹膜表面的吸附行为。从图1可以看出，BSA在Ag电极、TiO2非印迹和印迹膜表面吸附导致QCM频率下降，分别为36、110和540 Hz；吸附平衡时间分别为4、5和2 min。BSA单肽链34位含有一个巯基，其余为二硫键，其氨基酸残基卷曲回折成球状分子(4 nm×14 nm)[12]。SH键和SS键的存在使得BSA分子和Ag电极形成SAg键，使其在Ag电极上有一定的吸附(图1曲线a)。BSA在非印迹膜上的吸附为一个缓慢的非特异性物理吸附过程，吸附量约为18.3 mg/g；由于印迹的纳米TiO2表面对模板分子的形状有着预期的记忆能力，BSA中的氨基酸残基中含有羧基和氨基，它们能与TiO2表面的羟基作用形成氢键构成印迹位点。该印迹位点与BSA空间形状相互对应。因此，在BSA吸附过程中，除了发生非特异性物理吸附之外还存在特异性吸附，表现出较大的吸附量和较快的吸附过程(印迹膜上吸附量为90 mg/g，大约是非印迹膜的5倍)。不同浓度的BSA溶液(pH=6.1)在TiO2印迹和非印迹膜表面的吸附QCM响应值见图2。从图2可以看出，BSA溶液在TiO2印迹和非印迹膜表面吸附频率下降值都随溶液浓度增大而增大。
图1 BSA溶液在TiO2膜的吸附(略)
Fig.1 Adsorption of BSA on TiO2 film
a. BSA/银电极(Ag electrode)；b. BSA/非印迹膜(nonimprinted film)； c. BSA /印迹膜(imprinted film)。
图2 浓度对吸附的影响(略)
Fig. 2 Effect of concentration on adsorption
a. 印迹膜(imprinted film)；b. 非印迹膜(nonimprinted film)。
Langmuir 吸附模型可以用来描述物质在固体膜表面的吸附[13]。其需满足单层膜吸附，主体客体分子结合点一一对应，客体间的作用力可以忽略且反应可逆。将实验数据进行拟合得出BSA在TiO2非印迹膜上的吸附符合Langmuir模型，在TiO2印迹膜上的吸附不符合Langmuir模型，所以用类似与Langmuir模型的Allosteric 模型[14]对其在印迹膜上的吸附进行拟合。拟合值与实验值符合较好，这表明BSA在纳米TiO2印迹膜上的吸附符合Alloseric吸附模型即不是简单的单层膜吸附，且不存在一一对应吸附作用点。通过Alloseric吸附模型计算得到BSA溶液在纳米TiO2膜上的吸附动力学参数见表1。从表1可以看出，BSA在印迹膜上的饱和吸附量大约是非印迹膜上的5倍，分别为110和21 mg/g，吸附动力学常数分别为3.9×105和2.6×102 mg/L。BSA在印迹膜上的吸附指数为2，在非印迹膜上的吸附指数为1，表明其在印迹膜上的吸附不符合Langmuir吸附模型，即不是单层膜吸附，在非印迹膜上的吸附符合Langmuir吸附模型。所以分别用q=110C2/(3.9×105+C2) (q为吸附量(mg/g)；C为溶液浓度(mg/L)；r2=0.982)和q=21C/(260+C) (r2=0.978)来表示BSA在纳米印迹膜和非印迹膜上的等温吸附线。
表1 BSA在纳米TiO2膜上的吸附动力学参数(略)
Table 1 Adsorption kinetic parameters of BSA on TiO2 film
3.2 溶液pH对BSA吸附量的影响图3为不同pH的BSA溶液在纳米TiO2印迹膜和非印迹膜上的吸附曲线。如图3a所示，对于非印迹膜，BSA与纳米TiO2表面的氢键作用力很弱，吸附主要依靠分子间的静电作用力。BSA分子中存在羧基和氨基，TiO2表面存在羟基，在酸性较低的介质中，BSA中的羧基不发生电离，而氨基则以NH+3形式存在，TiO2表面的羟基则以OH+2形式存在，静电斥力使得吸附量较小；当pH值升高处于两种物质的等电点之间时(TiO2：pKPZC＝6.2，BSA：pKPZC＝4.7[15])，静电引力使得吸附量出现最大值；超过最佳pH时，TiO2表面的羟基发生去质子化作用使得表面带负电荷又产生静电斥力导致吸附量降低。BSA在印迹膜表面的吸附除了存在静电吸附之外，还存在氢键作用力和特异性的分子形状互补作用。通过印迹，提高了BSA和TiO2膜之间的结合识别点。大量氢键的存在可以形成很强的分子间作用力，使得静电作用力对吸附影响不明显，又随pH升高蛋白质的分子内氢键被破坏，导致更多的羧基、氨基和TiO2膜形成氢键，所以BSA在印迹膜表面的吸附量随溶液pH升高而增大(见图3b)。
图3 pH值对吸附的影响(略)
Fig.3 Effect of pH values on adsorption amount
a. 非印迹膜(nonimprinted film); b. 印迹膜(imprinted film)。
3.3 纳米 TiO2印迹膜的吸附特异性为了考察纳米TiO2印迹膜吸附BSA的特异性，比较了胆红素、尿素酶和BSA溶液在纳米TiO2膜上的吸附。
表2 胆红素、尿素酶和BSA在纳米TiO2膜上的吸附(略)
Table 2 Adsorption of bilirubin, urease and BSA on TiO2 films
注(note)：CBilirubin=Curease=CBSA=1500 mg/L； pH=6.1.
从表2可以看出，胆红素、尿素酶及BSA在纳米TiO2非印迹膜上都有吸附，吸附量分别为20、21.7及18.2 mg/g, 在BSA印迹的TiO2膜上，胆红素和尿素酶的吸附量分别为16.7和19.7 mg/g, 即比在非印迹膜上的吸附量降低了。胆红素的分子量与分子尺寸小于BSA，可以进入到由模板分子BSA产生的空穴中，但不能导致吸附量增加，即在印迹位点不能产生特异性吸附。而BSA的吸附量为90.0 mg/g, 增大了约5倍，表明印迹膜对BSA具有特异性吸附。本研究为后续设计分子印迹纳米膜分离提纯蛋白质奠定了基础，分子印迹制得的膜材料在空间结构上与目标分子具有互补的结构，即具备记忆功能，可以选择性地分离混合物中的印迹分子，从而实现分离纯化的目的[16]。
3.4 纳米TiO2膜的再生性膜的再生性是印迹膜性能的一项重要指标，将制备的纳米TiO2印迹膜反复用于吸附实验，即将吸附了BSA溶液(pH=6.1, CBSA=1500 mg/L)的印迹膜用1%的NaOH溶液洗涤直到频率回到原来的位置，再用于吸附BSA溶液。超薄纳米TiO2膜的稳定性较好，重复使用10次后对BSA的吸附量只降了5%。结果表明BSA在纳米TiO2膜上印记产生的特异识别点稳定性好。
References
1 Ramstrom O, Ansell R J. Chirality, 1998, 10: 195~209
2 Haupt K, Mosbach K. Chem. Rev., 2000, 100: 2495~2504
3 Whitcombe M J, Vulfson E N. Adv. Mater., 2001, 13(7): 467~478
4 Zhang L Y, Cheng G X , Fu C. React. Funct. Polym., 2003, 56: 167~173
5 Say R, Birlik E, Ersoz A, Yilmaz F, Gedikbey T, Denizli A. Anal. Chim. Acta, 2003, 480: 251~258
6 Bossi A, Piletsky S A, Piletska E V. Anal. Chem., 2001, 73: 5281~5286
7 Lu Y K, Yan X P. Anal. Chem., 2004, 76: 453~457
8 Kunitake T, Lee S W. Anal. Chim. Acta, 2004, 504: 1~6
9 Lee S W, Yang D H, Kunitake T. Sensors and Actuators B, 2005, 104: 35~42
10 Lahav M, Kharitonow A B, Katz O. Anal. Chim. Acta, 2001, 73: 720~723
11 Sauerbrey G Z. Phys., 1959, 155: 206~222
12 Jr Peter T. Adv. Protein Chem., 1985, 37: 161~245
13 Cao Jianglin(曹江林)， Leng Wenhua(冷文华)， Zhang Jianqing(张鉴清)， Cao Chunan(曹楚南). Acta PhysicoChimica Sinica(物理化学学报), 2004, 20(7): 765~739
14 Syu M J , Nian U M. Anal.Chem., 2005, 539: 97~106
15 Glacomelli C E, Avena M J, de Pauli C P. Journal of Colloid and Interface Science, 1996, 188: 387~395
16 Guo Tianying(郭天瑛), Xia Yongqing(夏永清)， Hao Guangjie(郝广杰)， Zhang Banghua(张邦华). Chemical Industry and Engineering Progess(化工进展), 2003, 22 (7): 713~716
本文系国家自然科学基金资助项目(No.20475065)
(中南大学化学化工学院，长沙 410083), 百拇医药(谢亚林 司士辉 杨政鹏 李赛 彭芳)
关键词 牛血清白蛋白，分子印迹，石英晶体微天平，纳米二氧化钛
1 引言
分子印迹聚合物技术是指制备对某一特定分子(模板分子或印迹分子)具有选择性识别能力聚合物的技术，已应用于色谱分离、模拟酶催化以及生物传感器等领域[1~3]。采用高分子聚合物通常只能印记一些构象简单的小分子[4,5]，而对水溶性生物大分子如蛋白质、核酸等因为体积庞大、结构复杂、难以洗脱等因素，难以采用该方法对其进行分子印迹[6]。文献[7]报道了一种溶胶凝胶分子印迹技术，它是利用溶胶凝胶过程把模板分子引入到无机物网络结构中，形成一种刚性材料，可以克服有机聚合物的刚性和惰性差的缺点，成为分子印迹一个重要的研究方向。溶胶凝胶技术可制备超薄纳米膜，使得识别位点处在颗粒的表面，提高了模板分子和膜之间的结合效率[8]。采用溶胶凝胶分子印迹技术，Lee 等在TiO2表面印迹了几种羧酸，实验表明无机纳米材料是一种很好的分子印迹材料，具有比表面积大和良好的机械稳定性和热稳定性等优点[9,10]。本实验利用该技术在石英晶体微天平表面制备了牛血清白蛋白分子印迹的超薄纳米TiO2膜，研究了牛血清白蛋白在印迹膜与非印迹膜表面的吸附行为及影响因素。
2 实验部分
2.1 试剂与仪器牛血清白蛋白(BSA，美国Sigma公司)；锐钛矿型纳米TiO2溶胶(粒径5 nm，广州门德纳米科技有限公司)；其余试剂均为分析纯，实验用水为高纯水，用 0.01 mol/L 的NaOH和稀释了的HCl调节pH值。 石英晶体微天平(QCM，自制)；Protek C3100可编程通用计数器(韩国兴仓Protek)。
2.2 纳米TiO2膜的制备石英晶体两侧各有一 5 mm的银电极，用0.1 mol/L的NaOH溶液处理20 min，用水清洗数次。在100 μL 0.5%纳米TiO2溶胶中加入10 μL 500 mg/L的模板分子牛血清白蛋白，搅拌均匀后在冰箱中(4℃)存放12 h，用旋转涂膜法制备纳米TiO2印迹膜，再将印迹膜加热韧化，使作用位点发生重排以利于印迹分子的结合。用1%的NaOH溶液浸泡除去纳米TiO2印迹膜中的模板分子。同样用没有添加模板分子的纳米TiO2溶胶制备纳米TiO2非印迹膜。制得的纳米TiO2膜在300℃下烘烤1 h以增加膜的稳定性。
2.3 石英晶体微天平(QCM)测定BSA在TiO2膜上的吸附量用硅橡胶将石英晶体的一面封好使之只与空气接触，涂有膜的一面与待测液接触。用导线将电极连接在ICTTL振荡器上，检测器和振荡器放在金属盒中以避免周围电磁噪声。检测前，将制得的TiO2膜用UV光照射20 min后，再用水洗涤数次以除去表面吸附的杂质。室温下将0.01 mol/L的磷酸缓冲溶液加入到检测池中，待频率稳定后于检测池中注入一定体积的BSA溶液(溶于相同的pH的磷酸缓冲溶液)。可编程通用计数器Proteck C3100监测频率，记录的数据存于计算机中。基于Sauerbrey方程[11]，根据吸附前后QCM的频率变化值计算BSA在TiO2膜上的吸附量。
3 结果与讨论
3.1 BSA溶液在不同TiO2膜上的吸附图1为1500 mg/L 的BSA溶液(pH=6.1)在Ag电极、TiO2非印迹和印迹膜表面的吸附行为。从图1可以看出，BSA在Ag电极、TiO2非印迹和印迹膜表面吸附导致QCM频率下降，分别为36、110和540 Hz；吸附平衡时间分别为4、5和2 min。BSA单肽链34位含有一个巯基，其余为二硫键，其氨基酸残基卷曲回折成球状分子(4 nm×14 nm)[12]。SH键和SS键的存在使得BSA分子和Ag电极形成SAg键，使其在Ag电极上有一定的吸附(图1曲线a)。BSA在非印迹膜上的吸附为一个缓慢的非特异性物理吸附过程，吸附量约为18.3 mg/g；由于印迹的纳米TiO2表面对模板分子的形状有着预期的记忆能力，BSA中的氨基酸残基中含有羧基和氨基，它们能与TiO2表面的羟基作用形成氢键构成印迹位点。该印迹位点与BSA空间形状相互对应。因此，在BSA吸附过程中，除了发生非特异性物理吸附之外还存在特异性吸附，表现出较大的吸附量和较快的吸附过程(印迹膜上吸附量为90 mg/g，大约是非印迹膜的5倍)。不同浓度的BSA溶液(pH=6.1)在TiO2印迹和非印迹膜表面的吸附QCM响应值见图2。从图2可以看出，BSA溶液在TiO2印迹和非印迹膜表面吸附频率下降值都随溶液浓度增大而增大。
图1 BSA溶液在TiO2膜的吸附(略)
Fig.1 Adsorption of BSA on TiO2 film
a. BSA/银电极(Ag electrode)；b. BSA/非印迹膜(nonimprinted film)； c. BSA /印迹膜(imprinted film)。
图2 浓度对吸附的影响(略)
Fig. 2 Effect of concentration on adsorption
a. 印迹膜(imprinted film)；b. 非印迹膜(nonimprinted film)。
Langmuir 吸附模型可以用来描述物质在固体膜表面的吸附[13]。其需满足单层膜吸附，主体客体分子结合点一一对应，客体间的作用力可以忽略且反应可逆。将实验数据进行拟合得出BSA在TiO2非印迹膜上的吸附符合Langmuir模型，在TiO2印迹膜上的吸附不符合Langmuir模型，所以用类似与Langmuir模型的Allosteric 模型[14]对其在印迹膜上的吸附进行拟合。拟合值与实验值符合较好，这表明BSA在纳米TiO2印迹膜上的吸附符合Alloseric吸附模型即不是简单的单层膜吸附，且不存在一一对应吸附作用点。通过Alloseric吸附模型计算得到BSA溶液在纳米TiO2膜上的吸附动力学参数见表1。从表1可以看出，BSA在印迹膜上的饱和吸附量大约是非印迹膜上的5倍，分别为110和21 mg/g，吸附动力学常数分别为3.9×105和2.6×102 mg/L。BSA在印迹膜上的吸附指数为2，在非印迹膜上的吸附指数为1，表明其在印迹膜上的吸附不符合Langmuir吸附模型，即不是单层膜吸附，在非印迹膜上的吸附符合Langmuir吸附模型。所以分别用q=110C2/(3.9×105+C2) (q为吸附量(mg/g)；C为溶液浓度(mg/L)；r2=0.982)和q=21C/(260+C) (r2=0.978)来表示BSA在纳米印迹膜和非印迹膜上的等温吸附线。
表1 BSA在纳米TiO2膜上的吸附动力学参数(略)
Table 1 Adsorption kinetic parameters of BSA on TiO2 film
3.2 溶液pH对BSA吸附量的影响图3为不同pH的BSA溶液在纳米TiO2印迹膜和非印迹膜上的吸附曲线。如图3a所示，对于非印迹膜，BSA与纳米TiO2表面的氢键作用力很弱，吸附主要依靠分子间的静电作用力。BSA分子中存在羧基和氨基，TiO2表面存在羟基，在酸性较低的介质中，BSA中的羧基不发生电离，而氨基则以NH+3形式存在，TiO2表面的羟基则以OH+2形式存在，静电斥力使得吸附量较小；当pH值升高处于两种物质的等电点之间时(TiO2：pKPZC＝6.2，BSA：pKPZC＝4.7[15])，静电引力使得吸附量出现最大值；超过最佳pH时，TiO2表面的羟基发生去质子化作用使得表面带负电荷又产生静电斥力导致吸附量降低。BSA在印迹膜表面的吸附除了存在静电吸附之外，还存在氢键作用力和特异性的分子形状互补作用。通过印迹，提高了BSA和TiO2膜之间的结合识别点。大量氢键的存在可以形成很强的分子间作用力，使得静电作用力对吸附影响不明显，又随pH升高蛋白质的分子内氢键被破坏，导致更多的羧基、氨基和TiO2膜形成氢键，所以BSA在印迹膜表面的吸附量随溶液pH升高而增大(见图3b)。
图3 pH值对吸附的影响(略)
Fig.3 Effect of pH values on adsorption amount
a. 非印迹膜(nonimprinted film); b. 印迹膜(imprinted film)。
3.3 纳米 TiO2印迹膜的吸附特异性为了考察纳米TiO2印迹膜吸附BSA的特异性，比较了胆红素、尿素酶和BSA溶液在纳米TiO2膜上的吸附。
表2 胆红素、尿素酶和BSA在纳米TiO2膜上的吸附(略)
Table 2 Adsorption of bilirubin, urease and BSA on TiO2 films
注(note)：CBilirubin=Curease=CBSA=1500 mg/L； pH=6.1.
从表2可以看出，胆红素、尿素酶及BSA在纳米TiO2非印迹膜上都有吸附，吸附量分别为20、21.7及18.2 mg/g, 在BSA印迹的TiO2膜上，胆红素和尿素酶的吸附量分别为16.7和19.7 mg/g, 即比在非印迹膜上的吸附量降低了。胆红素的分子量与分子尺寸小于BSA，可以进入到由模板分子BSA产生的空穴中，但不能导致吸附量增加，即在印迹位点不能产生特异性吸附。而BSA的吸附量为90.0 mg/g, 增大了约5倍，表明印迹膜对BSA具有特异性吸附。本研究为后续设计分子印迹纳米膜分离提纯蛋白质奠定了基础，分子印迹制得的膜材料在空间结构上与目标分子具有互补的结构，即具备记忆功能，可以选择性地分离混合物中的印迹分子，从而实现分离纯化的目的[16]。
3.4 纳米TiO2膜的再生性膜的再生性是印迹膜性能的一项重要指标，将制备的纳米TiO2印迹膜反复用于吸附实验，即将吸附了BSA溶液(pH=6.1, CBSA=1500 mg/L)的印迹膜用1%的NaOH溶液洗涤直到频率回到原来的位置，再用于吸附BSA溶液。超薄纳米TiO2膜的稳定性较好，重复使用10次后对BSA的吸附量只降了5%。结果表明BSA在纳米TiO2膜上印记产生的特异识别点稳定性好。
References
1 Ramstrom O, Ansell R J. Chirality, 1998, 10: 195~209
2 Haupt K, Mosbach K. Chem. Rev., 2000, 100: 2495~2504
3 Whitcombe M J, Vulfson E N. Adv. Mater., 2001, 13(7): 467~478
4 Zhang L Y, Cheng G X , Fu C. React. Funct. Polym., 2003, 56: 167~173
5 Say R, Birlik E, Ersoz A, Yilmaz F, Gedikbey T, Denizli A. Anal. Chim. Acta, 2003, 480: 251~258
6 Bossi A, Piletsky S A, Piletska E V. Anal. Chem., 2001, 73: 5281~5286
7 Lu Y K, Yan X P. Anal. Chem., 2004, 76: 453~457
8 Kunitake T, Lee S W. Anal. Chim. Acta, 2004, 504: 1~6
9 Lee S W, Yang D H, Kunitake T. Sensors and Actuators B, 2005, 104: 35~42
10 Lahav M, Kharitonow A B, Katz O. Anal. Chim. Acta, 2001, 73: 720~723
11 Sauerbrey G Z. Phys., 1959, 155: 206~222
12 Jr Peter T. Adv. Protein Chem., 1985, 37: 161~245
13 Cao Jianglin(曹江林)， Leng Wenhua(冷文华)， Zhang Jianqing(张鉴清)， Cao Chunan(曹楚南). Acta PhysicoChimica Sinica(物理化学学报), 2004, 20(7): 765~739
14 Syu M J , Nian U M. Anal.Chem., 2005, 539: 97~106
15 Glacomelli C E, Avena M J, de Pauli C P. Journal of Colloid and Interface Science, 1996, 188: 387~395
16 Guo Tianying(郭天瑛), Xia Yongqing(夏永清)， Hao Guangjie(郝广杰)， Zhang Banghua(张邦华). Chemical Industry and Engineering Progess(化工进展), 2003, 22 (7): 713~716
本文系国家自然科学基金资助项目(No.20475065)
(中南大学化学化工学院，长沙 410083), 百拇医药(谢亚林 司士辉 杨政鹏 李赛 彭芳)