神经酰胺类;_基因_bcl2;_Caspase3;

低表达bcl2对神经酰胺诱导肝癌细胞凋亡的影响

http://www.100md.com 《福建医科大学学报》 2006年第2期

     摘要: 目的观察无血清条件下bcl2对神经酰胺诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的影响。方法通过脂质体介导的基因转染,建立稳定转染表达反义bcl2 mRNA的cDNA片段的真核表达质粒的人肝癌细胞HepG2(HepG2antibcl2)并鉴定,采用AOEB荧光染色、流式细胞术DNA倍体分析和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,分光光度法测定Caspase3活性。结果终浓度50 μmol/L C2神经酰胺作用24 h,可诱导无血清培养的HepG2细胞、HepG2vector细胞及HepG2antibcl2细胞发生凋亡。AOEB染色可见典型的细胞凋亡表现。流式细胞仪检测显示C2神经酰胺作用12,18,24 h,HepG2antibcl2细胞凋亡率较同时间HepG2细胞及HepG2vector细胞凋亡率显著增加(P<005)。终浓度50 μmol/L C2神经酰胺作用12 h,HepG2antibcl2细胞DNA凝胶电泳呈现梯状条带,而HepG2 细胞及HepG2vector细胞作用24 h出现DNA梯状条带。HepG2细胞和HepG2vector细胞Caspase3活性随C2神经酰胺(50 μmol/L)作用时间延长而增强,HepG2antibcl2细胞Caspase3活性始终维持较高水平。结论低表达bcl2可通过增加Caspase3活性从而促进C2神经酰胺诱导的HepG2细胞凋亡。

    关键词: 神经酰胺类; 基因,bcl2; Caspase3; 癌,肝细胞; 肿瘤细胞,培养的; 细胞凋亡(脱噬作用)

    神经酰胺是神经鞘磷脂信号途径的重要第二信使,可介导细胞凋亡等多种生物学效应,诱导凋亡的机制主要与JNK途径和Caspase途径有关[1]。本实验室已证实C2神经酰胺可诱导肝癌细胞凋亡,但诱导凋亡的机制尚未明确[2]。Bcl2家族是凋亡调控机制中有重要作用的一类蛋白家族,bcl2基因的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一。bcl2在肝癌组织及体外培养的肝癌细胞株中的表达存在差异[3]。为探讨bcl2在神经酰胺诱导肝癌细胞凋亡中的生物学作用,笔者通过脂质体介导的基因转染,建立低表达bcl2的人肝癌细胞HepG2,观察bcl2对外源性C2神经酰胺诱导HepG2细胞凋亡的影响,为研究神经酰胺信号途径在肝癌细胞凋亡中的作用提供实验依据。

     1 材料和方法

    11 载体和试剂携带表达反义bcl2 mRNA的cDNA片段的真核表达质粒pcDNA31由英国威尔士大学Lin Fenqiang博士惠赠。C2神经酰胺(美国Sigma公司)用无水乙醇配制成50 mmol/L储备液,-20 ℃保存。给药时无水乙醇在细胞培养液中终体积分数≤01%。吖啶橙(AO),溴化乙啶(EB),碘化丙啶(PI),购自美国Sigma公司。DMEM(美国GIBCO公司),新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),胰蛋白酶、RNase A、蛋白酶K(上海生工生物工程技术服务有限公司)。脂质体(Lipofectamine 2000,美国Invitrogen公司),潮霉素B(Hygromycin B,瑞士Roche公司)。抗bcl2单克隆抗体(美国Santa Cruz公司),兔抗小鼠IgGHRP、化学发光试剂(北京中山生物公司),Caspase3活性测定试剂盒(美国Biovision公司),考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

    12 细胞株人肝癌细胞HepG2细胞引自上海生命科学院细胞库。用含10%新生牛血清的DMEM进行常规贴壁培养。取对数生长期细胞,按照脂质体转染试剂盒说明书进行基因转染。分别转染表达反义bcl2 mRNA的cDNA片段的真核表达质粒pcDNA31antibcl2和pcDNA31空载质粒,转染48 h后将细胞传代于含有潮霉素B(终质量浓度200 μg/mL)的选择性培养液中培养至出现抗性克隆。挑取抗性细胞克隆接种于含10%新生牛血清的DMEM培养液,用终质量浓度100 μg/mL潮霉素B维持,建立稳定转染pcDNA31antibcl2和pcDNA31的人肝癌细胞株HepG2antibcl2及HepG2vector。

    13 C2神经酰胺诱导HepG2细胞凋亡细胞用含10%新生牛血清的DMEM培养液(转染后的细胞DMEM培养液含有终质量浓度100 μg/mL潮霉素B),在37 ℃、体积分数为005的CO2条件下培养,待细胞贴壁生长至80%汇合后,换以无血清DMEM培养液培养48 h,然后除对照组，其余各组加入终质量浓度50 μmol/L的C2神经酰胺。

    14 荧光染色、流式细胞术、DNA提取和琼脂糖凝胶电泳等方法见文献[2]。

    15 bcl2蛋白检测提取细胞总蛋白,蛋白浓度用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒定量。以15% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜上,封闭1 h后加入抗bcl2单克隆抗体,4 ℃孵育过夜后用兔抗小鼠IgGHRP反应2 h,化学发光法显色,X射线底片曝光。同时把βactin作为内参照,并于分子定量成像系统(美国伯乐公司)上采用Molecular Analyst软件进行半定量分析。

    16 Caspase3活性测定按试剂盒说明书操作。细胞裂解液蛋白浓度用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒定量。蛋白每100 μg加入细胞裂解缓冲液50 μL,然后加入2×反应缓冲液50 μL (含10 mmol/L DTT)和40 mmol/L Caspase3底物5 μL(DEVDpNA),37 ℃作用15 h,酶标仪(BioRad 550型,美国伯乐公司)405 nm读取光密度值[D(405 nm)]。

    17 细胞裂解液蛋白定量测定按照考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒说明书操作。

    18 统计学处理数据以x±s表示,组间均数比较采用t检验,结果用SPSS软件分析。

     2 结果

    21 稳定转染pcDNA31antibcl2的人肝癌细胞HepG2的鉴定通过Western blot检测bcl2蛋白表达水平(图1),可见HepG2antibcl2细胞bcl2蛋白的表达水平较HepG2细胞及HepG2vector细胞降低的百分率分别为708%,751%,证实HepG2antibcl2细胞已稳定转染表达反义bcl2 mRNA的cDNA片段,并使bcl2蛋白表达水平降低。

    1:HepG2 ; 2:HepG2vector; 3:HepG2antibcl2

    图1 Western blot检测bcl2 蛋白(略)

    A:对照组; B: C2神经酰胺50 μmol/L作用24 h 1HepG2细胞;2HepG2vector细胞; 3HepG2antibcl2细胞

    图2 荧光显微镜观察C2神经酰胺作用的HepG2细胞形态学改变(AOEB染色 ×400)(略)

    222 DNA倍体分析 C2神经酰胺(50 μmol/L)作用12,18,24 h后,在流式细胞仪上检测可见典型的亚二倍体峰。随着C2神经酰胺作用时间的延长,HepG2 细胞凋亡率与同时间HepG2vector细胞凋亡率比较无统计学意义(P>005),HepG2antibcl2细胞凋亡率较同时间HepG2细胞及HepG2vector细胞凋亡率显著增加(P<005,表1)。

    表1 C2神经酰胺(50 μmol/L)诱导HepG2细胞的凋亡率(略)

    n=3 HepG2antibcl2细胞与相同时间HepG2细胞、HepG2vector细胞比较,☆:P<005.

    223 DNA片段化分析 C2神经酰胺50 μmol/L作用24 h的HepG2细胞、HepG2vector细胞及HepG2antibcl2细胞,DNA琼脂糖凝胶电泳均呈现典型的180～200 bp的DNA梯状条带,表明DNA链在核小体间发生断裂,生成寡核小体,提示经C2神经酰胺作用可导致HepG2细胞凋亡。作用12 h,HepG2antibcl2细胞DNA琼脂糖凝胶电泳呈现DNA梯状条带,而HepG2细胞及HepG2vector细胞均未见DNA梯状条带(图3)。

    a12 h; b24 h; 1HepG2; 2HepG2vector; 3HepG2antibcl2; M100 bp

    图3 HepG2细胞经C2神经酰胺(50 μmol/L)作用不同时间后DNA凝胶电泳图(略)

    23 bcl2对C2神经酰胺诱导HepG2细胞凋亡过程Caspase3活性的影响 HepG2 细胞和HepG2vector细胞Caspase3活性随C2神经酰胺(50 μmol/L)作用时间延长而增强,但并非线性升高,3 h活性最高,随后下降,9 h活性接近起始,接着又开始升高。HepG2antibcl2细胞在C2神经酰胺(50 μmol/L)作用下Caspase3活性始终维持较高水平(图4)。

    图4 C2神经酰胺(50 μmol/L)对HepG2细胞Caspase3 活性的影响(略)

     3 讨论

    bcl2基因的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一,bcl2蛋白一直被认为是细胞凋亡的抑制成分。bcl2蛋白主要分布于线粒体外膜、内质网和核膜,它在线粒体外膜的聚集,阻止了线粒体释放细胞色素C,使细胞质内Caspase不能激活,抑制了细胞凋亡,因此利用反义核酸技术封闭或阻抑肿瘤细胞bcl2基因表达,恢复正常凋亡调控通道,可望在肿瘤治疗中收到良好的效果。bcl2蛋白在肝癌细胞凋亡中所扮演的角色一直存在争议。Takehara等认为在肝细胞癌组织及HepG2细胞中BclxL高表达而Bcl2不表达[4]。Jiang等用姜黄素、H2O2、UV诱导HepG2细胞凋亡，发现在HepG2细胞中表达一定量的bcl2和bax，但在各个不同时间点bcl2、bax无变化,因此认为bcl2家族在HepG2细胞凋亡中不起作用[5]。Tong等研究发现刺囊酸诱导HepG2细胞凋亡过程中Bcl2下调[6]。Ocker等研究一种人工合成的类维生素A(Adapalene)在诱导HepG2细胞凋亡过程中也发现Bcl2下调[7]。笔者认为肝癌细胞是否表达Bcl2这一有争议的现象可能与细胞的培养条件有关。

    笔者资料表明,HepG2细胞不仅表达Bcl2,且其表达程度与细胞凋亡有直接关系。通过脂质体介导的基因转染,建立稳定转染携带表达反义bcl2 mRNA的cDNA片段的人肝癌细胞HepG2细胞(HepG2antibcl2)。用细胞膜通透的外源性C2神经酰胺(50 μmol/L)在无血清条件下诱导HepG2细胞凋亡,流式细胞术显示经C2神经酰胺分别作用12,18,24 h,HepG2antibcl2细胞凋亡率显著高于同时间HepG2细胞及HepG2vector细胞;DNA琼脂糖凝胶电泳可见HepG2antibcl2细胞作用12 h即出现DNA梯形条带,而相同条件下HepG2及HepG2vector细胞未出现。Caspase3是目前发现的Caspase成员中与CED3同源性最高者,既是激活细胞凋亡的关键性激酶,也是细胞凋亡的主要效应分子。Caspase3在神经酰胺诱导不同细胞凋亡中的作用存在差异, Kondo等报道Caspase3在C2神经酰胺诱导的HL60细胞凋亡过程中被激活,而Caspase3的特异性抑制剂AcDEVDCHO可有效地保护神经酰胺诱导的细胞凋亡,提示Caspase3在神经酰胺诱导的细胞凋亡中起关键作用[8]。Zhao等报道神经酰胺诱导A431细胞凋亡包括Caspase依赖的和非Caspase依赖的信号途径[9]。对Caspase3与Bcl2之间的相互作用的研究发现,两者在调控凋亡过程中可以是相对独立的;Caspase亦可作为Bcl2的上游调控机制;更多情况下,Bcl2作为Caspase的上游调控机制[10]。笔者资料显示,HepG2细胞和HepG2vector细胞Caspase3活性随C2神经酰胺(50 μmol/L)作用时间延长而增强,但并非线性升高。HepG2antibcl2细胞Caspase3活性始终维持在较高水平,提示C2神经酰胺诱导HepG2细胞凋亡与Caspase3的激活有关,而且低表达bcl2可通过增加Caspase3活性促进C2神经酰胺诱导的HepG2细胞凋亡,在神经酰胺诱导HepG2细胞凋亡的信号传导途径中bcl2位于Caspase3的上游。

     参考文献:

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    (编辑:曹延)

    基金项目: 福建省教育厅科研基金资助项目(K20044)

    作者单位: 福建医科大学, 福州 350004 生物化学与分子生物学系; 蛇毒研究所, 百拇医药(高永琳, 郑大利, 许云禄)

百拇医药网 http://www.100md.com/html/DirDu/2007/04/28/43/04/38.htm