人类禽流感病毒感染的药物防控研究进展
摘要： 禽流感病毒具有高致病性和高致死率，它不仅给养殖业造成很大的危害，而且对人类的健康和生命安全也构成了威胁。因此，研究抗禽流感病毒的药物势在必行。本文综述了目前抗禽流感病毒药物的研究现状和进展。
关键词： 禽流感； 抗病毒； 药物作用靶点
Advances in antiavian influenza virus agents
Zhang Wenjun, Wang Guifang and Zhao Lixun*
(Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College, Beijing 100050)
ABSTRACT Avian influenza virus can causes a very high level of morbidity and mortality. It is not only greatly harmful to culturist, but also underlying dangerous to human being. Therefore it should be stressed to develop antivirus drugs. In this review, we foucus on the status and progress in research of antiavian influenza virus agents nowadays.
KEY WORDS Avian influenza virus; Antivirals; Target for drugs
1997年前，大多流感病毒学家认为宿主的特异性会对禽流感病毒感染人群形成障碍，因为禽流感病毒结合于细胞表面a2，3相连的硅铝酸受体，而人流感病毒结合于a2，6相连的硅铝酸受体[1]。人类呼吸道上皮细胞表面的受体大部分是a2，6型的，从而对禽流感病毒的吸附形成障碍。然而在1997年，香港发生了禽类的H5N1毒株引起人群感染的事件。在这次感染中全部被确证的18个感染者中有6人死亡[2]，说明这种宿主障碍是不完全的，而且这种没有显著攻击性的禽类病毒明显比普通的人类流感病毒致病性要强。从2003年到2004年，陆续有新的禽流感病毒感染人的事件报道。2003年香港有2个H5N1的病例，其中1人死亡。随后，在荷兰鸡群的H7N7亚型禽流感病毒爆发中有80多人被感染，其中1人死亡。2004年初亚洲禽流感疫情爆发，至少有5名泰国人被证实感染禽流感而死亡。同时越南全国64个省市中有22个省市发现了140余名患者及疑似患者，至少25人死亡。禽流感病毒似乎已经穿越了从禽类到人类由于种属特异性而形成的天然屏障。并且，一些禽流感病毒株感染人后有较高的致死率，对人类健康构成了很大的威胁。鉴于禽流感病毒的危害性，其防治已成为人畜共患病领域的研究热点，本文就目前抗禽流感病毒药物的研究现状作一简要综述。
1 禽流感病毒
禽流感病毒属于A型流感病毒，根据病毒颗粒表面的两种糖蛋白：血凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)进一步分为不同的亚型。在A型流感病毒中已经确定的15个HA亚型和9个NA亚型[3]都曾在禽流感毒株中被鉴定[4]。初步研究发现，A型流感病毒的H2、H5、H6、H7和H9可能传染给人类。H5和H7亚型中的H5N1和H7N2主要以禽类为宿主，但也可以传染给人。H6和H9亚型虽不象H5和H7那样有高致病性，但也不可忽视。在过去的10年里，这两种病毒都发生过从野生的水生动物向家养的禽类传染的事件， 并且可进一步传染给人[5，6](图1)。禽流感病毒颗粒表面HA1区的氨基酸序列是主要的抗原决定簇，从一个亚型到另一个亚型有30%左右序列的差别。禽流感病毒颗粒表面除了HA和NA以外，M2蛋白镶嵌在病毒颗粒中但数量有限。M2蛋白是由97个氨基酸组成的同源低聚物，分为3个结构域：N端由24个氨基酸残基组成胞外结构域，跨膜区由19个氨基酸组成疏水结构域，C端由54个氨基酸残基组成胞质区结构域[7]。在流行过程中，流感病毒的抗原性会发生变化。由于点突变而引起流感病毒的抗原性逐渐发生变异称为抗原漂移。由于基因重组发生的变异，则称为抗原转移[3]。免疫压力是推动抗原漂移的主要原因。禽流感病毒也存在抗原漂移现象，但机率要比人流感少，可能是免疫学压力较小的原因。抗原转移有两种原因，一是来自不同宿主的病毒间发生基因置换，二是由于两个不同病毒株感染同一个细胞后发生了基因重组[3]。禽流感病毒的基因组由分子量不同的8个单链RNA片段组成，每个片段分别编码不同的蛋白质。当两个不同的毒株同时感染同一个细胞时，两者的8个RNA片段即可互相重组而装配成256个组合以上的不同子代病毒，其中大部分子代病毒可能是无致病力的，而另一些子代病毒可能比其两个亲代病毒对细胞具有更大的破坏性。在过去的几年里，预防和治疗流感的努力主要集中于两种方法：疫苗和抗病毒药物。对于禽流感的防治，也主要从这两种方法入手。疫苗是减少禽流感病毒，缓解疾病症状和减轻并发症的有效方法。目前的禽流感疫苗有三种类型：全病毒疫苗、亚单位疫苗和表面抗原疫苗。疫苗的有效性主要决定于疫病流行区禽流感病毒的抗原与接种疫苗所产生的抗体间的匹配性。已用于人的流感疫苗的有效性还与个体因素有关，例如患者的年龄、所在疫区的时间、接种疫苗的时间等。理想的疫苗能使将近70%～90%的65岁以下的健康的成年人免于疾病[8，9]，然而当疫病流行区的病毒种类与疫苗产生的抗体不一致时，疫苗的有效性仅在50%左右。用于人类的禽流感疫苗更面临着特异性与安全的挑战[4]。目前使用的用于禽类的疫苗远非十全十美，它们主要还有下面几个缺点：无生物降解性，能引起炎症反应而使接种部位硬化，有时仅能产生弱的免疫应答或不能产生免疫应答等[10]。而且通过增加疫苗接种量并不总是能够增强免疫原性。最重要的是禽流感病毒的抗原变异，能使疫苗的有效性显著降低。疫苗的这些不足使得抗禽流感病毒药物的研究十分必要，它们既能起到治疗作用，也能起到预防作用，从而使该病毒对人类的威胁降到最低。
2 抗禽流感病毒药物
2.1 离子通道抑制剂(ion channel inhibitor)目前应用的流感病毒离子通道抑制剂有金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)两种。金刚烷胺是人类第一个抗流感病毒药物，1964年由DuPont化学公司研制成功，金刚乙胺是金刚烷胺的衍生物。金刚烷胺和金刚乙胺作用于A型流感病毒的M2蛋白[11]，通过干扰M2蛋白离子通道的活性来抑制流感病毒的复制。金刚烷胺和金刚乙胺在低浓度时对抑制H1N1，H2N2和H3N2病毒复制都有显著的效果。M2蛋白位于病毒颗粒的表面，有固定的数量。M2蛋白的跨膜区在人流感和禽流感病毒间具有高度的保守性，均由19个氨基酸组成疏水结构域。实验证实，M2蛋白在流感病毒复制周期中起离子通道作用。金刚烷胺及其衍生物能有效抑制禽流感病毒H7N7的复制[12]，然而H5N1禽流感病毒的M2基因中有一个抗性位点，因此对离子通道蛋白抑制剂不敏感。金刚烷胺应从感染流感病毒的48h内开始给药，对于儿童每日剂量应少于150mg，成人应少于200mg，对于肾功能不全的患者，每日用量要小于100mg。金刚烷胺主要对肝脏有一定毒副作用。另外极为重要的一点是在临床和实验条件下均易诱导产生耐药性毒株，这就限制了金刚烷胺类药物在临床上的广泛应用。流感病毒对其产生耐药性的原因主要是由于M2蛋白的突变引起的。
图1 流感病毒的宿主变化图(略)
野生的水生动物是禽流感病毒的主要宿主，包含15个HA亚型和9个NA亚型(H115；N19浅色标出)。野生的水生动物中的亚型：H5N1、H7N7、H9N2(浅色标出)可以传染给家养的动物并进一步传染给人[6]。图中黑色字体表示该种动物作为宿主所被鉴定出的A型流感病毒。
2.2 神经氨酸酶抑制剂(neuraminidase inhibitors)神经氨酸酶(neuraminidase，NA)是禽流感病毒表面的一种主要结构蛋白，具有唾液酸酶活性，能切割糖蛋白、糖脂和寡聚糖表面通过酮基连接的唾液酸。NA促进新形成的病毒颗粒从感染的呼吸道粘膜向周围组织扩散，在禽流感病毒致病性中有重要作用，故NA是设计抗禽流感病毒药物的重要靶点[11]。晶体结构的研究表明，NA是由相同亚基组成的四聚体。酶的活性位点位于各亚基表面的深穴中，均高度保守，其周围是易变异的抗原表位。根据NA的结构特点，Vonitzstein等用计算机辅助设计了两种NA的抑制剂：42氨基2Neu5Ac2ent和42胍基2Neu5Ac2en(CG167)。CG167对流感病毒的特异性增强，能有效抑制病毒复制。这与它能阻断神经氨酸酶活性，并干扰细胞间的融合有关[13]。早期临床试验发现，CG167感染前给药能减轻流感症状；感染后给药则缩短症状持续时间。目前不仅尚未发现它的明显副作用，而且流感病毒对其产生耐药性的频率也较低[14]。目前，它以商品名Zanamivir进入市场，用于人流感的治疗，在1994～1995年北美和欧洲流感发病期间获得了很好的效果。Zanamivir对禽流感的治疗研究也在进行，并取得一定的结果。此外，美国Gilead Science公司的科学家设计了一种新型碳环流感NA抑制剂GS4104。试验证实，它对流感病毒NA的亲和力比对人的同类酶大100万倍，是目前所发现的对NA特异性最高的药物。Irina等还用实验证明GS4104化合物能抑制被H5N1和H9N2感染过的小鼠细胞内病毒的增殖[15]，H5N1和H9N2是两种直接从禽类传染给人类的高致病性禽流感病毒。另有实验表明，NA的另一种抑制剂磺胺类药物在低pH值条件下抑制病毒的感染。磺胺类药物对流感病毒的抑制力，不仅依赖于亚型，而且依赖于宿主环境。在pH值为52时，大部分从人、猪、马体内分离到的流感病毒被磺胺类药物有效抑制，而禽流感病毒在pH值为52时对磺胺类药物的敏感性因NA的亚型不同表现各不相同，禽流感病毒N3和N6亚型同上述哺乳动物流感病毒相似，能被磺胺类药物有效抑制，但N2和N8亚型，不包括H9N2病毒，在同样的条件下仍可保持50%的活性。相反，在pH值为40时所有的禽流感病毒NA唾液酸酶的活性都能被磺胺类药物有效抑制[16]。
2.3 血凝集素受体结构域阻断剂血凝集素(HA)为流感病毒颗粒表面的另一种主要结构蛋白，在介导病毒感染中扮演着重要的角色，它通过结合到宿主细胞膜表面的硅铝酸受体上，介导病毒进入宿主细胞并且使细胞膜溶解[17～19]。HA是一个二聚体的纤突，纤突的每一个单体都包含一个球状的能与硅铝酸受体结合的保守结构域，周围围绕着可变的抗体结合位点[20]，流感病毒的感染是通过病毒结合到细胞上的受体而启动的，因此通过阻止这种结合可以阻断感染。利用上面提到的HA保守区域做为靶点，设计新的化合物结合到HA的受体结合区域可阻止病毒结合并感染细胞。Jeon等[21]设计的新分子aptamer能直接结合到病毒HA的受体结合区域并且最终阻止病毒与细胞的相互作用。aptamer分子是能特异性地与靶分子结合的单链DNA或RNA寡聚核苷酸，这种寡聚核苷酸被看作为单克隆抗体的替代物，并被认为是惟一在诊断和治疗方面均有用的药品，可能被发展成一种新型的抗禽流感病毒药物而应用于临床。
2.4 干扰RNA(siRNAs)RNAi是一种新出现的技术，是通过RNA特异性地抑制基因的表达。小的干扰RNA(siRNAs)是较短的(21～26nt)双链RNA，抑制基因表达可能是通过诱导同源的mRNA序列特异性降解来实现[22]。许多研究表明，在体外将siRNAs导入哺乳动物细胞内可以显著地抑制特定基因的表达。同理推测RNAi能够通过抑制病毒基因的表达来保护细胞。随后，一些体外试验证明siRNA能抑制RNA病毒的复制，包括HIV病毒、polio病毒、肝炎病毒、西尼罗河病毒和流感病毒等[23，24]，新的文献对siRNA对SARS冠状病毒在细胞水平上[25]，在动物体内的[26]复制抑制作用作了报道。试验者构建了三株克隆细胞psOa、psOe和psSk，psOa和psSk无针对SARS冠状病毒Pol基因的siRNA，psOe有针对Pol基因的siRNA，以psNe细胞作为阴性对照，观察感染BJ01株病毒后psOa、psOe和psSk的细胞病变情况，并对未发生细胞病变者进行间接免疫荧光检测，进一步确定细胞中是否存在特异性SARS病毒抗原。病毒感染后d3的细胞病变情况为，psOa和psSk两株细胞与阴性对照细胞psNe相比并无差别，细胞病变均为4+，无抑制病毒感染的作用，而针对Pol基因的psOe细胞病变为阴性。间接免疫荧光检测结果为psOe细胞中无SARS病毒的特异性抗原存在。表明了针对SARS冠状病毒Pol基因的siRNA(psOe)干扰了SARS病毒蛋白的表达。同时作者采用实时定量反转录PCR方法对细胞上清中SARS病毒相对含量进行了检测。检测指标为SARS病毒Pol基因的拷贝数。结果显示，psOe细胞培养上清中病毒含量始终维持在较低水平，尤其在病毒感染后d5和d7，其含量仅为对照细胞psNe的10-3倍。对照细胞psNe培养上清中病毒含量在病毒感染后24h显著升高，并维持在较高水平。表明在psOe克隆细胞内siRNA强烈地抑制了SARS病毒RNA的复制，从而干扰了病毒蛋白的表达[25]。动物体内试验中，试验者报道了使用siRNA预防和治疗在恒河猴体内的冠状病毒。感染病毒的恒河猴体内温度是一个重要指示，不仅指示感染SARS症状，而且指示治疗效力。试验者报道了每一个动物每日体温，并比较了所有的五个试验组平均体温，发现相对于对照组(温度高于391℃)所有受治疗组的体温显著降低(低于389℃)，同时预防治疗组出现最低温度(387℃)，接近于正常体温(385℃)。试验者还做了siRNA抑制SARS冠状病毒在猴子呼吸系统中复制的试验。采用实时定量反转录PCR方法对d4呼吸系统内器官样品中SARS病毒相对含量进行了检测，在所有感染病毒的和非特异的siRNA对照组样本中检测到SARS冠状病毒，但在75%的治疗组样本中没有检测到SARS冠状病毒，这个结果显示，通过特异的siRNA可能抑制动物体内SARS冠状病毒感染和复制[26]。这些试验结果为对siRNA抗禽流感病毒的研究奠定了基础。Tompkins等[27]的实验表明RNA干扰能有效抑制流感病毒A在动物体内的复制。作者表明导入这些siRNA能明显减少感染了流感病毒的小鼠肺内的病毒滴度，保护被感染的动物免于死亡，而且这种保护作用是特异性的。siRNA治疗还对高致病性的禽流感病毒H5和H7亚型有很强的抑制作用，说明siRNA有希望成为控制禽流感病毒感染的有力武器。
2.5 抗生素类抗禽流感药物抗生素作为抗菌药物一直发挥着巨大的作用，它以其筛选方法成熟、资源丰富及作用机制广泛而备受青睐。抗生素是一类特殊的化学物质，从总体上讲，除抗肿瘤抗生素外，它们均通过选择毒性来抑制微生物的繁殖，而不干扰宿主细胞的功能，提示我们应对抗生素的抗病毒作用进行探索，作为当前抗禽流感病毒药物的一个重要补充。一些具有抗病毒作用的抗生素[28]其机理已被深入研究，虽未发现其具有抗禽流感病毒的活性，但就其抗RNA病毒这一点来说，可以作为一种资源进行探索。我国学者从我国云南土壤中分离的—株放线菌产生的抗生素17997，后经鉴定属于苯安莎霉素类抗生素，经抗病毒药物筛选，发现其有广谱抗病毒作用[29]。在培养细胞内对单纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、人免疫缺陷病毒Ⅰ型、水疱性口炎病毒及柯萨奇病毒B3均有显著抑制活性，IC50在μmol/L水平。在小鼠体内对单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型所致疱疹性脑炎有确切治疗效果，对死亡保护率和平均生存日与对照组相比有显著差别。作用机制的研究发现17997作用于病毒复制早期，可显著抑制病毒DNA的合成[30，31]，未检测其抗禽流感病毒活性。本所研发的多肽类抗生素1647是一个有效的抗禽流感药物。1647是由链霉菌产生的次级代谢产物，其分子量约4000左右，由约30个氨基酸组成的生物活性肽。可在体外有效地灭活多种单链有膜RNA病毒包括禽流感病毒、流感病毒A型、冠状病毒等，空气喷雾可以防止病毒在空气中传播。
3 结语
目前，H5N1毒株对于离子通道类药物(amantadine,rimantadine)有抗性，但对神经氨酸酶抑制剂(zanamivir)敏感。神经氨酸酶抑制剂对A型流感病毒，包括H5N1亚型的禽流感病毒有效，但限于患者的数量尚未进行有效的临床试验[33]。新的抗禽流感病毒药物或许会在对离子通道抑制剂、神经氨酸酶抵制剂、血凝集素受体阻断剂的衍生物的研制和新的抗病毒靶点的发现中发现；另外，从资源丰富、种类庞大的抗生素中寻找新的抗禽流感病毒药物，也是一种不容忽视的途径。
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基金项目：科技部重大专项(2004BA519A16)支持。
(中国医学科学院 中国协和医科大学 医药生物技术研究所， 北京100050), http://www.100md.com(张文军 王桂芳 赵立勋)
关键词： 禽流感； 抗病毒； 药物作用靶点
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KEY WORDS Avian influenza virus; Antivirals; Target for drugs
1997年前，大多流感病毒学家认为宿主的特异性会对禽流感病毒感染人群形成障碍，因为禽流感病毒结合于细胞表面a2，3相连的硅铝酸受体，而人流感病毒结合于a2，6相连的硅铝酸受体[1]。人类呼吸道上皮细胞表面的受体大部分是a2，6型的，从而对禽流感病毒的吸附形成障碍。然而在1997年，香港发生了禽类的H5N1毒株引起人群感染的事件。在这次感染中全部被确证的18个感染者中有6人死亡[2]，说明这种宿主障碍是不完全的，而且这种没有显著攻击性的禽类病毒明显比普通的人类流感病毒致病性要强。从2003年到2004年，陆续有新的禽流感病毒感染人的事件报道。2003年香港有2个H5N1的病例，其中1人死亡。随后，在荷兰鸡群的H7N7亚型禽流感病毒爆发中有80多人被感染，其中1人死亡。2004年初亚洲禽流感疫情爆发，至少有5名泰国人被证实感染禽流感而死亡。同时越南全国64个省市中有22个省市发现了140余名患者及疑似患者，至少25人死亡。禽流感病毒似乎已经穿越了从禽类到人类由于种属特异性而形成的天然屏障。并且，一些禽流感病毒株感染人后有较高的致死率，对人类健康构成了很大的威胁。鉴于禽流感病毒的危害性，其防治已成为人畜共患病领域的研究热点，本文就目前抗禽流感病毒药物的研究现状作一简要综述。
1 禽流感病毒
禽流感病毒属于A型流感病毒，根据病毒颗粒表面的两种糖蛋白：血凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)进一步分为不同的亚型。在A型流感病毒中已经确定的15个HA亚型和9个NA亚型[3]都曾在禽流感毒株中被鉴定[4]。初步研究发现，A型流感病毒的H2、H5、H6、H7和H9可能传染给人类。H5和H7亚型中的H5N1和H7N2主要以禽类为宿主，但也可以传染给人。H6和H9亚型虽不象H5和H7那样有高致病性，但也不可忽视。在过去的10年里，这两种病毒都发生过从野生的水生动物向家养的禽类传染的事件， 并且可进一步传染给人[5，6](图1)。禽流感病毒颗粒表面HA1区的氨基酸序列是主要的抗原决定簇，从一个亚型到另一个亚型有30%左右序列的差别。禽流感病毒颗粒表面除了HA和NA以外，M2蛋白镶嵌在病毒颗粒中但数量有限。M2蛋白是由97个氨基酸组成的同源低聚物，分为3个结构域：N端由24个氨基酸残基组成胞外结构域，跨膜区由19个氨基酸组成疏水结构域，C端由54个氨基酸残基组成胞质区结构域[7]。在流行过程中，流感病毒的抗原性会发生变化。由于点突变而引起流感病毒的抗原性逐渐发生变异称为抗原漂移。由于基因重组发生的变异，则称为抗原转移[3]。免疫压力是推动抗原漂移的主要原因。禽流感病毒也存在抗原漂移现象，但机率要比人流感少，可能是免疫学压力较小的原因。抗原转移有两种原因，一是来自不同宿主的病毒间发生基因置换，二是由于两个不同病毒株感染同一个细胞后发生了基因重组[3]。禽流感病毒的基因组由分子量不同的8个单链RNA片段组成，每个片段分别编码不同的蛋白质。当两个不同的毒株同时感染同一个细胞时，两者的8个RNA片段即可互相重组而装配成256个组合以上的不同子代病毒，其中大部分子代病毒可能是无致病力的，而另一些子代病毒可能比其两个亲代病毒对细胞具有更大的破坏性。在过去的几年里，预防和治疗流感的努力主要集中于两种方法：疫苗和抗病毒药物。对于禽流感的防治，也主要从这两种方法入手。疫苗是减少禽流感病毒，缓解疾病症状和减轻并发症的有效方法。目前的禽流感疫苗有三种类型：全病毒疫苗、亚单位疫苗和表面抗原疫苗。疫苗的有效性主要决定于疫病流行区禽流感病毒的抗原与接种疫苗所产生的抗体间的匹配性。已用于人的流感疫苗的有效性还与个体因素有关，例如患者的年龄、所在疫区的时间、接种疫苗的时间等。理想的疫苗能使将近70%～90%的65岁以下的健康的成年人免于疾病[8，9]，然而当疫病流行区的病毒种类与疫苗产生的抗体不一致时，疫苗的有效性仅在50%左右。用于人类的禽流感疫苗更面临着特异性与安全的挑战[4]。目前使用的用于禽类的疫苗远非十全十美，它们主要还有下面几个缺点：无生物降解性，能引起炎症反应而使接种部位硬化，有时仅能产生弱的免疫应答或不能产生免疫应答等[10]。而且通过增加疫苗接种量并不总是能够增强免疫原性。最重要的是禽流感病毒的抗原变异，能使疫苗的有效性显著降低。疫苗的这些不足使得抗禽流感病毒药物的研究十分必要，它们既能起到治疗作用，也能起到预防作用，从而使该病毒对人类的威胁降到最低。
2 抗禽流感病毒药物
2.1 离子通道抑制剂(ion channel inhibitor)目前应用的流感病毒离子通道抑制剂有金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)两种。金刚烷胺是人类第一个抗流感病毒药物，1964年由DuPont化学公司研制成功，金刚乙胺是金刚烷胺的衍生物。金刚烷胺和金刚乙胺作用于A型流感病毒的M2蛋白[11]，通过干扰M2蛋白离子通道的活性来抑制流感病毒的复制。金刚烷胺和金刚乙胺在低浓度时对抑制H1N1，H2N2和H3N2病毒复制都有显著的效果。M2蛋白位于病毒颗粒的表面，有固定的数量。M2蛋白的跨膜区在人流感和禽流感病毒间具有高度的保守性，均由19个氨基酸组成疏水结构域。实验证实，M2蛋白在流感病毒复制周期中起离子通道作用。金刚烷胺及其衍生物能有效抑制禽流感病毒H7N7的复制[12]，然而H5N1禽流感病毒的M2基因中有一个抗性位点，因此对离子通道蛋白抑制剂不敏感。金刚烷胺应从感染流感病毒的48h内开始给药，对于儿童每日剂量应少于150mg，成人应少于200mg，对于肾功能不全的患者，每日用量要小于100mg。金刚烷胺主要对肝脏有一定毒副作用。另外极为重要的一点是在临床和实验条件下均易诱导产生耐药性毒株，这就限制了金刚烷胺类药物在临床上的广泛应用。流感病毒对其产生耐药性的原因主要是由于M2蛋白的突变引起的。
图1 流感病毒的宿主变化图(略)
野生的水生动物是禽流感病毒的主要宿主，包含15个HA亚型和9个NA亚型(H115；N19浅色标出)。野生的水生动物中的亚型：H5N1、H7N7、H9N2(浅色标出)可以传染给家养的动物并进一步传染给人[6]。图中黑色字体表示该种动物作为宿主所被鉴定出的A型流感病毒。
2.2 神经氨酸酶抑制剂(neuraminidase inhibitors)神经氨酸酶(neuraminidase，NA)是禽流感病毒表面的一种主要结构蛋白，具有唾液酸酶活性，能切割糖蛋白、糖脂和寡聚糖表面通过酮基连接的唾液酸。NA促进新形成的病毒颗粒从感染的呼吸道粘膜向周围组织扩散，在禽流感病毒致病性中有重要作用，故NA是设计抗禽流感病毒药物的重要靶点[11]。晶体结构的研究表明，NA是由相同亚基组成的四聚体。酶的活性位点位于各亚基表面的深穴中，均高度保守，其周围是易变异的抗原表位。根据NA的结构特点，Vonitzstein等用计算机辅助设计了两种NA的抑制剂：42氨基2Neu5Ac2ent和42胍基2Neu5Ac2en(CG167)。CG167对流感病毒的特异性增强，能有效抑制病毒复制。这与它能阻断神经氨酸酶活性，并干扰细胞间的融合有关[13]。早期临床试验发现，CG167感染前给药能减轻流感症状；感染后给药则缩短症状持续时间。目前不仅尚未发现它的明显副作用，而且流感病毒对其产生耐药性的频率也较低[14]。目前，它以商品名Zanamivir进入市场，用于人流感的治疗，在1994～1995年北美和欧洲流感发病期间获得了很好的效果。Zanamivir对禽流感的治疗研究也在进行，并取得一定的结果。此外，美国Gilead Science公司的科学家设计了一种新型碳环流感NA抑制剂GS4104。试验证实，它对流感病毒NA的亲和力比对人的同类酶大100万倍，是目前所发现的对NA特异性最高的药物。Irina等还用实验证明GS4104化合物能抑制被H5N1和H9N2感染过的小鼠细胞内病毒的增殖[15]，H5N1和H9N2是两种直接从禽类传染给人类的高致病性禽流感病毒。另有实验表明，NA的另一种抑制剂磺胺类药物在低pH值条件下抑制病毒的感染。磺胺类药物对流感病毒的抑制力，不仅依赖于亚型，而且依赖于宿主环境。在pH值为52时，大部分从人、猪、马体内分离到的流感病毒被磺胺类药物有效抑制，而禽流感病毒在pH值为52时对磺胺类药物的敏感性因NA的亚型不同表现各不相同，禽流感病毒N3和N6亚型同上述哺乳动物流感病毒相似，能被磺胺类药物有效抑制，但N2和N8亚型，不包括H9N2病毒，在同样的条件下仍可保持50%的活性。相反，在pH值为40时所有的禽流感病毒NA唾液酸酶的活性都能被磺胺类药物有效抑制[16]。
2.3 血凝集素受体结构域阻断剂血凝集素(HA)为流感病毒颗粒表面的另一种主要结构蛋白，在介导病毒感染中扮演着重要的角色，它通过结合到宿主细胞膜表面的硅铝酸受体上，介导病毒进入宿主细胞并且使细胞膜溶解[17～19]。HA是一个二聚体的纤突，纤突的每一个单体都包含一个球状的能与硅铝酸受体结合的保守结构域，周围围绕着可变的抗体结合位点[20]，流感病毒的感染是通过病毒结合到细胞上的受体而启动的，因此通过阻止这种结合可以阻断感染。利用上面提到的HA保守区域做为靶点，设计新的化合物结合到HA的受体结合区域可阻止病毒结合并感染细胞。Jeon等[21]设计的新分子aptamer能直接结合到病毒HA的受体结合区域并且最终阻止病毒与细胞的相互作用。aptamer分子是能特异性地与靶分子结合的单链DNA或RNA寡聚核苷酸，这种寡聚核苷酸被看作为单克隆抗体的替代物，并被认为是惟一在诊断和治疗方面均有用的药品，可能被发展成一种新型的抗禽流感病毒药物而应用于临床。
2.4 干扰RNA(siRNAs)RNAi是一种新出现的技术，是通过RNA特异性地抑制基因的表达。小的干扰RNA(siRNAs)是较短的(21～26nt)双链RNA，抑制基因表达可能是通过诱导同源的mRNA序列特异性降解来实现[22]。许多研究表明，在体外将siRNAs导入哺乳动物细胞内可以显著地抑制特定基因的表达。同理推测RNAi能够通过抑制病毒基因的表达来保护细胞。随后，一些体外试验证明siRNA能抑制RNA病毒的复制，包括HIV病毒、polio病毒、肝炎病毒、西尼罗河病毒和流感病毒等[23，24]，新的文献对siRNA对SARS冠状病毒在细胞水平上[25]，在动物体内的[26]复制抑制作用作了报道。试验者构建了三株克隆细胞psOa、psOe和psSk，psOa和psSk无针对SARS冠状病毒Pol基因的siRNA，psOe有针对Pol基因的siRNA，以psNe细胞作为阴性对照，观察感染BJ01株病毒后psOa、psOe和psSk的细胞病变情况，并对未发生细胞病变者进行间接免疫荧光检测，进一步确定细胞中是否存在特异性SARS病毒抗原。病毒感染后d3的细胞病变情况为，psOa和psSk两株细胞与阴性对照细胞psNe相比并无差别，细胞病变均为4+，无抑制病毒感染的作用，而针对Pol基因的psOe细胞病变为阴性。间接免疫荧光检测结果为psOe细胞中无SARS病毒的特异性抗原存在。表明了针对SARS冠状病毒Pol基因的siRNA(psOe)干扰了SARS病毒蛋白的表达。同时作者采用实时定量反转录PCR方法对细胞上清中SARS病毒相对含量进行了检测。检测指标为SARS病毒Pol基因的拷贝数。结果显示，psOe细胞培养上清中病毒含量始终维持在较低水平，尤其在病毒感染后d5和d7，其含量仅为对照细胞psNe的10-3倍。对照细胞psNe培养上清中病毒含量在病毒感染后24h显著升高，并维持在较高水平。表明在psOe克隆细胞内siRNA强烈地抑制了SARS病毒RNA的复制，从而干扰了病毒蛋白的表达[25]。动物体内试验中，试验者报道了使用siRNA预防和治疗在恒河猴体内的冠状病毒。感染病毒的恒河猴体内温度是一个重要指示，不仅指示感染SARS症状，而且指示治疗效力。试验者报道了每一个动物每日体温，并比较了所有的五个试验组平均体温，发现相对于对照组(温度高于391℃)所有受治疗组的体温显著降低(低于389℃)，同时预防治疗组出现最低温度(387℃)，接近于正常体温(385℃)。试验者还做了siRNA抑制SARS冠状病毒在猴子呼吸系统中复制的试验。采用实时定量反转录PCR方法对d4呼吸系统内器官样品中SARS病毒相对含量进行了检测，在所有感染病毒的和非特异的siRNA对照组样本中检测到SARS冠状病毒，但在75%的治疗组样本中没有检测到SARS冠状病毒，这个结果显示，通过特异的siRNA可能抑制动物体内SARS冠状病毒感染和复制[26]。这些试验结果为对siRNA抗禽流感病毒的研究奠定了基础。Tompkins等[27]的实验表明RNA干扰能有效抑制流感病毒A在动物体内的复制。作者表明导入这些siRNA能明显减少感染了流感病毒的小鼠肺内的病毒滴度，保护被感染的动物免于死亡，而且这种保护作用是特异性的。siRNA治疗还对高致病性的禽流感病毒H5和H7亚型有很强的抑制作用，说明siRNA有希望成为控制禽流感病毒感染的有力武器。
2.5 抗生素类抗禽流感药物抗生素作为抗菌药物一直发挥着巨大的作用，它以其筛选方法成熟、资源丰富及作用机制广泛而备受青睐。抗生素是一类特殊的化学物质，从总体上讲，除抗肿瘤抗生素外，它们均通过选择毒性来抑制微生物的繁殖，而不干扰宿主细胞的功能，提示我们应对抗生素的抗病毒作用进行探索，作为当前抗禽流感病毒药物的一个重要补充。一些具有抗病毒作用的抗生素[28]其机理已被深入研究，虽未发现其具有抗禽流感病毒的活性，但就其抗RNA病毒这一点来说，可以作为一种资源进行探索。我国学者从我国云南土壤中分离的—株放线菌产生的抗生素17997，后经鉴定属于苯安莎霉素类抗生素，经抗病毒药物筛选，发现其有广谱抗病毒作用[29]。在培养细胞内对单纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、人免疫缺陷病毒Ⅰ型、水疱性口炎病毒及柯萨奇病毒B3均有显著抑制活性，IC50在μmol/L水平。在小鼠体内对单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型所致疱疹性脑炎有确切治疗效果，对死亡保护率和平均生存日与对照组相比有显著差别。作用机制的研究发现17997作用于病毒复制早期，可显著抑制病毒DNA的合成[30，31]，未检测其抗禽流感病毒活性。本所研发的多肽类抗生素1647是一个有效的抗禽流感药物。1647是由链霉菌产生的次级代谢产物，其分子量约4000左右，由约30个氨基酸组成的生物活性肽。可在体外有效地灭活多种单链有膜RNA病毒包括禽流感病毒、流感病毒A型、冠状病毒等，空气喷雾可以防止病毒在空气中传播。
3 结语
目前，H5N1毒株对于离子通道类药物(amantadine,rimantadine)有抗性，但对神经氨酸酶抑制剂(zanamivir)敏感。神经氨酸酶抑制剂对A型流感病毒，包括H5N1亚型的禽流感病毒有效，但限于患者的数量尚未进行有效的临床试验[33]。新的抗禽流感病毒药物或许会在对离子通道抑制剂、神经氨酸酶抵制剂、血凝集素受体阻断剂的衍生物的研制和新的抗病毒靶点的发现中发现；另外，从资源丰富、种类庞大的抗生素中寻找新的抗禽流感病毒药物，也是一种不容忽视的途径。
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基金项目：科技部重大专项(2004BA519A16)支持。
(中国医学科学院 中国协和医科大学 医药生物技术研究所， 北京100050), http://www.100md.com(张文军 王桂芳 赵立勋)