乙型肝炎病毒血清学标志物(HBV-M)的检出及应用
【摘要】 目的 旨在研究TRFIA、MEIA、ELISA技术在乙型肝炎病毒标志物检测中的应用情况。就其结果的符合程度及灵敏度及特异性的比较，探讨三种检测方法在日常工作中的可行性及相关性。方法 采用Anytest-2000时间分辨荧光免疫分析仪及配套试剂对200例正常人(来自本院健康职工)随机抽取50例作为对照及50例乙型肝炎患者的血清(强阳性或临界值)同时用TRFIA法、AXSYM免疫分析仪微粒子酶免疫分析法(MEIA)及ELISA法进行HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb,HBcAb五项指标检测。结果 50份患者血清TRFIA法和ELISA法检测结果比较：阳性符合率HBsAg98.00%、HBsAb87.00%、HBeAg97.00%、HBeAb90.00%、HBcAb94.00%；灵敏度HBsAg97.96%、HBsAb93.47%、HBeAg96.55%、HBeAb90.91%、HBcAb95.92%；特异性HBsAg98.04%、HBsAb81.48%、HBeAg97.18%、HBeAb89.74%、HBcAb92.16%。TRFIA和MEIA检测结果：阳性符合率HBsAg98.00%、HBsAb92.00%、HBeAg98.00%、HBeAb94.00%、HBcAb97.00%；灵敏度HBsAg97.95%、HBsAb100%、HBeAg96.97%、HBeAb95.83%、HBcAb98.00%；特异性HBsAg98.08%、HBsAb85.45%、HBeAg98.57%、HBeAb93.42%、HBcAb96.00%。而MEIA与ELISA检测结果阳性符合率HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb分别为99.00%、99.00%、98.00%、98.00%、99.00%；灵敏度分别为100%、100%、96.67%、91.67%、98.00%；特异性分别为100%、98.18%、98.57%、100%、100%。结论 因时间分辨荧光免疫技术具有高灵敏度、高稳定性、高特异性和动态范围宽等诸多优点，可作为乙型肝炎病毒指标定量的一种常规方法，能为临床检测诊断与疗效监测、预后判断和科学试验以及乙型肝炎疫苗免疫力的评价和高危人群预防提供及时准确的实验信息，具有越来越大的实践应用空间。
【关键词】 乙型肝炎病毒血清学标志物(HBV-M)；时间分辨荧光免疫技术(TRFIA)；微粒子酶免疫分析法(MEIA)；酶联免疫吸附试验(ELISA)
To investigate the measurement results and application of HBV-M
LIU Jin-tao, ZENG Xian-kun. The Second Municipal People’s Hospital of Huhhot,Inner Mongolia 010031,China
【Abstract】 Objective To investigate experimentally the application of the analysis technique of the time resolved fluoroimmunoassay in serum testing for the hepatitis B virus. And by comparing the consistence，sensitivity and specificity between the TRFIA，the MEIA and the ELISA in HBV-M determination and understand the accuracy and feasibility of the TRFIA method in HBV-M measurement. Methods By means of AT-2000 time resolved fluoroimmunoassay instrument and concomitant reagent to determine 200 serum samples of normal people from our hospital(control group randomized samples)and 50 serum(case group)distinct positive or threshold samples of patients for HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb and comparing the results with AXSYM MEIA.Results For the results of 50 serum samples of patients，the positive compatibility rate of the TRFIA and with the MEIA for HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb and HBcAb is 98.00%，92.00%，98.00%，94.00% and 97.00% respectively，sensitivity is 97.95%，100%，96.97%，95.83% and 98.00%，specificity is 98.08%，85.45%，98.57%，93.42% and 96.00%，and there was not significant difference (P>0.05) between two groups of results. the positive compatibility rate of the TRFIA and with the ELISA for HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb and HBcAb is 98.00%，87.00%，97.00%，90.00% and 94.00%，respectively，sensitivity is 97.96%，93.47%，96.55%，90.91% and 95.92%，specificity is 98.04%，81.48%，97.18%，89.74% and 92.16%.(P>0.05).And the positive compatibility rate of the MEIA and with the ELISA for HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb and HBcAb is 99.00%，99.00%，98.00%，98.00% and 99.00% respectively,sensitivity is 100%，100%，96.67%，91.67% and 98.00%，and specificity is 100%，98.18%，98.57%，100% and 100%.(P>0.05).Conclusion The results showed that the method of determining serological markers of hepatitis B virus by the time resolved fluoroimmunoassay with high sensitivity and good stability was cost-effective and suitable for China realistic conditions and being cheap could be used easily a routine method of quantitative assay for hepatitis B virus. The consistence and specificity and sensitivity of HBV-M measurement results by TRFIA are better than those by the MEIA and the ELISA. Some constructive views were raised and involved.It has an important clinical significance not only in evaluating the patient’s condition ,monitoring clinical treatment and curative effect and judging prognosis but also in vaccinating hepatitis B vaccine. It will be an ideal method to be spread during clinical practice.
【Key words】 HBV-M：hepatitis B virus serological marker；TRFIA：time resolved fluoroimmunoassay; MEIA：minute-particle enzyme immunity analysis；ELISA：enzyme-linked immunosorbent assay
自1970年Dane氏发现HBV(故称为Dane颗粒，是完整的乙型肝炎病毒体)以来，乙型肝炎仍是常见的感染性疾病(Infectious Diseases)之一，仅HBV携带者全世界就有2亿之多。HBV是乙型肝炎的病原体，乙型肝炎患者潜伏期、急性期及乙型肝炎病毒携带者的血液具有高传染性，接触极微量的(10-7～10-6ml)的血液即可引起感染。乙型肝炎危害极大，约10%的乙型肝炎转变为慢性肝炎(CH)，部分慢性活动性肝炎(CAH)转变为肝癌(HCC)。婴幼儿感染HBV易形成持续病毒携带者，HBV病毒携带者发生原发性肝癌的危险性更大。而我国又是乙型肝炎高感染国家，据统计，全国人口10%以上为HBsAg携带者，乙型肝炎病毒的总感染率为35.5%～61.1%，有报道[1]用目前常用的方法检测出HBsAg阴性的人群中，有11.0%HBV-DNA呈阳性反应，也就是说，用常规的检测方法可能有11.0%的漏检率，是因为抗原含量低于现行方法的可检出水平。应用免疫学手段检测HBV特异性抗原抗体是HBV感染诊断的重要方法之一，而TRFIA技术的出现为其提供了新的工具，对于低水平的HBV感染的检出及临床诊断和流行病学都有重要意义[2]。由于可进行定量分析，对药物疗效和病情监测都具有重要意义[3]。本实验用三种不同的方法检测了HBV-M，旨在探讨三种方法在日常生活工作中的可行性与相关性。现将实验结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 健康人血清 采用TRFIA、MEIA、ELISA对我院200例健康职工经HBV-M五项指标做定性(量)分析，随机抽取50例作为正常对照，年龄1～45岁。
1.1.2 乙型肝炎患者血清 用TRFIA、MEIA、ELISA对50例强阳性或临界值血清样本(来自我院住院及门诊)做HBV-M五项指标检测，年龄1/12岁～81岁。
1.1.3 质控血清 卫生部临检中心质量控制血清浓度分别为：0.2ng/ml，0.5ng/ml，1.0ng/ml，2.0ng/ml,5.0ng/ml；内蒙古临检中心质控血清：0.3ng/ml,1.0ng/ml,2.0ng/ml，5.0ng/ml。
1.2 诊断试剂、仪器与方法
1.2.1 诊断试剂与仪器 TRFIA分析法使用上海新波生物技术有限公司生产的ANYTEST2000型时间分辨荧光免疫检测系统和SYM-BIO BGATE2310全自动微孔洗涤机及配套试剂。MEIA分析法使用美国Abbott试剂和AXSYM 全自动酶免发光分析系统；ELISA法使用北京万泰药业公司及3V公司生产的试剂。洗板机为天石医疗用品制作所ZMX-998B型自动酶标洗板机；酶标仪为奥地利CliniBio 128C自动酶标仪和SHANDONG GAOMI CAIHONG ANALYTICAL INSTRUMENTS CO.LTD的GF-M2000 MICROPLATE READER。
1.2.2 方法 TRFIA(Time resolved fluoroimmuno assay，时间分辨荧光免疫技术)技术是以镧系元素铕化合物作为荧光标记物，利用这一荧光物质有长荧光寿命的特点，延长荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再进行测定，所得信号完全为长寿命镧系螯合物的荧光，从而有效地消除非特异本底荧光的干扰，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。
2 结果与分析
2.1 TRFIA和ELISA检测定性结果分布 见表1。由表1得：HBsAg：灵敏度48/(48+1)×100%=97.96%，特异性50/(50+1)×100%=98.04%，诊断符合率98.00%；同理：HBsAb：灵敏度为93.47%，特异性81.48%，诊断符合率97.00%；HBeAg：灵敏度为96.55%，特异性97.18%，诊断符合率97.00%；HBeAb：灵敏度为90.91%，特异性89.74%，诊断符合率90.00%；HBcAb：灵敏度为95.92%，特异性92.16%,诊断符合率94.00%。表1 TRFIA和ELISA检测定性结果
2.2 TRFIA和MEIA检测定性结果分布 见表2。 表2 TRFIA和MEIA检测定性结果分布由表2得：HBsAg灵敏度48/(48+1)×100%=97.95%；特异性51/(51+1)×100%=98.08%；诊断符合率98%；同理：HBsAb： 灵敏度为100%，特异性85.45%，诊断符合率92%；HBeAg：灵敏度为96.97%，特异性98.57%，诊断符合率98.00%；HBeAb：灵敏度为95.83%，特异性93.42%，诊断符合率94.00%；HBcAb：灵敏度为98.00%，特异性96.00%，诊断符合率97.00%。
2.3 ELISA和MEIA检测定性结果分布 见表3。表3 ELISA和MEIA检测定性结果分布由表3得：HBsAg： 灵敏度49/(49+0)×100%=100%；特异性51/(51+0)×100%=100%；诊断符合率99.00%；同理：HBsAb： 灵敏度为100%，特异性98.18%，诊断符合率99.00%；HBeAg：灵敏度为96.67%，特异性98.57%，诊断符合率98.00%；HBeAb：灵敏度为91.67%，特异性100%，诊断符合率98.00%；HBcAb：灵敏度为98.00%，特异性100%，诊断符合率99.00%。
2.4 分析比较
2.4.1 当CUTOFF值设置为≥0.3ng/ml时，HBsAg：TRFIA 1例阳性，表现为“小三阳”，而ELISA阴性，其浓度为0.4ng/ml，结果仅为HBeAb和HBcAb阳性，提示TRFIA由于相对敏感而检出，而MEIA与TRFIA基本一致。但就临界标本而言，TRFIA、ELISA、MEIA均存在一定的假阳性率、假阴性率分别为1.96%、2.04%。就随机样本而言，ELISA、MEIA则HBsAg 较易出假阳性、假阴性反应。实际工作中HBsAg的CUTOFF值设为0.5ng/ml。
2.4.2 当CUTOFF值设置为≥0.03NCU/ml时，TRFIA 法HBeAg2例阳性，而ELISA阴性，经过综合分析，这2例为真阳性。而MEIA仅有1例阳性，说明三种方法均有一定的漏检TRFIA法测HBeAg灵敏度、特异性、结果符合率就随机样本而言，要高于ELISA、MEIA。因本项目标本所选取大多为强阳性标本，故其灵敏度、特异性、结果符合率基本一致。
2.4.3 当CUTOFF值设置为≥10mIU/ml时，HBsAb三种方法均很好，阳性符合率都很高；当CUTOFF值设置为≥1.5NCU/ml时，HBeAb三种方法阳性率也都很高。但就临界标本而言，ELISA和MEIA出现假阳性和假阴性反应要高于TRFIA法且易漏检。
2.4.4 当CUTOFF值设置为≥0.095NCU/ml时，HBcAb：TRFIA 1例假阳性，ELISA1例假阴性，三者符合率很高。这样(血清标本分别进行20倍、30倍稀释)检测结果基本符合HBV感染后的血清学标志物模式。
2.4.5 三种方法阴阳结果经配对资料的卡方检验，差异均无显著性(P>0.05)。就随机样本而言，三种方法结果符合率都很高，就临界值样本，ELISA和MEIA假阴性、假阳性反应明显高于TRFIA法；灵敏度和特异性普遍低于TRFIA法。究其原因，可能与前两种方法与TRFIA法反应原理不同有密切关系。
3 讨论
ELISA和MEIA种方法比较： HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb 、HBcAb结果符合率分别为99.00%、99.00%、98.00%、99%、 99.00%。灵敏度分别为100%、100%、96.67%、91.67%、98.00%；特异性分别为100%、98.18%、98.57%、100%、100%。说明两种方法灵敏度相似，检出限度基本一致,能检测到低浓度的HBsAg，能初步解决隐源性肝炎中HBV标志物检测的问题。有报道[4]两种方法结果符合率分别为96%、97%、98%、89%和93%，与本实验室结果符合率基本一致。
50份患者血清TRFIA法和ELISA法检测结果诊断符合率分别为:HBsAg 98.00%、HBsAb 87.00%、HBeAg 97.00%、HBeAb 90.00%、HBcAb 94.00%。广州第一人民医院检验科雷秀霞等通过以MEIA为标准TRFIA和ELISA法相比较得出诊断符合率分别为HBsAg 99.41%、HBsAb 94.12%、HBeAg 98.80%、HBeAb 93.53%、HBcAb 91.76%。 上海长征医院试验诊断科通过TRFIA和ELISA法相比较得出诊断符合率[5]分别为HBsAg 99.50%、HBsAb86.86%、HBeAg 99.50%、HBeAb 75.40%、HBcAb 92.10%。与本实验室结果基本一致，差异无显著性(P>0.05)。
我室TRFIA和MEIA检测结果诊断符合率 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb分别为98.00%、92.00%、98.00%、94.00%和97.00%，北京航天医院检验科[6]TRFIA和MEIA相比较得出诊断率分别为HBsAg 100%、HBsAb 94.00%、HBeAg 97.70%、HBeAb 91.00%、HBcAb 95.50%，与本实验室结果一致(P>0.05)。
一般临床上只有HBsAg阳性时，才检出HBeAg阳性。但是，通过TRFIA定量能更早的检出疾病过程中低浓度的HBeAg和HBeAb，证明临床中少部分经ELISA或MEIA检测仅HBsAg和HBcIgG阳性模式的患者其实为HBeAg假阴性和(或)HBeAb假阴性，高达近50%左右。文献[7]报告HBeAg假阴性率44.12%和HBeAb假阴性率41.18%，仅少部分可能为病毒变异的结果。研究发现，HBsAg和HBcAb浓度显著高于正常，ELISA及TRFIA符合率为100%，HBsAb浓度明显低于正常，两者符合率100%；而HBeAg和HBeAb浓度仅稍高于正常，ELISA易出现假阴性。而部分经ELISA、MEIA检测为“大三阳”、“小三阳”的病例，其真实情况经TRFIA定量表现为HBeAg和HBeAb同时存在，甚至HBsAb也低浓度存在。
操作中应注意的问题：试剂盒的质量如包被板(微孔)的质量，微孔板的吸附强度、透光度、均一性都严重影响检验的结果；有的生产商为追求利润选择质量不十分可靠的微孔板，所以板间差、孔间差、防潮解等问题要引起操作者的注意；样本的采集、运送、处置、样本的加量与稀释、保存(防止溶血、污染、暴露、效价等)；样本试剂的其他条件如酶标抗体的保存，加样准确性、交叉污染等；洗涤是质量保证的重要环节，注意交叉污染；温育(浴)、底物、计算、仪器判读等等；严格按厂家试剂盒说明书操作，包括试剂加量、洗涤次数、温浴(孵育)时间、温度、显色时间、读数时间、阴阳对照状态、仪器设备的稳定性等，要随时掌握仪器的正确性。要应用批批检检定合格的诊断试剂，检测工作做到规范化(严格按SOP文件规程)，需操作者专业、严谨、严肃、严格处置每一环节。
造成假阴性的情况为：当感染者的水平低于产品试剂灵敏度的极限时(如早期血清转化样本)；特殊HBV病毒变异株感染样本所具有的抗原或抗体不与产品包被的抗体或抗原起反应所致；个别特殊病人样本造成的无反应性；样本处置不当造成的检测误差时。由于TRFIA可以定量，相对可检出低浓度的HBV-M指标，造成假阴性或漏检相对较少。
ELISA法仍是目前国内检测HBV感染血清学应用较多的方法。缺点是：(1)无法定量；(2)灵敏度较低(0.5ng/ml)；(3)由检测原理带来的前带现象无法解决：ELISA试验中强阳性漏检是由于HBsAg过剩造成的(前)带现象(即HooK现象)；(4)易污染，无法完成HBV感染的动态观察以及低水平HBV感染指标的检测。
AXSYM全自动酶免发光分析系统微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测HBV感染血清学标志物是公认的诊断HBV感染的方法。特点是：(1)全自动；(2)操作时环境不易被污染；(3)相对成本较高；(4)不易推广。虽然免疫胶体金检测技术或(及)IBT(Immuno-blot Test，免疫斑点试验)和免疫层析检测技术可大大缩短检测时间，且不需特殊设备，操作简单，但灵敏度欠佳，假阳性问题难以克服。
TRFIA是近十年发展起来的一种无环境污染的超敏的微量免疫检测分析技术，其灵敏度高达10-18，线性范围宽(10-12～10-18mol/L)，高稳定性(<±1%)，较放射免疫分析(RIA)高出3个数量级。TRFIA实际上是在荧光分析的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析方法，以镧系元素为标记物，又称“解离-镧系荧光免疫分析”(dissociation enhancement lanthanidc fluoro-immunoassay，DELFIA)。在传统的异硫氰酸荧光素标记的荧光免疫分析中，其激发光波长和荧光光谱的Stokes移位较小，仅28nm，有由于激发光谱和发射光谱常有部分重叠，在测量时，不可避免产生干扰。而用镧系元素标记抗原抗体的荧光免疫分析则利用了波长和时间两种分辨技术，因稀土离子本身激发光谱宽(300～500nm)荧光发射光谱窄(甚至不足10nm)，通过时间延迟，去除非特异荧光干扰，在固定时间检测特异荧光，解决了自然背景干扰问题，明显提高检测灵敏度，并通过激发光与发射光之间较大的Stokes移位，很容易对激发光和发射光进行波长分辨，明显排除了非特异荧光的干扰，提高了光谱的分辨率，使特异性明显增强。由于TRFIA上述特点，使其测定的灵敏度、准确度及精密度均赶上甚至超过RIA，应用免疫学手段测定HBV特异性抗原抗体是HBV感染诊断的主要手段，而TRFIA技术的出现为感染诊断提供了新工具，成为近20年来发展起来的非RIA分析中最有前途的分析方法之一。其灵敏度、准确度及精密度都远远优于一般的ELISA和MEIA法。
4 应用
4.1 TRFIA定量检测HBV-M(俗称乙型肝炎两对半)临床应用及意义 血清乙型肝炎五项标志物定性测定始于80年代中期,对乙型肝炎的疾病诊断,病程监测,疗效观察起到了一定的作用。随着临床医学的迅速发展,定性检测已远远不能满足临床及患者的要求。由于受检测抗原抗体“定性”结果不是“阴性”就是“阳性”,只能作程序式的、机械的判断,对某些结果不能做出合理的解释且存在较大缺陷,无法动态观察病情和疗效变化,为临床所提供的信息有限。随着临床医学检验中新型标记方法的建立(如用镧系元素的原子作为标记物的时间分辨荧光分析技术 ),乙型肝炎五项病毒指标定量测定成为可能，大大弥补了酶标(ELISA)定性测定的不足之处。
4.1.1 大大提高了检测的灵敏度 TRFIA检测HBsAg灵敏度可达0.0625ng/ml(至少0.2ng/ml)，而ELISA检测HBsAg灵敏度是0.5ng/ml(甚至达2ng/ml)，也即只有血清中HBsAg的达到0.5ng/ml酶标才会呈阳性。而两对半定量五项指标TRFIA的综合应用较以往定性检查更加灵敏准确。
(1)急性乙型肝炎早期：TRFIA定量能及早检出HBsAg，确证HBV感染，几乎能与preS1同时检测，在病程观察中大大缩短“窗口期”(window of opportunity，机会性窗口)时间，而酶标在乙型肝炎早期检测往往HBsAg呈阴性。而急性潜伏期HBsAg先于丙氨酸氨基转移酶(ALT)和临床症状的出现。同时，已经证实HBsAg可不经血液而经口传染，故测定血中的HBsAg及HBsAb，对于乙型肝炎的防止和流行病学调查有重要的意义。因此，TRFIA极大地提高了检测的灵敏度，在急性乙型肝炎早期能及早检出HBsAg，确证HBV感染，大大缩短窗口期。
(2)慢性乙型肝炎：一些患者由于缺乏对HBV[HBV具有外衣壳抗原(包括HBsAg，pres1，pres2)和内衣壳抗原(包括HBcAg，HBeAg)]包膜蛋白的免疫应答，HBsAg(属外衣壳蛋白中主要蛋白)表达较低(如无症状携带者)，酶标检测可出现HBsAg和HBcAb均阴性结果，而TRFIA技术则可避免这些情况的出现，为正确判定病情提供依据。
(3)如病毒发生变异后，表达量过低，常规ELISA测不出抗原，而TRFIA定量有极高的灵敏度，可发现并极有可能检测出HBsAg和HBsAb，国内外学者研究表明HBsAg的免疫应答与肝细胞损伤有一定关系。血清中HBsAg含量和病人对HBsAg细胞免疫成反比关系，而肝功能改变则与此种细胞免疫成正比。定量HBsAg测定是反映这一关系的唯一手段。
(4)可发现低浓度HBsAg携带者。特别是一些群体如医护工作者、病人家属等，由于长期接触，但又非直接经血传播感染成急性乙型肝炎，而是长期少量感染，并刺激机体产生一定免疫力，可呈低浓度感染，特别应当引起人们的足够重视，密切关注并采取措施防止发展为慢性乙型肝炎或慢性携带者。因病人血清中HBsAg含量高低与疾病发展的严重程度并不呈正比。HBV有特定的潜伏期，以后进入疾病的活动期，严重的可以有明显的临床症状和体征。但大多情况下，病人的临床症状很轻微，或者是从血清中可以检出病毒血症，但经常无任何临床症状。而HBV可产生慢性的终生隐性感染(特点为病毒水平较低或呈间歇性，终生的慢性感染可能是肝癌的发生因素之一)，近年来，虽对输血传染病加强控制，但由于当前科技水平的限制，早期传染病存在病毒感染“窗口期”仍很难检出来，极少受血者还会因输血而获得传染病的危险。所以：① 无症状携带者或机会性“窗口”(病毒感染到抗体转阳这段时间)的检出尤为重要；② 作为献血员、炊事员、保育员特别是血制品、血液透析(Hemodialysis, HD or Hemofiltration, HF，间歇血流)、PE(plasma exchange，)、TBCE(therapeutic blood components-exchange，治疗性血液成分置换术)及器官移植，输血[尤新鲜血<3天，新鲜血各种成分抗原性强，有大量存活的淋巴细胞，易引起输血反应及增加发生移植物抗宿主病GVHD(主要发生在亲属间输血)的危险,梅毒螺旋体等尚存活]及血液制品(如洗涤红细胞Washed Red blood Cells,W-RBC)仍可传播HBV和HCV等具有传播疾病危险的过筛检测；输血和输血液制品都有传播疾病的危险，一般常见主要为PTH(Post-transfusion hepatitis，输血后肝炎)和输血并发症(Complication of Blood Transfusion，CBT)：其包括有HAV(正处于HAV血症的献血者血液亦具有传染性)、HBV、HCV、HDV(混合血制品)、HGV、TTV(transfusion throw-smitten virus 输血后肝炎相关新型病毒，辛肝)、EBV、CMV(human cytomegalovirus，巨细胞病毒)以及HIV(Transfusion Associated Acquired Immunodeficiency Syndrome,TR-AIDS，输血相关性艾滋病)、TP(Treponema Pallidum or Syphilis，梅毒)、HTLV-I、II(T淋巴白细胞病毒I、II型)、HTV(淋巴细胞病毒感染)、疟疾、黑热病、回归热、丝虫病、弓形体病等输血相关性疾病。而HD或HF是目前治疗尿毒症的主要手段,传染性肝炎是透析病人中的一个非常突出的问题,虽然乙型肝炎得到有效控制,但其他类型肝炎病毒的检测指标和手段较为单一,PCR法又不能大规模普及,其他类型肝炎病毒感染问题变的相对突出而明显,甚至出现几种肝炎病毒重叠感染现象,尤以HCV为主且感染率高； ③ 同时，作为暴露后预防(post-exposure prophylaxis，PEP)等的重要指标； ④ 也可作为婚前体检及是否引起母婴传播的指标； ⑤ 也可作为临床治疗药物疗效和物品是否污染的指标。 例如牙科手机(Dental Handpieces)是口腔科最常用的工具，直接接触患者的唾液、血液等污染物，可传播各种病原微生物，临床使用后，HBsAg携带率高达30%，既是口腔科交叉感染的重要传播媒介，又是医院管理的薄弱环节[8]。 已证实HBsAg可不经血液而经口传染，故测定HBsAg及HBsAb对于肝炎的治疗和流行病学调查具有重要的意义。随着TRFIA技术的发展与推广，这一系列的检测将定量化，具有现实而深远的客观的近期及远期社会意义。 ⑥ 可作为试剂盒质量和敏感性评价的筛检方法。
例如TRFIA灵敏度可达0.0625ng/ml(至少0.2ng/ml)，而ELISA、MEIA检测HBsAg灵敏度理论上要求是0.5ng/ml，但实际工作中有的试剂厂家试剂盒甚至达到2ng/ml时才表现为阳性反应。另外，HBsAg有好几个抗原决定簇，因此就构成了不同的型或亚型，所有的HBsAg都含有a抗原，其次是d抗原、r抗原和w抗原，而d、y不存在同一HBsAg中，换言之，一种HBsAg，非ad即dy,不会d、y同时存在，r、w抗原也同样，因此HBsAg至少存在4个亚型，即adw、ayw、adr、ayr ,其中以adw较多见，adr很少见。所以，诊断试剂所包被的HBsAg的成分也是影响受检者的检出率状况的因素之一。
4.1.2 动态观察疗效和病情监测 病情的发生、发展、疗效、预后是一个动态变化的过程，定量检测HBV-M各项标志物的浓度变化可对乙型肝炎的病程、治疗、预后能起到一个全程动态检测的作用，能够为医生对病情疗效做出合理的解释提供依据，指导治疗。
(1)定量分析HBsAg和HBsAb的浓度变化，可以预见急性乙型肝炎是否处于恢复期。如HBsAg浓度降低，HBsAb的浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展。反之，HBsAg浓度处于叫高水平或上升趋势，而HBsAb一直处于较低水平，则容易发展为慢性乙型肝炎或病毒携带者。但HBsAg和HBsAb同时阳性，也应考虑受不同HBV亚型的感染的可能。
(2)利于慢性活动性乙型肝炎(CAH)和非活动性乙型肝炎(IH)的判断。非活动性慢性乙型肝炎各项指标相对稳定，活动性乙型肝炎往往呈进行性变化。但对于HBV-M五项指标都阳性的情况，应综合分析，常常见于一种亚型的HBsAg及异型的HBsAb；而血清中从HBsAg转化HBsAb为的过程则少见。
(3)定量分析HBeAg和HBeAb的浓度变化，可反映病情变化和治疗效果。定量测定能明确HBeAg向HBeAb转换时期，表现为HBeAg浓度下降和HBeAb升高的过程，高浓度HBeAg还可间接提示病毒处于高复制状态，具有较高的传染性。在大多数情况下，HBeAg仅见HBsAg阳性的患者血清中，与Dane颗粒的出现的时间相平行，而且与HBV-DNA聚合酶在血液中的消长情况一致。急性肝炎(AH)和慢性活动肝炎(CAH)患者血清中大多数可检出HBeAg。HBeAg同样可刺激机体产生HBeAb,通常在HBsAg滴度降低，HBeAg消失后出现；一般认为，HBeAb的出现表示传染性低，预后良好，而高浓度的HBeAb一方面提示病情好转，而在某些时候(如肝功能指标很差时)则可能与肝坏死、肝硬化(HC)、肝癌(HCC)有关。但近年来我国学者研究发现，血清HBeAb阳性患者与HBeAg阳性的患者的肝细胞内分子杂交阳性率分别是65%和77%，二者基本一致。说明HBeAb阳性的患者中，约2/3病例仍有HBV复制。由于HBeAg具有独特的抗原性，是患者具有强传染性的标志之一，通过免疫扩散，得到三种亚型e1﹑e2﹑e3，HBeAg阳性中，e3占44%，HbeAg较HBsAg出现晚，又比HBsAg消失早，所以一般临床上只有HBsAg阳性时，才检出HBeAg阳性。但是，通过TRFIA定量能更早地检出疾病过程中低浓度的HBeAg和HBeAb，证明临床中少部分经ELISA或MEIA检测仅仅HBsAg和HBcIgG阳性模式的患者其实为HBeAg假阴性和(或)HBeAb假阴性。
(4)HBcAb浓度的高低可反映病毒感染的状态。HBcAb是HBV最早在感染后出现的标志抗体，效价高，持续时间长，甚至终生存在。高滴度HBcAb提示HBV在复制，乙型肝炎急性感染期；低滴度HBcAb阳性提示既往感染过HBV；恢复期浓度也降低。而慢性乙型肝炎呈HBcAb持续高浓度，所以低浓度HBcAb一般为恢复期或既往感染(急性乙型肝炎“窗口期”也可呈低浓度表现)。过去一般认为HBcAb对机体无保护力，但现在一般人认为有一定抵御HBV侵袭能力，有一定的保护作用。所以，HBcAb可以作为急性乙型肝炎“窗口期”的辅助诊断；献血员的筛选(仅查HBsAg远远不够，必须加查HBcAb，尤当其滴度高时不宜作为献血员)；是流行病学调查的良好指标；观察疫苗的安全性(如接种后产生HBcAb则认为该批疫苗不纯，不宜选用)。乙型肝炎病毒感染机体，机体首先产生以免疫球蛋白HBcAbIgM为主的免疫球蛋白，以后才是HBcAbIgG免疫球蛋白。急性乙型肝炎其免疫球蛋白HBcAbIgM 100%均为阳性，甚至当HBsAg是阴性时，HBcAbIgM就已为阳性，而成为早期诊断急性乙型肝炎“窗口期”的唯一指标；作为D型肝炎鉴别诊断，当HBsAg阳性，而且临床肝功损害明显，但HBcAbIgM为阴性，就应考虑是D型肝炎病毒(δ因子，HDV)感染；对于乙型肝炎预后的判断，2到3个月后HBcAbIgM滴度下降，预后佳，否则3个月后，迟迟不降，提示转为慢性乙型肝炎，另外肝癌病人中HBcAbIgM阳性率很高；对慢性是否处于活动期的最佳指标，有助于区分新近感染还是既往感染。解放军302医院教授张霞认为高滴度表达，常见于急性期，爆发性乙型肝炎和慢性活动性肝炎；低滴度阳性，常见于慢性迁延性肝炎，慢性活动性肝炎稳定期及病毒携带者，所以同时测定二种免疫球蛋白在实际工作中显得尤为重要。
(5)HBV-DNA有4个开放读码框，即前C/C区、P区、前S/S区、X区。HbeAg是C基因编码的蛋白质，存在高度变异，此种变异影响HBV合成分泌HbeAg而不表达HbeAg，但不影响其复制。HBV-M虽然可以反映患者体内病毒的复制过程，但其不能完全准确地反映HBV的复制状况。由于前C区基因突变,HBeAg不表达，很难判定HBV是否复制病毒。根据对HBV-DNA前C基因突变的研究，按HBeAg和HBeAb状况分为两类肝炎：一类为HBeAg阳性慢性肝炎，由于HBV野生型感染引起，其自然史分HBeAg阳性期和HBeAb阳性期。TRFIA定量测定能明确检测HBeAg向HBeAb转化的时期，即表现为HBeAg浓度(NCU)的下降和HBeAb浓度(NCU)的上升的过程。另一类为HBeAb阳性的肝炎，主要由前C基因突变株HBV感染所致，亦称异型慢性肝炎。始终不出现HBeAg，但HBV-DNA进行性复制，HBsAg亦在高浓度处变动；与前者HBeAg阳性慢性肝炎中的转化期比较，HBV-M各项指标均呈小三阳，但后者主要表现在HBsAg高浓度，忽高忽低的ALT值和HBV-DNA始终阳性。此类病人往往对干扰素，拉米呋啶治疗效果不佳。如长期HBeAb阳性而不阴转，提示容易诱发肝癌。
乙型肝炎病毒变异的因素有：(1)病毒本身的变异。文献报道[10]部分慢性YIDD及YVDD变异感染者体内HBV株自身存在C区变异，是由于宿主抵抗病毒的免疫压力造成病毒逃避而发生变异。 (2)应用药物后的突变。应用干扰素后对病毒产生了强烈的免疫反应，病毒为了逃避被免疫反应所吞噬，因而发生了基因变异。应用拉米呋啶后病毒会发生YIDD和YVDD变异,就是病毒基因序列中的氨基酸成分发生了改变，使病毒产生突变株。 (3)疫苗接种后的基因突变。据报道主要指母亲为HBV携带者，分娩后的子女给予乙肝疫苗接种后仍有10%～20%的免疫失败，就是因为HBV发生了S基因区变异[11]。 (4)乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)应用后的变异。突变发生在HBIG的作用靶位，即S基因区，突变株的抗原性和免疫原性都发生了改变，无法被原来的HBsAb所识别和清除，造成HBV继续感染、结合和复制。我室对经ELISA、MEIA检测HBV-M五项指标全部为阴性的80例标本由HBV-M、PCR-DNA定量检测确证2例表现为“小三阳”，4例为HBsAb为阳性，1例为HBsAb和HBeAb、HBcAb，1例为单纯HBsAg阳性，而PCR-DNA在104 copies/ml。1例HBcAb-IgM阳性而ELISA、MEIA检测HBV-M全阴性，而经TRFIA定量其为“小三阳”模式，而且HBV-DNA-PCR为低病毒载量104copies/ml。因此，通过TRFIA定量测定更能准确地反映出HBV-M标志物的表达结果的具体分布情况。我们主张ELISA或MEIA定性HBV-M五项指标全为阴性的样本，建议其进一步做TRFIA和(或)HBV-DNA-PCR定量测定。可见只有HBV-M、TRFIA、HBV-DNA-PCR定量同时进行分析才能比较准确地了解HBV感染的情况和复制情况，从而具体判定其真实情况。而斑点杂交和PCR定性均不能反映病毒含量的动态变化，难以对病毒药物的疗效做出正确的判断。核酸技术、基因芯片、生物芯片技术是分子生物技术发展的结果，但必须做到操作的规范化，严格掌握应用范围，并且和临床的其他资料的分析相结合，才能正确判断检测结果。
4.2 TRFIA和定量PCR技术互相补充 尽管HBV-DNA定量PCR测定可以直接反映血液中病毒复制状态，具有很多临床应用价值，但并不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒状态。HBV-DNA阴性并不能完全代表体内HBV已被清除，结合HBV-M五项指标更能客观反映体内HBV病毒状态，正确判断预后和治疗。如果HBV-DNA阴性而HBsAg、HBeAg或HBeAb及HBcAb浓度还较高，提示并未完全痊愈，有可能病毒再次出现复制状况，尚须密切关注。如果HBV-DNA阴性而HBsAg、HBeAg或HBeAb及HBcAb浓度均很低或阴性并持续一段时间，提示可能完全痊愈，预后效果良好。乙型肝炎患者进行抗病毒治疗时，血清中的病毒核酸含量是反映病毒数量和复制活跃程度的最可靠的直接指标，因此，病毒含量的检测显得必不可少，是能确实反映动态观察药物疗效的确切指标，特别是对于HBeAg阴性的患者。但长期应用贺普丁治疗HBV-DNA阳性的患者必须应用PCR来测定是否产生YMDD变异，但采用测序方法操作繁琐而且成本高，不宜广泛应用。应用YIDD、YVDD特异酶切位点PCR技术，可准确检出血清中的YIDD及YVDD变异，与测序结果完全相同，该方法成本低，适合临床用于监控抗病毒治疗。PCR方法具有敏感性高，可检测出极微量的核酸，但不同的检测系统的敏感性即检测的最低病毒核酸量仍有差异，理论上能检出一个拷贝的基因，因存在操作技术等方面的影响，其实际敏感性一般在几百个copies/ml左右，由于影响其测定的因数颇多，常易出现假阳性和假阴性结果，因此必须据临床上其他检(监)测资料，进行综合分析。一般HBeAg、HBV-DNA为病毒复制指标，HBsAg、HbeAg、HBcAb为病毒感染指标，当HBeAg、HBV-DNA均为阳性时，证明病毒复制活跃，传染性强，应采取积极治疗。当HBsAg、HBeAb、HBcAb均为阳性，为病毒性肝炎恢复期，此时病毒复制虽不活跃，但HBV-DNA检测仍为阳性，说明病毒依然存在，也应采取治疗，以提高免疫抗病毒治疗为主；而当HBV-DNA检测为阴性时，为恢复期，当各种指标证明人体内病毒已得到抑制，可以不用治疗；属于既往感染HBV并且现有保护性抗体HBsAb的确存在及HBV-DNA阴性时，说明已趋于好转和(或)临床治愈，可不用药。在我国感染HBV人群基因型中存在B型、C型之分，因此感染HBV后不同HBV型与宿主作用的结果就有不同[9]。因而HBV-M表达结果就有多种情况出现。而目前，还不知道能否用病毒核酸含量作为病毒滴度的替代指标，评估传播危险，血浆病毒核酸含量只能反映外周血中细胞外病毒水平，不能反映血细胞和机体其他组织内病毒的含量。虽然较低病毒核酸含量可能提示较低滴度的暴露，但是并不能排除传播的可能，已有血浆病毒核酸含量低于检测限的病例发生母婴传播和导致正常人员职业感染的报道，职业暴露人员的免疫反应也是影响传播的因素之一。
因而，分析HBV感染者的病情状况和病毒复制状态和病毒变异程度以及职业暴露和传播风险评估时，不能光靠HBV-M，有必要结合HBV-DNA、HBV-M定量同时判定。
4.3 HBsAb的定量测定能够对抗体是否真正具有“中和”HBV的免疫力作出正确的评价，对乙型肝炎的预防起到监督作用。
做定量检测，可据HBsAb的含量判断机体对HBV的免疫状态及乙型肝炎疫苗的免疫效果。HBsAb的含量在10mIU/ml以上病人在用ELISA或MEIA检测就可呈“阳性”结果，但并不提示机体一定具有免疫力，而HBsAb的含量在10～100mIU/ml之间的样本定性为“阳性”，定性虽为“阳性”，但此时机体对HBV的免疫力较弱，甚至不能预防HBV感染，仍有感染HBV的危险。只有HBsAb的含量达100mIU/ml以上(或更高)时才可确定具有抵抗(同型)HBV入侵的作用。但也有例外，人们发现的许多HBV变异株，S基因的突变，会使乙型肝炎疫苗诱导的人体产生HBsAb的无效。HBsAb的含量越高，机体抵抗HBV入侵的能力越强，持续保护的时间越长。做定量测定，根据HBsAb的含量可判断机体对HBV免疫状态及乙型肝炎疫苗的免疫效果，HBsAb的含量较低，应该进行NID(即强化免疫，加强注射乙型肝炎疫苗)，使HBsAb的浓度提高到保护作用。同时，乙型肝炎疫苗接种后机体产生免疫力因个体差异而不同，有的可产生高浓度的并持续数十年。而有的人产生的抗体浓度不是很高，且持续时间也不长，数年后就逐渐消失，这部分人应及时关注HBsAb浓度的变化，必要时也应进行NID(但也有人认为机体在受到病毒感染时，会产生记忆反应，迅速提高免疫力)，否则，仍有可能感染HBV。因此定量测定HBsAb对乙型肝炎疫苗免疫力的评价和高危人群及职业暴露者预防免疫、免疫防疫都具有重要意义，尤其在少年儿童预防乙型肝炎方面。
在慢性肝病的治疗过程中，病人对了解自己病情的变化尤为关切。定量测定乙型肝炎血清标志物的浓度使病人能够对自己的病情有更清楚的了解，提高治疗信心，同时也加强对医生的信任度，有助于改善医患关系，利于疾病治疗。
综上所述，TRFIA技术作为一种灵敏度高，特异性及重复性好的无污染定量免疫测定方法，有着广泛的应用前景，随着社会经济的发展，应用各种非放射免疫标记、非发色酶标的自动化设备进行分析是检测技术发展的必然趋势，相信TRFIA技术在实验室将得到普及而且应用范围会越来越广。
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作者单位： 1 010031 内蒙古呼和浩特，呼和浩特市第二医院
(北京佑安医院呼市分院)肝病实验诊断科
2 028000 内蒙古通辽，通辽市医院检验科
(编辑：邓 锋), http://www.100md.com(刘金涛 曾显坤)
【关键词】 乙型肝炎病毒血清学标志物(HBV-M)；时间分辨荧光免疫技术(TRFIA)；微粒子酶免疫分析法(MEIA)；酶联免疫吸附试验(ELISA)
To investigate the measurement results and application of HBV-M
LIU Jin-tao, ZENG Xian-kun. The Second Municipal People’s Hospital of Huhhot,Inner Mongolia 010031,China
【Abstract】 Objective To investigate experimentally the application of the analysis technique of the time resolved fluoroimmunoassay in serum testing for the hepatitis B virus. And by comparing the consistence，sensitivity and specificity between the TRFIA，the MEIA and the ELISA in HBV-M determination and understand the accuracy and feasibility of the TRFIA method in HBV-M measurement. Methods By means of AT-2000 time resolved fluoroimmunoassay instrument and concomitant reagent to determine 200 serum samples of normal people from our hospital(control group randomized samples)and 50 serum(case group)distinct positive or threshold samples of patients for HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb and comparing the results with AXSYM MEIA.Results For the results of 50 serum samples of patients，the positive compatibility rate of the TRFIA and with the MEIA for HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb and HBcAb is 98.00%，92.00%，98.00%，94.00% and 97.00% respectively，sensitivity is 97.95%，100%，96.97%，95.83% and 98.00%，specificity is 98.08%，85.45%，98.57%，93.42% and 96.00%，and there was not significant difference (P>0.05) between two groups of results. the positive compatibility rate of the TRFIA and with the ELISA for HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb and HBcAb is 98.00%，87.00%，97.00%，90.00% and 94.00%，respectively，sensitivity is 97.96%，93.47%，96.55%，90.91% and 95.92%，specificity is 98.04%，81.48%，97.18%，89.74% and 92.16%.(P>0.05).And the positive compatibility rate of the MEIA and with the ELISA for HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb and HBcAb is 99.00%，99.00%，98.00%，98.00% and 99.00% respectively,sensitivity is 100%，100%，96.67%，91.67% and 98.00%，and specificity is 100%，98.18%，98.57%，100% and 100%.(P>0.05).Conclusion The results showed that the method of determining serological markers of hepatitis B virus by the time resolved fluoroimmunoassay with high sensitivity and good stability was cost-effective and suitable for China realistic conditions and being cheap could be used easily a routine method of quantitative assay for hepatitis B virus. The consistence and specificity and sensitivity of HBV-M measurement results by TRFIA are better than those by the MEIA and the ELISA. Some constructive views were raised and involved.It has an important clinical significance not only in evaluating the patient’s condition ,monitoring clinical treatment and curative effect and judging prognosis but also in vaccinating hepatitis B vaccine. It will be an ideal method to be spread during clinical practice.
【Key words】 HBV-M：hepatitis B virus serological marker；TRFIA：time resolved fluoroimmunoassay; MEIA：minute-particle enzyme immunity analysis；ELISA：enzyme-linked immunosorbent assay
自1970年Dane氏发现HBV(故称为Dane颗粒，是完整的乙型肝炎病毒体)以来，乙型肝炎仍是常见的感染性疾病(Infectious Diseases)之一，仅HBV携带者全世界就有2亿之多。HBV是乙型肝炎的病原体，乙型肝炎患者潜伏期、急性期及乙型肝炎病毒携带者的血液具有高传染性，接触极微量的(10-7～10-6ml)的血液即可引起感染。乙型肝炎危害极大，约10%的乙型肝炎转变为慢性肝炎(CH)，部分慢性活动性肝炎(CAH)转变为肝癌(HCC)。婴幼儿感染HBV易形成持续病毒携带者，HBV病毒携带者发生原发性肝癌的危险性更大。而我国又是乙型肝炎高感染国家，据统计，全国人口10%以上为HBsAg携带者，乙型肝炎病毒的总感染率为35.5%～61.1%，有报道[1]用目前常用的方法检测出HBsAg阴性的人群中，有11.0%HBV-DNA呈阳性反应，也就是说，用常规的检测方法可能有11.0%的漏检率，是因为抗原含量低于现行方法的可检出水平。应用免疫学手段检测HBV特异性抗原抗体是HBV感染诊断的重要方法之一，而TRFIA技术的出现为其提供了新的工具，对于低水平的HBV感染的检出及临床诊断和流行病学都有重要意义[2]。由于可进行定量分析，对药物疗效和病情监测都具有重要意义[3]。本实验用三种不同的方法检测了HBV-M，旨在探讨三种方法在日常生活工作中的可行性与相关性。现将实验结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 健康人血清 采用TRFIA、MEIA、ELISA对我院200例健康职工经HBV-M五项指标做定性(量)分析，随机抽取50例作为正常对照，年龄1～45岁。
1.1.2 乙型肝炎患者血清 用TRFIA、MEIA、ELISA对50例强阳性或临界值血清样本(来自我院住院及门诊)做HBV-M五项指标检测，年龄1/12岁～81岁。
1.1.3 质控血清 卫生部临检中心质量控制血清浓度分别为：0.2ng/ml，0.5ng/ml，1.0ng/ml，2.0ng/ml,5.0ng/ml；内蒙古临检中心质控血清：0.3ng/ml,1.0ng/ml,2.0ng/ml，5.0ng/ml。
1.2 诊断试剂、仪器与方法
1.2.1 诊断试剂与仪器 TRFIA分析法使用上海新波生物技术有限公司生产的ANYTEST2000型时间分辨荧光免疫检测系统和SYM-BIO BGATE2310全自动微孔洗涤机及配套试剂。MEIA分析法使用美国Abbott试剂和AXSYM 全自动酶免发光分析系统；ELISA法使用北京万泰药业公司及3V公司生产的试剂。洗板机为天石医疗用品制作所ZMX-998B型自动酶标洗板机；酶标仪为奥地利CliniBio 128C自动酶标仪和SHANDONG GAOMI CAIHONG ANALYTICAL INSTRUMENTS CO.LTD的GF-M2000 MICROPLATE READER。
1.2.2 方法 TRFIA(Time resolved fluoroimmuno assay，时间分辨荧光免疫技术)技术是以镧系元素铕化合物作为荧光标记物，利用这一荧光物质有长荧光寿命的特点，延长荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再进行测定，所得信号完全为长寿命镧系螯合物的荧光，从而有效地消除非特异本底荧光的干扰，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。
2 结果与分析
2.1 TRFIA和ELISA检测定性结果分布 见表1。由表1得：HBsAg：灵敏度48/(48+1)×100%=97.96%，特异性50/(50+1)×100%=98.04%，诊断符合率98.00%；同理：HBsAb：灵敏度为93.47%，特异性81.48%，诊断符合率97.00%；HBeAg：灵敏度为96.55%，特异性97.18%，诊断符合率97.00%；HBeAb：灵敏度为90.91%，特异性89.74%，诊断符合率90.00%；HBcAb：灵敏度为95.92%，特异性92.16%,诊断符合率94.00%。表1 TRFIA和ELISA检测定性结果
2.2 TRFIA和MEIA检测定性结果分布 见表2。 表2 TRFIA和MEIA检测定性结果分布由表2得：HBsAg灵敏度48/(48+1)×100%=97.95%；特异性51/(51+1)×100%=98.08%；诊断符合率98%；同理：HBsAb： 灵敏度为100%，特异性85.45%，诊断符合率92%；HBeAg：灵敏度为96.97%，特异性98.57%，诊断符合率98.00%；HBeAb：灵敏度为95.83%，特异性93.42%，诊断符合率94.00%；HBcAb：灵敏度为98.00%，特异性96.00%，诊断符合率97.00%。
2.3 ELISA和MEIA检测定性结果分布 见表3。表3 ELISA和MEIA检测定性结果分布由表3得：HBsAg： 灵敏度49/(49+0)×100%=100%；特异性51/(51+0)×100%=100%；诊断符合率99.00%；同理：HBsAb： 灵敏度为100%，特异性98.18%，诊断符合率99.00%；HBeAg：灵敏度为96.67%，特异性98.57%，诊断符合率98.00%；HBeAb：灵敏度为91.67%，特异性100%，诊断符合率98.00%；HBcAb：灵敏度为98.00%，特异性100%，诊断符合率99.00%。
2.4 分析比较
2.4.1 当CUTOFF值设置为≥0.3ng/ml时，HBsAg：TRFIA 1例阳性，表现为“小三阳”，而ELISA阴性，其浓度为0.4ng/ml，结果仅为HBeAb和HBcAb阳性，提示TRFIA由于相对敏感而检出，而MEIA与TRFIA基本一致。但就临界标本而言，TRFIA、ELISA、MEIA均存在一定的假阳性率、假阴性率分别为1.96%、2.04%。就随机样本而言，ELISA、MEIA则HBsAg 较易出假阳性、假阴性反应。实际工作中HBsAg的CUTOFF值设为0.5ng/ml。
2.4.2 当CUTOFF值设置为≥0.03NCU/ml时，TRFIA 法HBeAg2例阳性，而ELISA阴性，经过综合分析，这2例为真阳性。而MEIA仅有1例阳性，说明三种方法均有一定的漏检TRFIA法测HBeAg灵敏度、特异性、结果符合率就随机样本而言，要高于ELISA、MEIA。因本项目标本所选取大多为强阳性标本，故其灵敏度、特异性、结果符合率基本一致。
2.4.3 当CUTOFF值设置为≥10mIU/ml时，HBsAb三种方法均很好，阳性符合率都很高；当CUTOFF值设置为≥1.5NCU/ml时，HBeAb三种方法阳性率也都很高。但就临界标本而言，ELISA和MEIA出现假阳性和假阴性反应要高于TRFIA法且易漏检。
2.4.4 当CUTOFF值设置为≥0.095NCU/ml时，HBcAb：TRFIA 1例假阳性，ELISA1例假阴性，三者符合率很高。这样(血清标本分别进行20倍、30倍稀释)检测结果基本符合HBV感染后的血清学标志物模式。
2.4.5 三种方法阴阳结果经配对资料的卡方检验，差异均无显著性(P>0.05)。就随机样本而言，三种方法结果符合率都很高，就临界值样本，ELISA和MEIA假阴性、假阳性反应明显高于TRFIA法；灵敏度和特异性普遍低于TRFIA法。究其原因，可能与前两种方法与TRFIA法反应原理不同有密切关系。
3 讨论
ELISA和MEIA种方法比较： HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb 、HBcAb结果符合率分别为99.00%、99.00%、98.00%、99%、 99.00%。灵敏度分别为100%、100%、96.67%、91.67%、98.00%；特异性分别为100%、98.18%、98.57%、100%、100%。说明两种方法灵敏度相似，检出限度基本一致,能检测到低浓度的HBsAg，能初步解决隐源性肝炎中HBV标志物检测的问题。有报道[4]两种方法结果符合率分别为96%、97%、98%、89%和93%，与本实验室结果符合率基本一致。
50份患者血清TRFIA法和ELISA法检测结果诊断符合率分别为:HBsAg 98.00%、HBsAb 87.00%、HBeAg 97.00%、HBeAb 90.00%、HBcAb 94.00%。广州第一人民医院检验科雷秀霞等通过以MEIA为标准TRFIA和ELISA法相比较得出诊断符合率分别为HBsAg 99.41%、HBsAb 94.12%、HBeAg 98.80%、HBeAb 93.53%、HBcAb 91.76%。 上海长征医院试验诊断科通过TRFIA和ELISA法相比较得出诊断符合率[5]分别为HBsAg 99.50%、HBsAb86.86%、HBeAg 99.50%、HBeAb 75.40%、HBcAb 92.10%。与本实验室结果基本一致，差异无显著性(P>0.05)。
我室TRFIA和MEIA检测结果诊断符合率 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb分别为98.00%、92.00%、98.00%、94.00%和97.00%，北京航天医院检验科[6]TRFIA和MEIA相比较得出诊断率分别为HBsAg 100%、HBsAb 94.00%、HBeAg 97.70%、HBeAb 91.00%、HBcAb 95.50%，与本实验室结果一致(P>0.05)。
一般临床上只有HBsAg阳性时，才检出HBeAg阳性。但是，通过TRFIA定量能更早的检出疾病过程中低浓度的HBeAg和HBeAb，证明临床中少部分经ELISA或MEIA检测仅HBsAg和HBcIgG阳性模式的患者其实为HBeAg假阴性和(或)HBeAb假阴性，高达近50%左右。文献[7]报告HBeAg假阴性率44.12%和HBeAb假阴性率41.18%，仅少部分可能为病毒变异的结果。研究发现，HBsAg和HBcAb浓度显著高于正常，ELISA及TRFIA符合率为100%，HBsAb浓度明显低于正常，两者符合率100%；而HBeAg和HBeAb浓度仅稍高于正常，ELISA易出现假阴性。而部分经ELISA、MEIA检测为“大三阳”、“小三阳”的病例，其真实情况经TRFIA定量表现为HBeAg和HBeAb同时存在，甚至HBsAb也低浓度存在。
操作中应注意的问题：试剂盒的质量如包被板(微孔)的质量，微孔板的吸附强度、透光度、均一性都严重影响检验的结果；有的生产商为追求利润选择质量不十分可靠的微孔板，所以板间差、孔间差、防潮解等问题要引起操作者的注意；样本的采集、运送、处置、样本的加量与稀释、保存(防止溶血、污染、暴露、效价等)；样本试剂的其他条件如酶标抗体的保存，加样准确性、交叉污染等；洗涤是质量保证的重要环节，注意交叉污染；温育(浴)、底物、计算、仪器判读等等；严格按厂家试剂盒说明书操作，包括试剂加量、洗涤次数、温浴(孵育)时间、温度、显色时间、读数时间、阴阳对照状态、仪器设备的稳定性等，要随时掌握仪器的正确性。要应用批批检检定合格的诊断试剂，检测工作做到规范化(严格按SOP文件规程)，需操作者专业、严谨、严肃、严格处置每一环节。
造成假阴性的情况为：当感染者的水平低于产品试剂灵敏度的极限时(如早期血清转化样本)；特殊HBV病毒变异株感染样本所具有的抗原或抗体不与产品包被的抗体或抗原起反应所致；个别特殊病人样本造成的无反应性；样本处置不当造成的检测误差时。由于TRFIA可以定量，相对可检出低浓度的HBV-M指标，造成假阴性或漏检相对较少。
ELISA法仍是目前国内检测HBV感染血清学应用较多的方法。缺点是：(1)无法定量；(2)灵敏度较低(0.5ng/ml)；(3)由检测原理带来的前带现象无法解决：ELISA试验中强阳性漏检是由于HBsAg过剩造成的(前)带现象(即HooK现象)；(4)易污染，无法完成HBV感染的动态观察以及低水平HBV感染指标的检测。
AXSYM全自动酶免发光分析系统微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测HBV感染血清学标志物是公认的诊断HBV感染的方法。特点是：(1)全自动；(2)操作时环境不易被污染；(3)相对成本较高；(4)不易推广。虽然免疫胶体金检测技术或(及)IBT(Immuno-blot Test，免疫斑点试验)和免疫层析检测技术可大大缩短检测时间，且不需特殊设备，操作简单，但灵敏度欠佳，假阳性问题难以克服。
TRFIA是近十年发展起来的一种无环境污染的超敏的微量免疫检测分析技术，其灵敏度高达10-18，线性范围宽(10-12～10-18mol/L)，高稳定性(<±1%)，较放射免疫分析(RIA)高出3个数量级。TRFIA实际上是在荧光分析的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析方法，以镧系元素为标记物，又称“解离-镧系荧光免疫分析”(dissociation enhancement lanthanidc fluoro-immunoassay，DELFIA)。在传统的异硫氰酸荧光素标记的荧光免疫分析中，其激发光波长和荧光光谱的Stokes移位较小，仅28nm，有由于激发光谱和发射光谱常有部分重叠，在测量时，不可避免产生干扰。而用镧系元素标记抗原抗体的荧光免疫分析则利用了波长和时间两种分辨技术，因稀土离子本身激发光谱宽(300～500nm)荧光发射光谱窄(甚至不足10nm)，通过时间延迟，去除非特异荧光干扰，在固定时间检测特异荧光，解决了自然背景干扰问题，明显提高检测灵敏度，并通过激发光与发射光之间较大的Stokes移位，很容易对激发光和发射光进行波长分辨，明显排除了非特异荧光的干扰，提高了光谱的分辨率，使特异性明显增强。由于TRFIA上述特点，使其测定的灵敏度、准确度及精密度均赶上甚至超过RIA，应用免疫学手段测定HBV特异性抗原抗体是HBV感染诊断的主要手段，而TRFIA技术的出现为感染诊断提供了新工具，成为近20年来发展起来的非RIA分析中最有前途的分析方法之一。其灵敏度、准确度及精密度都远远优于一般的ELISA和MEIA法。
4 应用
4.1 TRFIA定量检测HBV-M(俗称乙型肝炎两对半)临床应用及意义 血清乙型肝炎五项标志物定性测定始于80年代中期,对乙型肝炎的疾病诊断,病程监测,疗效观察起到了一定的作用。随着临床医学的迅速发展,定性检测已远远不能满足临床及患者的要求。由于受检测抗原抗体“定性”结果不是“阴性”就是“阳性”,只能作程序式的、机械的判断,对某些结果不能做出合理的解释且存在较大缺陷,无法动态观察病情和疗效变化,为临床所提供的信息有限。随着临床医学检验中新型标记方法的建立(如用镧系元素的原子作为标记物的时间分辨荧光分析技术 ),乙型肝炎五项病毒指标定量测定成为可能，大大弥补了酶标(ELISA)定性测定的不足之处。
4.1.1 大大提高了检测的灵敏度 TRFIA检测HBsAg灵敏度可达0.0625ng/ml(至少0.2ng/ml)，而ELISA检测HBsAg灵敏度是0.5ng/ml(甚至达2ng/ml)，也即只有血清中HBsAg的达到0.5ng/ml酶标才会呈阳性。而两对半定量五项指标TRFIA的综合应用较以往定性检查更加灵敏准确。
(1)急性乙型肝炎早期：TRFIA定量能及早检出HBsAg，确证HBV感染，几乎能与preS1同时检测，在病程观察中大大缩短“窗口期”(window of opportunity，机会性窗口)时间，而酶标在乙型肝炎早期检测往往HBsAg呈阴性。而急性潜伏期HBsAg先于丙氨酸氨基转移酶(ALT)和临床症状的出现。同时，已经证实HBsAg可不经血液而经口传染，故测定血中的HBsAg及HBsAb，对于乙型肝炎的防止和流行病学调查有重要的意义。因此，TRFIA极大地提高了检测的灵敏度，在急性乙型肝炎早期能及早检出HBsAg，确证HBV感染，大大缩短窗口期。
(2)慢性乙型肝炎：一些患者由于缺乏对HBV[HBV具有外衣壳抗原(包括HBsAg，pres1，pres2)和内衣壳抗原(包括HBcAg，HBeAg)]包膜蛋白的免疫应答，HBsAg(属外衣壳蛋白中主要蛋白)表达较低(如无症状携带者)，酶标检测可出现HBsAg和HBcAb均阴性结果，而TRFIA技术则可避免这些情况的出现，为正确判定病情提供依据。
(3)如病毒发生变异后，表达量过低，常规ELISA测不出抗原，而TRFIA定量有极高的灵敏度，可发现并极有可能检测出HBsAg和HBsAb，国内外学者研究表明HBsAg的免疫应答与肝细胞损伤有一定关系。血清中HBsAg含量和病人对HBsAg细胞免疫成反比关系，而肝功能改变则与此种细胞免疫成正比。定量HBsAg测定是反映这一关系的唯一手段。
(4)可发现低浓度HBsAg携带者。特别是一些群体如医护工作者、病人家属等，由于长期接触，但又非直接经血传播感染成急性乙型肝炎，而是长期少量感染，并刺激机体产生一定免疫力，可呈低浓度感染，特别应当引起人们的足够重视，密切关注并采取措施防止发展为慢性乙型肝炎或慢性携带者。因病人血清中HBsAg含量高低与疾病发展的严重程度并不呈正比。HBV有特定的潜伏期，以后进入疾病的活动期，严重的可以有明显的临床症状和体征。但大多情况下，病人的临床症状很轻微，或者是从血清中可以检出病毒血症，但经常无任何临床症状。而HBV可产生慢性的终生隐性感染(特点为病毒水平较低或呈间歇性，终生的慢性感染可能是肝癌的发生因素之一)，近年来，虽对输血传染病加强控制，但由于当前科技水平的限制，早期传染病存在病毒感染“窗口期”仍很难检出来，极少受血者还会因输血而获得传染病的危险。所以：① 无症状携带者或机会性“窗口”(病毒感染到抗体转阳这段时间)的检出尤为重要；② 作为献血员、炊事员、保育员特别是血制品、血液透析(Hemodialysis, HD or Hemofiltration, HF，间歇血流)、PE(plasma exchange，)、TBCE(therapeutic blood components-exchange，治疗性血液成分置换术)及器官移植，输血[尤新鲜血<3天，新鲜血各种成分抗原性强，有大量存活的淋巴细胞，易引起输血反应及增加发生移植物抗宿主病GVHD(主要发生在亲属间输血)的危险,梅毒螺旋体等尚存活]及血液制品(如洗涤红细胞Washed Red blood Cells,W-RBC)仍可传播HBV和HCV等具有传播疾病危险的过筛检测；输血和输血液制品都有传播疾病的危险，一般常见主要为PTH(Post-transfusion hepatitis，输血后肝炎)和输血并发症(Complication of Blood Transfusion，CBT)：其包括有HAV(正处于HAV血症的献血者血液亦具有传染性)、HBV、HCV、HDV(混合血制品)、HGV、TTV(transfusion throw-smitten virus 输血后肝炎相关新型病毒，辛肝)、EBV、CMV(human cytomegalovirus，巨细胞病毒)以及HIV(Transfusion Associated Acquired Immunodeficiency Syndrome,TR-AIDS，输血相关性艾滋病)、TP(Treponema Pallidum or Syphilis，梅毒)、HTLV-I、II(T淋巴白细胞病毒I、II型)、HTV(淋巴细胞病毒感染)、疟疾、黑热病、回归热、丝虫病、弓形体病等输血相关性疾病。而HD或HF是目前治疗尿毒症的主要手段,传染性肝炎是透析病人中的一个非常突出的问题,虽然乙型肝炎得到有效控制,但其他类型肝炎病毒的检测指标和手段较为单一,PCR法又不能大规模普及,其他类型肝炎病毒感染问题变的相对突出而明显,甚至出现几种肝炎病毒重叠感染现象,尤以HCV为主且感染率高； ③ 同时，作为暴露后预防(post-exposure prophylaxis，PEP)等的重要指标； ④ 也可作为婚前体检及是否引起母婴传播的指标； ⑤ 也可作为临床治疗药物疗效和物品是否污染的指标。 例如牙科手机(Dental Handpieces)是口腔科最常用的工具，直接接触患者的唾液、血液等污染物，可传播各种病原微生物，临床使用后，HBsAg携带率高达30%，既是口腔科交叉感染的重要传播媒介，又是医院管理的薄弱环节[8]。 已证实HBsAg可不经血液而经口传染，故测定HBsAg及HBsAb对于肝炎的治疗和流行病学调查具有重要的意义。随着TRFIA技术的发展与推广，这一系列的检测将定量化，具有现实而深远的客观的近期及远期社会意义。 ⑥ 可作为试剂盒质量和敏感性评价的筛检方法。
例如TRFIA灵敏度可达0.0625ng/ml(至少0.2ng/ml)，而ELISA、MEIA检测HBsAg灵敏度理论上要求是0.5ng/ml，但实际工作中有的试剂厂家试剂盒甚至达到2ng/ml时才表现为阳性反应。另外，HBsAg有好几个抗原决定簇，因此就构成了不同的型或亚型，所有的HBsAg都含有a抗原，其次是d抗原、r抗原和w抗原，而d、y不存在同一HBsAg中，换言之，一种HBsAg，非ad即dy,不会d、y同时存在，r、w抗原也同样，因此HBsAg至少存在4个亚型，即adw、ayw、adr、ayr ,其中以adw较多见，adr很少见。所以，诊断试剂所包被的HBsAg的成分也是影响受检者的检出率状况的因素之一。
4.1.2 动态观察疗效和病情监测 病情的发生、发展、疗效、预后是一个动态变化的过程，定量检测HBV-M各项标志物的浓度变化可对乙型肝炎的病程、治疗、预后能起到一个全程动态检测的作用，能够为医生对病情疗效做出合理的解释提供依据，指导治疗。
(1)定量分析HBsAg和HBsAb的浓度变化，可以预见急性乙型肝炎是否处于恢复期。如HBsAg浓度降低，HBsAb的浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展。反之，HBsAg浓度处于叫高水平或上升趋势，而HBsAb一直处于较低水平，则容易发展为慢性乙型肝炎或病毒携带者。但HBsAg和HBsAb同时阳性，也应考虑受不同HBV亚型的感染的可能。
(2)利于慢性活动性乙型肝炎(CAH)和非活动性乙型肝炎(IH)的判断。非活动性慢性乙型肝炎各项指标相对稳定，活动性乙型肝炎往往呈进行性变化。但对于HBV-M五项指标都阳性的情况，应综合分析，常常见于一种亚型的HBsAg及异型的HBsAb；而血清中从HBsAg转化HBsAb为的过程则少见。
(3)定量分析HBeAg和HBeAb的浓度变化，可反映病情变化和治疗效果。定量测定能明确HBeAg向HBeAb转换时期，表现为HBeAg浓度下降和HBeAb升高的过程，高浓度HBeAg还可间接提示病毒处于高复制状态，具有较高的传染性。在大多数情况下，HBeAg仅见HBsAg阳性的患者血清中，与Dane颗粒的出现的时间相平行，而且与HBV-DNA聚合酶在血液中的消长情况一致。急性肝炎(AH)和慢性活动肝炎(CAH)患者血清中大多数可检出HBeAg。HBeAg同样可刺激机体产生HBeAb,通常在HBsAg滴度降低，HBeAg消失后出现；一般认为，HBeAb的出现表示传染性低，预后良好，而高浓度的HBeAb一方面提示病情好转，而在某些时候(如肝功能指标很差时)则可能与肝坏死、肝硬化(HC)、肝癌(HCC)有关。但近年来我国学者研究发现，血清HBeAb阳性患者与HBeAg阳性的患者的肝细胞内分子杂交阳性率分别是65%和77%，二者基本一致。说明HBeAb阳性的患者中，约2/3病例仍有HBV复制。由于HBeAg具有独特的抗原性，是患者具有强传染性的标志之一，通过免疫扩散，得到三种亚型e1﹑e2﹑e3，HBeAg阳性中，e3占44%，HbeAg较HBsAg出现晚，又比HBsAg消失早，所以一般临床上只有HBsAg阳性时，才检出HBeAg阳性。但是，通过TRFIA定量能更早地检出疾病过程中低浓度的HBeAg和HBeAb，证明临床中少部分经ELISA或MEIA检测仅仅HBsAg和HBcIgG阳性模式的患者其实为HBeAg假阴性和(或)HBeAb假阴性。
(4)HBcAb浓度的高低可反映病毒感染的状态。HBcAb是HBV最早在感染后出现的标志抗体，效价高，持续时间长，甚至终生存在。高滴度HBcAb提示HBV在复制，乙型肝炎急性感染期；低滴度HBcAb阳性提示既往感染过HBV；恢复期浓度也降低。而慢性乙型肝炎呈HBcAb持续高浓度，所以低浓度HBcAb一般为恢复期或既往感染(急性乙型肝炎“窗口期”也可呈低浓度表现)。过去一般认为HBcAb对机体无保护力，但现在一般人认为有一定抵御HBV侵袭能力，有一定的保护作用。所以，HBcAb可以作为急性乙型肝炎“窗口期”的辅助诊断；献血员的筛选(仅查HBsAg远远不够，必须加查HBcAb，尤当其滴度高时不宜作为献血员)；是流行病学调查的良好指标；观察疫苗的安全性(如接种后产生HBcAb则认为该批疫苗不纯，不宜选用)。乙型肝炎病毒感染机体，机体首先产生以免疫球蛋白HBcAbIgM为主的免疫球蛋白，以后才是HBcAbIgG免疫球蛋白。急性乙型肝炎其免疫球蛋白HBcAbIgM 100%均为阳性，甚至当HBsAg是阴性时，HBcAbIgM就已为阳性，而成为早期诊断急性乙型肝炎“窗口期”的唯一指标；作为D型肝炎鉴别诊断，当HBsAg阳性，而且临床肝功损害明显，但HBcAbIgM为阴性，就应考虑是D型肝炎病毒(δ因子，HDV)感染；对于乙型肝炎预后的判断，2到3个月后HBcAbIgM滴度下降，预后佳，否则3个月后，迟迟不降，提示转为慢性乙型肝炎，另外肝癌病人中HBcAbIgM阳性率很高；对慢性是否处于活动期的最佳指标，有助于区分新近感染还是既往感染。解放军302医院教授张霞认为高滴度表达，常见于急性期，爆发性乙型肝炎和慢性活动性肝炎；低滴度阳性，常见于慢性迁延性肝炎，慢性活动性肝炎稳定期及病毒携带者，所以同时测定二种免疫球蛋白在实际工作中显得尤为重要。
(5)HBV-DNA有4个开放读码框，即前C/C区、P区、前S/S区、X区。HbeAg是C基因编码的蛋白质，存在高度变异，此种变异影响HBV合成分泌HbeAg而不表达HbeAg，但不影响其复制。HBV-M虽然可以反映患者体内病毒的复制过程，但其不能完全准确地反映HBV的复制状况。由于前C区基因突变,HBeAg不表达，很难判定HBV是否复制病毒。根据对HBV-DNA前C基因突变的研究，按HBeAg和HBeAb状况分为两类肝炎：一类为HBeAg阳性慢性肝炎，由于HBV野生型感染引起，其自然史分HBeAg阳性期和HBeAb阳性期。TRFIA定量测定能明确检测HBeAg向HBeAb转化的时期，即表现为HBeAg浓度(NCU)的下降和HBeAb浓度(NCU)的上升的过程。另一类为HBeAb阳性的肝炎，主要由前C基因突变株HBV感染所致，亦称异型慢性肝炎。始终不出现HBeAg，但HBV-DNA进行性复制，HBsAg亦在高浓度处变动；与前者HBeAg阳性慢性肝炎中的转化期比较，HBV-M各项指标均呈小三阳，但后者主要表现在HBsAg高浓度，忽高忽低的ALT值和HBV-DNA始终阳性。此类病人往往对干扰素，拉米呋啶治疗效果不佳。如长期HBeAb阳性而不阴转，提示容易诱发肝癌。
乙型肝炎病毒变异的因素有：(1)病毒本身的变异。文献报道[10]部分慢性YIDD及YVDD变异感染者体内HBV株自身存在C区变异，是由于宿主抵抗病毒的免疫压力造成病毒逃避而发生变异。 (2)应用药物后的突变。应用干扰素后对病毒产生了强烈的免疫反应，病毒为了逃避被免疫反应所吞噬，因而发生了基因变异。应用拉米呋啶后病毒会发生YIDD和YVDD变异,就是病毒基因序列中的氨基酸成分发生了改变，使病毒产生突变株。 (3)疫苗接种后的基因突变。据报道主要指母亲为HBV携带者，分娩后的子女给予乙肝疫苗接种后仍有10%～20%的免疫失败，就是因为HBV发生了S基因区变异[11]。 (4)乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)应用后的变异。突变发生在HBIG的作用靶位，即S基因区，突变株的抗原性和免疫原性都发生了改变，无法被原来的HBsAb所识别和清除，造成HBV继续感染、结合和复制。我室对经ELISA、MEIA检测HBV-M五项指标全部为阴性的80例标本由HBV-M、PCR-DNA定量检测确证2例表现为“小三阳”，4例为HBsAb为阳性，1例为HBsAb和HBeAb、HBcAb，1例为单纯HBsAg阳性，而PCR-DNA在104 copies/ml。1例HBcAb-IgM阳性而ELISA、MEIA检测HBV-M全阴性，而经TRFIA定量其为“小三阳”模式，而且HBV-DNA-PCR为低病毒载量104copies/ml。因此，通过TRFIA定量测定更能准确地反映出HBV-M标志物的表达结果的具体分布情况。我们主张ELISA或MEIA定性HBV-M五项指标全为阴性的样本，建议其进一步做TRFIA和(或)HBV-DNA-PCR定量测定。可见只有HBV-M、TRFIA、HBV-DNA-PCR定量同时进行分析才能比较准确地了解HBV感染的情况和复制情况，从而具体判定其真实情况。而斑点杂交和PCR定性均不能反映病毒含量的动态变化，难以对病毒药物的疗效做出正确的判断。核酸技术、基因芯片、生物芯片技术是分子生物技术发展的结果，但必须做到操作的规范化，严格掌握应用范围，并且和临床的其他资料的分析相结合，才能正确判断检测结果。
4.2 TRFIA和定量PCR技术互相补充 尽管HBV-DNA定量PCR测定可以直接反映血液中病毒复制状态，具有很多临床应用价值，但并不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒状态。HBV-DNA阴性并不能完全代表体内HBV已被清除，结合HBV-M五项指标更能客观反映体内HBV病毒状态，正确判断预后和治疗。如果HBV-DNA阴性而HBsAg、HBeAg或HBeAb及HBcAb浓度还较高，提示并未完全痊愈，有可能病毒再次出现复制状况，尚须密切关注。如果HBV-DNA阴性而HBsAg、HBeAg或HBeAb及HBcAb浓度均很低或阴性并持续一段时间，提示可能完全痊愈，预后效果良好。乙型肝炎患者进行抗病毒治疗时，血清中的病毒核酸含量是反映病毒数量和复制活跃程度的最可靠的直接指标，因此，病毒含量的检测显得必不可少，是能确实反映动态观察药物疗效的确切指标，特别是对于HBeAg阴性的患者。但长期应用贺普丁治疗HBV-DNA阳性的患者必须应用PCR来测定是否产生YMDD变异，但采用测序方法操作繁琐而且成本高，不宜广泛应用。应用YIDD、YVDD特异酶切位点PCR技术，可准确检出血清中的YIDD及YVDD变异，与测序结果完全相同，该方法成本低，适合临床用于监控抗病毒治疗。PCR方法具有敏感性高，可检测出极微量的核酸，但不同的检测系统的敏感性即检测的最低病毒核酸量仍有差异，理论上能检出一个拷贝的基因，因存在操作技术等方面的影响，其实际敏感性一般在几百个copies/ml左右，由于影响其测定的因数颇多，常易出现假阳性和假阴性结果，因此必须据临床上其他检(监)测资料，进行综合分析。一般HBeAg、HBV-DNA为病毒复制指标，HBsAg、HbeAg、HBcAb为病毒感染指标，当HBeAg、HBV-DNA均为阳性时，证明病毒复制活跃，传染性强，应采取积极治疗。当HBsAg、HBeAb、HBcAb均为阳性，为病毒性肝炎恢复期，此时病毒复制虽不活跃，但HBV-DNA检测仍为阳性，说明病毒依然存在，也应采取治疗，以提高免疫抗病毒治疗为主；而当HBV-DNA检测为阴性时，为恢复期，当各种指标证明人体内病毒已得到抑制，可以不用治疗；属于既往感染HBV并且现有保护性抗体HBsAb的确存在及HBV-DNA阴性时，说明已趋于好转和(或)临床治愈，可不用药。在我国感染HBV人群基因型中存在B型、C型之分，因此感染HBV后不同HBV型与宿主作用的结果就有不同[9]。因而HBV-M表达结果就有多种情况出现。而目前，还不知道能否用病毒核酸含量作为病毒滴度的替代指标，评估传播危险，血浆病毒核酸含量只能反映外周血中细胞外病毒水平，不能反映血细胞和机体其他组织内病毒的含量。虽然较低病毒核酸含量可能提示较低滴度的暴露，但是并不能排除传播的可能，已有血浆病毒核酸含量低于检测限的病例发生母婴传播和导致正常人员职业感染的报道，职业暴露人员的免疫反应也是影响传播的因素之一。
因而，分析HBV感染者的病情状况和病毒复制状态和病毒变异程度以及职业暴露和传播风险评估时，不能光靠HBV-M，有必要结合HBV-DNA、HBV-M定量同时判定。
4.3 HBsAb的定量测定能够对抗体是否真正具有“中和”HBV的免疫力作出正确的评价，对乙型肝炎的预防起到监督作用。
做定量检测，可据HBsAb的含量判断机体对HBV的免疫状态及乙型肝炎疫苗的免疫效果。HBsAb的含量在10mIU/ml以上病人在用ELISA或MEIA检测就可呈“阳性”结果，但并不提示机体一定具有免疫力，而HBsAb的含量在10～100mIU/ml之间的样本定性为“阳性”，定性虽为“阳性”，但此时机体对HBV的免疫力较弱，甚至不能预防HBV感染，仍有感染HBV的危险。只有HBsAb的含量达100mIU/ml以上(或更高)时才可确定具有抵抗(同型)HBV入侵的作用。但也有例外，人们发现的许多HBV变异株，S基因的突变，会使乙型肝炎疫苗诱导的人体产生HBsAb的无效。HBsAb的含量越高，机体抵抗HBV入侵的能力越强，持续保护的时间越长。做定量测定，根据HBsAb的含量可判断机体对HBV免疫状态及乙型肝炎疫苗的免疫效果，HBsAb的含量较低，应该进行NID(即强化免疫，加强注射乙型肝炎疫苗)，使HBsAb的浓度提高到保护作用。同时，乙型肝炎疫苗接种后机体产生免疫力因个体差异而不同，有的可产生高浓度的并持续数十年。而有的人产生的抗体浓度不是很高，且持续时间也不长，数年后就逐渐消失，这部分人应及时关注HBsAb浓度的变化，必要时也应进行NID(但也有人认为机体在受到病毒感染时，会产生记忆反应，迅速提高免疫力)，否则，仍有可能感染HBV。因此定量测定HBsAb对乙型肝炎疫苗免疫力的评价和高危人群及职业暴露者预防免疫、免疫防疫都具有重要意义，尤其在少年儿童预防乙型肝炎方面。
在慢性肝病的治疗过程中，病人对了解自己病情的变化尤为关切。定量测定乙型肝炎血清标志物的浓度使病人能够对自己的病情有更清楚的了解，提高治疗信心，同时也加强对医生的信任度，有助于改善医患关系，利于疾病治疗。
综上所述，TRFIA技术作为一种灵敏度高，特异性及重复性好的无污染定量免疫测定方法，有着广泛的应用前景，随着社会经济的发展，应用各种非放射免疫标记、非发色酶标的自动化设备进行分析是检测技术发展的必然趋势，相信TRFIA技术在实验室将得到普及而且应用范围会越来越广。
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作者单位： 1 010031 内蒙古呼和浩特，呼和浩特市第二医院
(北京佑安医院呼市分院)肝病实验诊断科
2 028000 内蒙古通辽，通辽市医院检验科
(编辑：邓 锋), http://www.100md.com(刘金涛 曾显坤)