粒细胞集落刺激因子单克隆抗体新型酶盒的研制
作者：李太生 王爱霞 郭小清
单位：(北京协和医院，100730)
关键词：
中华医学杂志920413
粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colonyStimulating factor,G-CSF)是一种能在体内、外调节粒系祖细胞存活、增殖、分化及增强成熟粒细胞功能的细胞生长因子，它在抗感染的非特异性细胞免疫过程中起重要作用。当化脓菌或其毒素入侵人体时，人血清或体液中G-CSF水平较正常升高1000倍，而感染控制后又隆至正常水平。因此，测定血清及体液中G-CSF水平对诊断细菌性感染，指导抗生素合理应用有重要意义。
我们利用本室自建的两株能分泌抗G-CSF单抗的杂交瘤细胞株，建立了G-CSF单克隆抗体检测盒(双抗夹心ELISA法)，具体方法如下：
1、单克隆抗体的标记：参照Nakare PK[J Hisochem Cytochem 1974;22:1084]介绍的过碘酸盐氧化结合法，将纯化后的1B9单抗用HRP标记。
2、根据ELISA夹心法原理建立G-CSF测定方法，步骤如下：(1)抗体包被(2D4单抗)，用pH7.4 0.01mol/L PBS稀释，0.1ml/孔，4℃过夜。(2)弃去板内液体，用PBS tween20洗2遍，甩干。(3)加待测标本0.1ml/孔，37℃60分钟，按(2)法洗板。(4)加E-Ab(HRP-1 B9单抗)用pH7.4 0.01mol/L PBS 稀释，0.1ml/孔，37℃30分钟，PBStween20洗2遍，双蒸馏水洗3遍，甩干。(5)加底物TMB(即时配制)：用pH 6磷酸钠稀释，0.1ml/孔，置室温暗处15分钟，每孔加2mol/L H2SO41滴终止反应。(6)结果判定：用酶标仪读数，波长450nm，空白孔调零(空白对照用100μl底物液加1滴2mol/L H2SO4)，阳性对照用标准抗原，阴性对照用正常人血清，如吸光度OD值≥0.10为阳性，反之则为阴性。
稀释液及洗液按常规配制。
3、最佳工作浓渡 的选择及标准曲线的描制：根据分层选择的原则选择出最佳包被抗体浓度和最佳E-Ab稀释度，并在此基础上描制出标准曲线。
方法建立后，首先进行了动物试验。用本法测定注射内毒素后的小鼠血清，G-CSF水平较注射前显著升高达1000倍。临床上也进行初步应用：200名正常人血清G-CSF全为阴性，50例临床确诊为化脓菌感染病人标本测定阳性率达86%，而50例临床排除化脓菌感染的发热病人标本测定阳性率仅6%(如病毒感染、肿瘤、免疫病、结核等)。实验结果表明，测定体液G-CSF水平对感染性疾病的诊断，指导抗生素的合理应用确有重要意义。
为了了解酶盒的稳定性，我们对酶标抗体和包被抗体进行了稳定性试验，即分别测定上述试剂在新配制时、溶液状态和冰冻干燥后4℃、-20℃放置3个月和半年时的效价，结果发现溶液状态下4℃保存3个月及冰冻干燥后-20℃保存半年效价基本不变。, 百拇医药
单位：(北京协和医院，100730)
关键词：
中华医学杂志920413
粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colonyStimulating factor,G-CSF)是一种能在体内、外调节粒系祖细胞存活、增殖、分化及增强成熟粒细胞功能的细胞生长因子，它在抗感染的非特异性细胞免疫过程中起重要作用。当化脓菌或其毒素入侵人体时，人血清或体液中G-CSF水平较正常升高1000倍，而感染控制后又隆至正常水平。因此，测定血清及体液中G-CSF水平对诊断细菌性感染，指导抗生素合理应用有重要意义。
我们利用本室自建的两株能分泌抗G-CSF单抗的杂交瘤细胞株，建立了G-CSF单克隆抗体检测盒(双抗夹心ELISA法)，具体方法如下：
1、单克隆抗体的标记：参照Nakare PK[J Hisochem Cytochem 1974;22:1084]介绍的过碘酸盐氧化结合法，将纯化后的1B9单抗用HRP标记。
2、根据ELISA夹心法原理建立G-CSF测定方法，步骤如下：(1)抗体包被(2D4单抗)，用pH7.4 0.01mol/L PBS稀释，0.1ml/孔，4℃过夜。(2)弃去板内液体，用PBS tween20洗2遍，甩干。(3)加待测标本0.1ml/孔，37℃60分钟，按(2)法洗板。(4)加E-Ab(HRP-1 B9单抗)用pH7.4 0.01mol/L PBS 稀释，0.1ml/孔，37℃30分钟，PBStween20洗2遍，双蒸馏水洗3遍，甩干。(5)加底物TMB(即时配制)：用pH 6磷酸钠稀释，0.1ml/孔，置室温暗处15分钟，每孔加2mol/L H2SO41滴终止反应。(6)结果判定：用酶标仪读数，波长450nm，空白孔调零(空白对照用100μl底物液加1滴2mol/L H2SO4)，阳性对照用标准抗原，阴性对照用正常人血清，如吸光度OD值≥0.10为阳性，反之则为阴性。
稀释液及洗液按常规配制。
3、最佳工作浓渡 的选择及标准曲线的描制：根据分层选择的原则选择出最佳包被抗体浓度和最佳E-Ab稀释度，并在此基础上描制出标准曲线。
方法建立后，首先进行了动物试验。用本法测定注射内毒素后的小鼠血清，G-CSF水平较注射前显著升高达1000倍。临床上也进行初步应用：200名正常人血清G-CSF全为阴性，50例临床确诊为化脓菌感染病人标本测定阳性率达86%，而50例临床排除化脓菌感染的发热病人标本测定阳性率仅6%(如病毒感染、肿瘤、免疫病、结核等)。实验结果表明，测定体液G-CSF水平对感染性疾病的诊断，指导抗生素的合理应用确有重要意义。
为了了解酶盒的稳定性，我们对酶标抗体和包被抗体进行了稳定性试验，即分别测定上述试剂在新配制时、溶液状态和冰冻干燥后4℃、-20℃放置3个月和半年时的效价，结果发现溶液状态下4℃保存3个月及冰冻干燥后-20℃保存半年效价基本不变。, 百拇医药