肾综合征出血热病毒大鼠单克隆抗体制备及其对病毒抗原特性的鉴定
作者：徐海峰 杨为松 梁吉 崔龙洙 米力 白雪帆
单位：710038 西安，第四军医大学附属唐都医院传染科(徐海峰、杨为松、崔龙洙、白雪帆)，人单克隆抗体研究室(梁吉、米力)
关键词：出血热病毒，流行性；抗体，单克隆；抗原，病毒；抗原决定簇
中华医学杂志940412.htm 摘要 用肾综合征出血热病毒(HFRSV)免疫Lou/c大鼠脾细胞与IR983F骨髓瘤细胞融合，获得11株能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系。用放射免疫沉淀、Western blotting及免疫酶技术等对这一组大鼠单克隆抗体(单抗)进行了特性鉴定和病毒抗原性分析。发现11株单抗中，9株为抗核壳蛋白(NP)特异性，2株为抗G2糖蛋白。大多数抗NP单抗无中和活性及血凝抑制(HI)活性，但有2株例外，具有一定程度的中和或(和)HI活性。而抗G2单抗均具有一定程度的中和或(和)HI活性。在HFRSV抗原性分析方面，可初步将11株大鼠单抗分成组、亚组、野鼠型及亚型特异性单抗，并对上述单抗特性进行了讨论。
, 百拇医药
肾综合征出血热(HFRS)是在世界范围内广泛流行的以出血、发热和肾损害为三大征象的急性自然疫源性传染病。该病原--汉坦病毒属的抗原关系复杂，株间差异较大[1，2]，亟待进一步深入研究。所以制备HFRS病毒单克隆抗体(单抗)对本病的病原学、流行病学及预防和诊断均有一定意义。我们通过HFRS病毒免疫Lou/c大鼠，取其脾细胞与IR983F骨髓瘤细胞融合，获得11株能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系，并分别对这些单抗进行了特异性鉴定和抗原性分析。
材料及方法
一、实验所用病毒株
分离自黑线姬鼠的有江苏A9株、吉林A54株、韩国76-118株及Maaji株；来自家鼠的有河南R22株、山西Rn15株、韩国Seoul株、美国Gp株；分离自病人的有江苏Chen株、吉林H8235株、浙江B5株、河南HS株和陕西84-FLi株、武株、单核细胞株；来自大白鼠的有江苏R3、R4株及韩国SR-11株；来自家猫和罗赛鼠分别有安徽C4株和江西L99株。上述病毒株分别为本室、本校分子病毒室和北京中国科学院病毒研究所提供。
, 百拇医药
二、杂交瘤的制备
IR983F为供融合用的Lou/c大鼠淋巴瘤细胞系(比利时Bazin教授惠赠)。免疫用抗原为HFRS病毒Chen株。免疫程序见文献[3]。将免疫大鼠的脾细胞与IR983F骨髓瘤细胞融合，制备腹水的方法见文献[3]。
三、筛选杂交瘤、测定单抗效价及病毒抗原性分析
用双单抗间接夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法[4]和间接免疫酶技术[5]略加改变进行。
四、微量细胞中和试验和血凝抑制试验(HI)参照文献[5，6]。
五、放射免疫沉淀试验(RIP)
按文献[7]稍加改变。以Chen株病毒0.1TCID50/细胞浓度感染Vero-E6细胞，37℃培养8天，换无亮氨酸Eagle's基础培养基。3小时后加3H标记亮氨酸50μci/ml，置37℃8小时，以冷磷酸缓冲盐液洗3次，加入RIP缓冲液(pH7.6-0.05mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，1mmol/L二乙胺四乙酸二钠盐，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基磺酸钠SDS，1mmol/L苯甲磺酰氟，0.5%NP-40)静置30分钟。收集裂解液，15000r/min离心10分钟，取上清，每份以100μl3H标记病毒液，分别加入待检11株大鼠的单抗、小鼠A35单抗和5H5单抗、阳性对照大鼠血清、阴性IR983F腹水、正常大鼠和正常人血清各20μl，4℃过夜。次日加兔抗大鼠免疫血清各20μl，37℃2小时，加20%葡萄球菌A蛋白-琼脂糖凝胶4B或10%葡萄球菌A菌体，置4℃2小时，用RIP缓冲液洗3遍，加入电泳缓冲液各50μl，100℃3分钟，离心取上清进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。电泳后凝胶以二甲亚砜处理，再置-80℃曝光放射自显影。
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六、SDS-PAGE和免疫印迹
参照文献[8]，分离胶和浓缩胶分别为13%和4%的聚丙稀酰胺凝胶。样品缓冲液为0.05mol/L Tris-HCl。电泳条件为稳流18-20mA，5-6小时。电泳后将凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维膜上，再将含有病毒蛋白的硝酸纤维膜切成小条，用1%牛血清白蛋白加5%小牛血清磷酸缓冲盐液封闭于37℃1小时后，与待检11株大鼠单抗，大鼠免疫血清和正常大鼠血清，HFRS病人血清和正常人血清作用1-2小时，再经37℃充分洗涤后，加入酶标抗体染色，加底物液显色。
附表 肾综合征出血热病毒株对11株大鼠单克隆抗体的免疫酶反应谱
病毒株
大鼠单克隆抗体
小鼠单克隆抗体
, 百拇医药 BH4
KF12
DE2
CH10
CD3
IG4
DF11
X10
GF9
BF2
GD12
A35
江苏Chen(病人)
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陕西84-Fi(病人)
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吉林H8235(病人)
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韩国76-118(黑色姬鼠)
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韩国Maaji(黑色姬鼠)
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江苏A9(黑色姬鼠)
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吉林A54(黑色姬鼠)
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陕西M(病人)
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陕西Wu(病人)
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浙江B5(病人)
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安徽C4(家猫)
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韩国SR-11(大白鼠)
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江苏R3(大白鼠)
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江苏R4(大白鼠)
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河南HS(病人)
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河南R22(家鼠)
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山西Rn15(家鼠)
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韩国Seoul(家鼠)
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美国Gp(家鼠)
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江西L99(罗赛鼠)
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注：“+”为阳性，“-”为阴性结 果
一、细胞融合率和杂交瘤细胞株分泌抗体的阳性率
融合细胞植入培养孔后，5天即可见少数杂交瘤细胞集聚而成的细胞簇，10天可见较大集落并开始筛选检测。融合率为37%-51%，阳性率为39%-46%。经3次克隆化即100%呈阳性反应。获得分泌特异性单抗杂交瘤数10株，择优取其中11株单抗进行鉴定和分析。
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二、HFRS病毒对大鼠的免疫酶反应
20株HFRS病毒对11株大鼠单抗的免疫酶反应见附表：(1)单抗BH4和KF12几乎与所有来自不同地区和不同宿主的20株HFRS病毒均起反应，反应谱与A35组特异性单抗一致。提示它们所针对的抗原决定簇可能是组特异性抗原决定簇；(2)单抗DE2、CD3、CH10、IG4，它们可与部分野鼠型(黑线姬鼠)或家鼠型HFRS病毒株起反应，提示其所针对的抗原决定簇可能为亚组特异性；(3)单抗DF11和X10可与野鼠型病毒株起反应，不与家鼠型病毒株反应，表明其所针对的抗原决定簇为野鼠型特异性；(4)单抗GF9、BF2、GD12仅与野鼠型部分病毒株发生反应，提示它们为野鼠亚型特异性单抗；(5)从亚组和亚型单抗对20株FHRS病毒反应看，每株单抗均有自已独特的抗原反应谱。从病毒株与所用11株单抗反应数不同可以看出，有的毒株抗原决定簇较多，有的则较少。
三、大鼠单抗针对的病毒蛋白特异性鉴定
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1.放射免疫沉淀试验(RIP)：采用3H内标记法，对获得的单抗进行RIP分析。结果：单抗GD12、DF11、CH10、KF12、X10、IG4、BH4、GF9、CD3和小鼠单抗A35及5H5均与分子量为50000d(NP)多肽呈现反应；而单抗BF2和DE2与55000d(G2)多肽起反应；设置的阳性对照大鼠免疫血清与70000d(G1)、50000d(NP)和43000d多肽起反应；HFRS病人血清与NP和G1起反应；而阴性对照IR983F细胞大鼠腹水和正常人血清不与HFRS病毒陈株任何多肽呈现反应。
2.免疫印迹分析：采用庶糖密度梯度离心浓缩纯化的陈株病毒上清液与所获大鼠单抗进行SDS-PAGE和免疫印迹分析结果表明，大鼠单抗IG4、CD3、GD12、X10、BH4、GF9、KF12、CH10和DF11均可识别经SDS-PAGE变性后的50000d(NP)多肽，HFRS病人血清可识别NP、G1和G23种结构蛋白；大鼠免疫血清可识别NP和G2蛋白；但大鼠单抗DE2和BF2及正常人血清和正常大鼠血清不能识别任何分子量的多肽。
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四、单抗的性质与病毒结构蛋白的功能
对8株大鼠单抗进行了中和试验和血凝抑制试验(HI)，发现抗NP单抗GF9、KF12、IG4、GD12均无中和及HI活性，但单抗DF11有较高的中和活性(1：1280)和HI活性(1：320)，单抗X10仅有中和活性(1：160)。抗G2单抗DE2有较高的中和活性(1：640)和较低HI活性(1：40)，而单抗BF2仅有较高HI活性(1：320)，无中和活性。
讨 论
本实验以HFRS病毒陈株免疫Lou/C大鼠，其脾细胞与大鼠淋巴瘤细胞系IR983F融合，成功地获得11株能稳定分泌特异性抗HFRS病毒杂交瘤细胞株。为了使这些单抗在HFRS未来的研究中，更好地被合理应用，使其成为稳定、标准和特异的制剂，我们应用RIP、免疫印迹、免疫酶技术、中和及血凝抑制等方法对此进行了较全面的鉴定和分析。
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从大鼠单抗针对HFRS结构蛋白的特异性和功能看，本文所测的11株抗HFRS病毒大鼠单抗，有9株为抗NP特异性单抗，2株(BF2、DE2)为抗G2糖蛋白特异性单抗。发现2株抗G2的单抗均具有不同程度的中和或(和)HI活性，并且这2株单抗仅能识别RIP中G2抗原决定簇，而不能识别经SDS-PAGE变性后免疫印迹中的G2抗原位点，从而进一步证实了HFRS病毒G2上具有中和活性及血凝抑制活性的抗原位点和这些抗原决定簇为空间构象依赖性的报道[6]。但HFRS病毒NP上有无中和及血凝抑制活性抗原决定簇，近年来文献报道差异较大。有些学者观察到，某些抗NP特异性的单抗具有中和或(和)血凝抑制活性，并且在动物体内对HFRS病毒感染有良好的保护作用[9]。本实验中大多数抗NP特异性单抗无中和及血凝抑制活性。除2株抗NP单抗(DF11和X10)例外，它们具有一定程度的中和或(和)血凝抑制活性，提示在HFRS病毒NP上可能存在中和及血凝抑制位点。我们观察到这些抗NP的单抗对HFRS病毒变性前或变性后的NP多肽均可识别，亦证实了NP上的抗原决定簇其性质稳定为非构象依赖性的观点。本实验的另一观察结果同晚近报道一致， 即免疫血清不论在RIP或免疫印迹中均能与NP或糖蛋白发生反应。分析原因可能与2个因素有关，一是在HFRS病毒糖蛋白上部分抗原决定簇可能为非构象依赖性，二是糖蛋白上的抗原决定簇与多克隆抗体的结合可能有一种协同作用，此现象值得深入研究。此外我们还发现，在RIP中免疫血清还能沉淀一分子量约43000d的HFRS病毒多肽，此结果与陈伯权等报告相似[10]。但此种多肽为HFRS病毒结构蛋白的何种成分，其性质功能如何，尚不清楚，有待于进一步研究证实。
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在HFRS病毒抗原性分析方面，我们用所获得的11株大鼠单抗检测了20株具有不同来源和宿主的HFRS病毒。初步可将这11株单抗分成组特异性、亚组特异性、野鼠型特异性及野鼠亚型特异性单抗。通过这些单抗抗原反应谱可以发现，在HFRS病毒野鼠型和家鼠型或大鼠型病毒株间，不仅存在着共同的抗原决定簇，而且存在其特异的型或亚型抗原决定簇，此结果与文献报道一致[11]。此外如同已有报道，不同来源的HFRS病毒株之间存在着明显的抗原性差异，即使在同型病毒株之间，其抗原性出有所不同，我们亦观察到了这一结果，发现所用的20株病毒均有自己独特的单抗反应谱，从它们与单抗反应数目的多少可以看出这些病毒株之间抗原决定簇的差异，表明HFRS病毒属抗原关系的复杂性。由于本次实验我们选用的病毒株代表性仍不充分，所制备的大鼠单抗均为用野鼠型病毒株陈株免疫融合获得。因而无家鼠型特异性单抗，所以上述的结果仅为初步观察和分析，有待于选用更多的代表株(如美国草原田鼠株PH，小家鼠株Leaky、瑞典的Hallnas株以及国内湖北、湖南、四川、贵州等省分离的毒株)，对这些大鼠单抗抗原谱作更进一步细致深入的分析。
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上述抗HFRS病毒大鼠单抗的研制成功，是对小鼠杂交瘤体系的良好补充，为HFRS各个领域的研究迈上新台阶，提供了又一新的既有经济、又有科学应用价值的有益工具。
北京市肿瘤防治研究所免疫室孙素莲教授对大鼠单抗的制备和鉴定给予了热情的帮助，特此志谢。
参 考 文 献
1.Schmaljohn CS, Hasty SE, Dalrymple JM, et al. Antigenic and genetic properties of viruses linked to hemorrhagic fever with renal syndrome. Science, 1985, 227 : 1041.
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8.李德新,宋干,杭长寿等.流行性出血热病毒结构蛋白的研究.病毒学报,1990, 6 : 99.
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10.陈立礼,秦光明,柯红等.汉坦病毒结构蛋白的鉴定及其应用.病毒学杂志,1990, 3 : 273.
11.陈伯权,傅建林,廖化新等.35个流行性出血热病毒McAb对病毒抗原的分析.中华微生物学和免疫学杂志,1985, 5 : 136.
(收稿：1993-05-03 修回：1993-10-20), 百拇医药
单位：710038 西安，第四军医大学附属唐都医院传染科(徐海峰、杨为松、崔龙洙、白雪帆)，人单克隆抗体研究室(梁吉、米力)
关键词：出血热病毒，流行性；抗体，单克隆；抗原，病毒；抗原决定簇
中华医学杂志940412.htm 摘要 用肾综合征出血热病毒(HFRSV)免疫Lou/c大鼠脾细胞与IR983F骨髓瘤细胞融合，获得11株能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系。用放射免疫沉淀、Western blotting及免疫酶技术等对这一组大鼠单克隆抗体(单抗)进行了特性鉴定和病毒抗原性分析。发现11株单抗中，9株为抗核壳蛋白(NP)特异性，2株为抗G2糖蛋白。大多数抗NP单抗无中和活性及血凝抑制(HI)活性，但有2株例外，具有一定程度的中和或(和)HI活性。而抗G2单抗均具有一定程度的中和或(和)HI活性。在HFRSV抗原性分析方面，可初步将11株大鼠单抗分成组、亚组、野鼠型及亚型特异性单抗，并对上述单抗特性进行了讨论。
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肾综合征出血热(HFRS)是在世界范围内广泛流行的以出血、发热和肾损害为三大征象的急性自然疫源性传染病。该病原--汉坦病毒属的抗原关系复杂，株间差异较大[1，2]，亟待进一步深入研究。所以制备HFRS病毒单克隆抗体(单抗)对本病的病原学、流行病学及预防和诊断均有一定意义。我们通过HFRS病毒免疫Lou/c大鼠，取其脾细胞与IR983F骨髓瘤细胞融合，获得11株能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系，并分别对这些单抗进行了特异性鉴定和抗原性分析。
材料及方法
一、实验所用病毒株
分离自黑线姬鼠的有江苏A9株、吉林A54株、韩国76-118株及Maaji株；来自家鼠的有河南R22株、山西Rn15株、韩国Seoul株、美国Gp株；分离自病人的有江苏Chen株、吉林H8235株、浙江B5株、河南HS株和陕西84-FLi株、武株、单核细胞株；来自大白鼠的有江苏R3、R4株及韩国SR-11株；来自家猫和罗赛鼠分别有安徽C4株和江西L99株。上述病毒株分别为本室、本校分子病毒室和北京中国科学院病毒研究所提供。
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二、杂交瘤的制备
IR983F为供融合用的Lou/c大鼠淋巴瘤细胞系(比利时Bazin教授惠赠)。免疫用抗原为HFRS病毒Chen株。免疫程序见文献[3]。将免疫大鼠的脾细胞与IR983F骨髓瘤细胞融合，制备腹水的方法见文献[3]。
三、筛选杂交瘤、测定单抗效价及病毒抗原性分析
用双单抗间接夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法[4]和间接免疫酶技术[5]略加改变进行。
四、微量细胞中和试验和血凝抑制试验(HI)参照文献[5，6]。
五、放射免疫沉淀试验(RIP)
按文献[7]稍加改变。以Chen株病毒0.1TCID50/细胞浓度感染Vero-E6细胞，37℃培养8天，换无亮氨酸Eagle's基础培养基。3小时后加3H标记亮氨酸50μci/ml，置37℃8小时，以冷磷酸缓冲盐液洗3次，加入RIP缓冲液(pH7.6-0.05mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，1mmol/L二乙胺四乙酸二钠盐，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基磺酸钠SDS，1mmol/L苯甲磺酰氟，0.5%NP-40)静置30分钟。收集裂解液，15000r/min离心10分钟，取上清，每份以100μl3H标记病毒液，分别加入待检11株大鼠的单抗、小鼠A35单抗和5H5单抗、阳性对照大鼠血清、阴性IR983F腹水、正常大鼠和正常人血清各20μl，4℃过夜。次日加兔抗大鼠免疫血清各20μl，37℃2小时，加20%葡萄球菌A蛋白-琼脂糖凝胶4B或10%葡萄球菌A菌体，置4℃2小时，用RIP缓冲液洗3遍，加入电泳缓冲液各50μl，100℃3分钟，离心取上清进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。电泳后凝胶以二甲亚砜处理，再置-80℃曝光放射自显影。
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六、SDS-PAGE和免疫印迹
参照文献[8]，分离胶和浓缩胶分别为13%和4%的聚丙稀酰胺凝胶。样品缓冲液为0.05mol/L Tris-HCl。电泳条件为稳流18-20mA，5-6小时。电泳后将凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维膜上，再将含有病毒蛋白的硝酸纤维膜切成小条，用1%牛血清白蛋白加5%小牛血清磷酸缓冲盐液封闭于37℃1小时后，与待检11株大鼠单抗，大鼠免疫血清和正常大鼠血清，HFRS病人血清和正常人血清作用1-2小时，再经37℃充分洗涤后，加入酶标抗体染色，加底物液显色。
附表 肾综合征出血热病毒株对11株大鼠单克隆抗体的免疫酶反应谱
病毒株
大鼠单克隆抗体
小鼠单克隆抗体
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KF12
DE2
CH10
CD3
IG4
DF11
X10
GF9
BF2
GD12
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江西L99(罗赛鼠)
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注：“+”为阳性，“-”为阴性结 果
一、细胞融合率和杂交瘤细胞株分泌抗体的阳性率
融合细胞植入培养孔后，5天即可见少数杂交瘤细胞集聚而成的细胞簇，10天可见较大集落并开始筛选检测。融合率为37%-51%，阳性率为39%-46%。经3次克隆化即100%呈阳性反应。获得分泌特异性单抗杂交瘤数10株，择优取其中11株单抗进行鉴定和分析。
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二、HFRS病毒对大鼠的免疫酶反应
20株HFRS病毒对11株大鼠单抗的免疫酶反应见附表：(1)单抗BH4和KF12几乎与所有来自不同地区和不同宿主的20株HFRS病毒均起反应，反应谱与A35组特异性单抗一致。提示它们所针对的抗原决定簇可能是组特异性抗原决定簇；(2)单抗DE2、CD3、CH10、IG4，它们可与部分野鼠型(黑线姬鼠)或家鼠型HFRS病毒株起反应，提示其所针对的抗原决定簇可能为亚组特异性；(3)单抗DF11和X10可与野鼠型病毒株起反应，不与家鼠型病毒株反应，表明其所针对的抗原决定簇为野鼠型特异性；(4)单抗GF9、BF2、GD12仅与野鼠型部分病毒株发生反应，提示它们为野鼠亚型特异性单抗；(5)从亚组和亚型单抗对20株FHRS病毒反应看，每株单抗均有自已独特的抗原反应谱。从病毒株与所用11株单抗反应数不同可以看出，有的毒株抗原决定簇较多，有的则较少。
三、大鼠单抗针对的病毒蛋白特异性鉴定
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1.放射免疫沉淀试验(RIP)：采用3H内标记法，对获得的单抗进行RIP分析。结果：单抗GD12、DF11、CH10、KF12、X10、IG4、BH4、GF9、CD3和小鼠单抗A35及5H5均与分子量为50000d(NP)多肽呈现反应；而单抗BF2和DE2与55000d(G2)多肽起反应；设置的阳性对照大鼠免疫血清与70000d(G1)、50000d(NP)和43000d多肽起反应；HFRS病人血清与NP和G1起反应；而阴性对照IR983F细胞大鼠腹水和正常人血清不与HFRS病毒陈株任何多肽呈现反应。
2.免疫印迹分析：采用庶糖密度梯度离心浓缩纯化的陈株病毒上清液与所获大鼠单抗进行SDS-PAGE和免疫印迹分析结果表明，大鼠单抗IG4、CD3、GD12、X10、BH4、GF9、KF12、CH10和DF11均可识别经SDS-PAGE变性后的50000d(NP)多肽，HFRS病人血清可识别NP、G1和G23种结构蛋白；大鼠免疫血清可识别NP和G2蛋白；但大鼠单抗DE2和BF2及正常人血清和正常大鼠血清不能识别任何分子量的多肽。
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四、单抗的性质与病毒结构蛋白的功能
对8株大鼠单抗进行了中和试验和血凝抑制试验(HI)，发现抗NP单抗GF9、KF12、IG4、GD12均无中和及HI活性，但单抗DF11有较高的中和活性(1：1280)和HI活性(1：320)，单抗X10仅有中和活性(1：160)。抗G2单抗DE2有较高的中和活性(1：640)和较低HI活性(1：40)，而单抗BF2仅有较高HI活性(1：320)，无中和活性。
讨 论
本实验以HFRS病毒陈株免疫Lou/C大鼠，其脾细胞与大鼠淋巴瘤细胞系IR983F融合，成功地获得11株能稳定分泌特异性抗HFRS病毒杂交瘤细胞株。为了使这些单抗在HFRS未来的研究中，更好地被合理应用，使其成为稳定、标准和特异的制剂，我们应用RIP、免疫印迹、免疫酶技术、中和及血凝抑制等方法对此进行了较全面的鉴定和分析。
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从大鼠单抗针对HFRS结构蛋白的特异性和功能看，本文所测的11株抗HFRS病毒大鼠单抗，有9株为抗NP特异性单抗，2株(BF2、DE2)为抗G2糖蛋白特异性单抗。发现2株抗G2的单抗均具有不同程度的中和或(和)HI活性，并且这2株单抗仅能识别RIP中G2抗原决定簇，而不能识别经SDS-PAGE变性后免疫印迹中的G2抗原位点，从而进一步证实了HFRS病毒G2上具有中和活性及血凝抑制活性的抗原位点和这些抗原决定簇为空间构象依赖性的报道[6]。但HFRS病毒NP上有无中和及血凝抑制活性抗原决定簇，近年来文献报道差异较大。有些学者观察到，某些抗NP特异性的单抗具有中和或(和)血凝抑制活性，并且在动物体内对HFRS病毒感染有良好的保护作用[9]。本实验中大多数抗NP特异性单抗无中和及血凝抑制活性。除2株抗NP单抗(DF11和X10)例外，它们具有一定程度的中和或(和)血凝抑制活性，提示在HFRS病毒NP上可能存在中和及血凝抑制位点。我们观察到这些抗NP的单抗对HFRS病毒变性前或变性后的NP多肽均可识别，亦证实了NP上的抗原决定簇其性质稳定为非构象依赖性的观点。本实验的另一观察结果同晚近报道一致， 即免疫血清不论在RIP或免疫印迹中均能与NP或糖蛋白发生反应。分析原因可能与2个因素有关，一是在HFRS病毒糖蛋白上部分抗原决定簇可能为非构象依赖性，二是糖蛋白上的抗原决定簇与多克隆抗体的结合可能有一种协同作用，此现象值得深入研究。此外我们还发现，在RIP中免疫血清还能沉淀一分子量约43000d的HFRS病毒多肽，此结果与陈伯权等报告相似[10]。但此种多肽为HFRS病毒结构蛋白的何种成分，其性质功能如何，尚不清楚，有待于进一步研究证实。
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在HFRS病毒抗原性分析方面，我们用所获得的11株大鼠单抗检测了20株具有不同来源和宿主的HFRS病毒。初步可将这11株单抗分成组特异性、亚组特异性、野鼠型特异性及野鼠亚型特异性单抗。通过这些单抗抗原反应谱可以发现，在HFRS病毒野鼠型和家鼠型或大鼠型病毒株间，不仅存在着共同的抗原决定簇，而且存在其特异的型或亚型抗原决定簇，此结果与文献报道一致[11]。此外如同已有报道，不同来源的HFRS病毒株之间存在着明显的抗原性差异，即使在同型病毒株之间，其抗原性出有所不同，我们亦观察到了这一结果，发现所用的20株病毒均有自己独特的单抗反应谱，从它们与单抗反应数目的多少可以看出这些病毒株之间抗原决定簇的差异，表明HFRS病毒属抗原关系的复杂性。由于本次实验我们选用的病毒株代表性仍不充分，所制备的大鼠单抗均为用野鼠型病毒株陈株免疫融合获得。因而无家鼠型特异性单抗，所以上述的结果仅为初步观察和分析，有待于选用更多的代表株(如美国草原田鼠株PH，小家鼠株Leaky、瑞典的Hallnas株以及国内湖北、湖南、四川、贵州等省分离的毒株)，对这些大鼠单抗抗原谱作更进一步细致深入的分析。
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上述抗HFRS病毒大鼠单抗的研制成功，是对小鼠杂交瘤体系的良好补充，为HFRS各个领域的研究迈上新台阶，提供了又一新的既有经济、又有科学应用价值的有益工具。
北京市肿瘤防治研究所免疫室孙素莲教授对大鼠单抗的制备和鉴定给予了热情的帮助，特此志谢。
参 考 文 献
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(收稿：1993-05-03 修回：1993-10-20), 百拇医药