衰老真皮成纤维细胞胶原基因调控研究
作者：张余光 张涤生 李志海 祁佐良 王炜
单位：200011 上海第二医科大学附属第九人民医院整复外科(张余光 现在第一军医大学附属珠江医院整形外科，510282)
关键词：胶原基因表达；皮肤衰老
中华医学美容/980111.htm Regulation study of collagen gene in aging fibroblasts of dermis
Zhang Yuguang,Zhang Disheng,Li Zhihai,et al
【摘要】 目的 针对衰老真皮成纤维细胞胶原基因表达减少的特点，应用胎儿皮肤源性活性蛋白(SCF)进行调控，以增加胶原基因的表达。方法 应用真皮成纤维细胞培养、胶原基因mRNA裂隙杂交和图像分析技术，观察胎儿皮肤源性活性蛋白对真皮胶原基因的调控作用。结果 以Actin作为对照，SCF对老人成纤维细胞胶原基因有明显的调控作用，可以使Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达增加，处理后，I型胶原基因表达增加150 %，Ⅲ型胶原基因增加50 %。结论 SCF可以促进衰老真皮成纤维细胞胶原基因的表达。Regulation study of collagen gene in aging fibroblasts of dermis. Zhang Yuguang,Zhang Disheng,Li Zhihai,et al. Department of Plastic Surgery, No. 9 Peoples Hospital,Shanghai Second Medical University. 200011 ( Zhang Yuguang,Department of plastic Surgery,ZhuJiang Hospital of First Militarg Medical University 510282)
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective In accordance with expression decrease of collagen gene in aging fibroblasts, SCF was used to increase collagen gene expression.Method With fibroblasts cultrue,collagen gene hybridization and image pattern analysis, the regulative effect of SCF for collagen gene was observed. Result In contrast with Actin, SCF can obviously make the collagen gene expression of type Ⅰand type Ⅲ increase by 150 % and by 50 % respectively.Conclusion SCF can increase
, 百拇医药
collagen gene expression in aging fibroblasts of dermis.
【Key words】 Collagen gene Aging demis 皮肤老化与真皮间质蛋白、胶原含量及性质有关。病理学观察发现，随年龄增长和超量紫外线照射，弹力纤维逐渐变性、增厚，胶原含量逐渐减少，真皮中成纤维细胞数量减少，胶原纤维断裂，胶原稳定性增加。皮肤胶原含量和性质变化包括两方面：①真皮细胞中成纤维细胞寿命缩短，合成、分泌胶原的能力降低，胶原降解延缓，新陈代谢缓慢。②日光对胶原的损伤，胶原老化变性，结果使真皮变薄，弹力降低，皮肤松弛。第二方面的变化可通过皮肤结构的重塑得到矫正，而第一方面的变化只有通过调控胶原基因，增加胶原蛋白的分泌，使真皮胶原损伤得以修复，增加胶原蛋白代谢，使真皮中保留可溶性、非稳定胶原。
, 百拇医药
材料与方法
一、细胞培养
1.皮肤来源：老人皮肤来源于55～60岁手术病人，中青年人皮肤来源于30～35岁病人，小儿皮肤来源于初生～2岁小儿。
2.培养：按王氏方法，将不同年龄组皮肤的表皮细胞和成纤维细胞消化培养。小儿细胞进行持续传代培养，原代培养4天后收集细胞，将细胞浓度调至2×106/ml，按不同处理组加入调控剂。
3.分组： ①老人表皮细胞组；②老人表皮细胞VBT处理组；③老人成纤维细胞组；④ 老人表皮细胞EGF处理组；⑤小儿表皮细胞组；⑥老人成纤维细胞SCF处理组；⑦小儿成纤维细胞组；⑧老人成纤维细胞VBT处理组；⑨老人表皮细胞SCF处理组 ；○10老人成纤维细胞EGF处理组。
, 百拇医药
调控处理组，在培养基中加入各种调控物质，浓度如下：
VBT 1 mg/ml； ECF 0.2 mg/ml； SCF 1.0 mg/ml
4.调控药品：EGF：表皮生长因子(上海生化所)；
VBT：维生素BT(上海第二军医大学)；
SCF：胎儿成纤维细胞提取物(上海第二医科大学)。
二、RNA提取采用异硫氰酸胍一酸一氯仿法。
三、含目的探针的质粒来源 Plasmid PHFS含Ⅲ型前胶原基因控针、Plasmid PHCALIU含Ⅰ型前胶原基因探针，均由芬兰Turku 大学的Eero Vuorio 教授惠赠。
, 百拇医药
四、两种cDNA探针制备
1.提取质粒DNA：参考Summerton 方法[1]；
2.胶原cDNA片段的酶切及回收；
3.Ⅰ、Ⅲ型胶原cDNA探针的同位素标记。 用BRL公司的缺口平移试剂盒和Amersham公司的α-32P-dATP进行标记，测定标记探针放射比活为5×107 cpm/μg。
五、杂交方法(RNA点印迹杂交)：浸湿NC和Whatman 3MM滤纸各1张。将Whatman 3MM滤纸放在仪器上，加盖拧紧，接到真空泵上，在50 μ 120×SSC中加入1～2μg
, 百拇医药
待测RNA，加入仪器孔中，关闭真空泵，取下仪器盖及滤膜，NC滤膜夹在2张新的Whatman 3MM滤纸之间放在真空炉中80 ℃烤2小时，用6×SSC、2×Denbardt 试剂0.1 %SDS 进行预杂交。在预杂交液中加入变性的放射性标记探针0.2 μg/100 μl，在适宜的温度下继续温育16～24小时，用1×SSC 0.1 % SDS于室温洗膜20分钟，随后用0.2×SSC 0.1 % SDS于68 ℃洗膜3次，每次20分钟，用X光片进行放射自显影，于-70 ℃曝光24～48小时[1，2]。
六、杂效斑点图像分析：以Actin作为内对照(Actin 斑点灰度为100%)。
结 果
一、EGF 对老年成纤维细胞胶原基因表达的调控。
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表1 EGF对老年成纤维细胞胶原基因表达的影响
EGF
Ⅰ
Ⅲ
斑点
灰度
斑点
灰度
处理前
40%
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45%
处理后
45%
40%
Actin对照
100%
100%
图像分析结果显示EGF对Ⅰ型、Ⅲ型胶原基因的表达无明显调控作用(P>0.05)。
二、VBT对老年成纤维细胞胶基因表达的调控。
表2 VBT对老年成纤维细胞胶原基因表达的影响
, 百拇医药
EGF
Ⅰ
Ⅲ
斑点
灰度
斑点
灰度
处理前
40%
45%
处理后
, http://www.100md.com
98%
86%
Actin对照
100%
100%
图像分析结果显示，VBT可使两种胶原基因表达增加，但对Ⅰ型胶原基因的表达调控作用更明显。使Ⅰ∶Ⅲ比值增高，由调控前1∶1升至1.1∶1。
三、SCF 对老年成纤维细胞胶原基因的调控
表3 SCF 对老年成纤维细胞胶原因表达的调控
EGF
, 百拇医药
Ⅰ
Ⅲ
斑点
灰度
斑点
灰度
处理前
40%
45%
处理后
45%
, 百拇医药
40%
Actin对照
100%
100%
SCF 对老年成纤维细胞胶原基因有明显的调控作用，可使Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达增加，Ⅰ∶Ⅲ比值由调控前1∶1升至1.7∶1。
讨 论
在衰老过程中，皮肤真皮的老化是成纤维细胞与细胞外基质相互之间的平衡关系发生了改变。Warren R[3] 研究了同一地区健康妇女的面部皮肤与年龄、日光之间的关系，分析胶原和弹力纤维的含量变化。结果发现，随着年龄增长和超量紫外线照射，弹力纤维逐渐变性，增
厚，胶原含逐渐减少。这是由于在衰老过程中，胶原基因的表达减少，且各种胶原基因表达的比例也发生了改变。在通常情况下，小儿及青年人皮肤中I型胶原是细胞外基质的主要成分，约占70 %；Ⅲ型胶原约占30 %。而细胞老化时，两者的比例逐渐倒置，且胶原的总分泌量明
, 百拇医药
显减少。因此，要改善因老化而引起的皮肤结构和功能变化，加速胶原蛋白的新陈代谢极为
重要。本实验目的在于进行胶原基因调控以增加胶原基因的表达，使衰老皮肤组织中可溶性
胶原增加，断裂的胶原得以修复和被替代。
从实验结果分析，EGF对老年成纤维细胞胶原基因表达的调控作用不明显，其机理尚不清楚，可能由于老年成纤维细胞EGF受体数量减少，亲和力降低，EGF与EGF受体结合量少，致对细胞增殖的促进作用小，胶原基因表达量也少有关。
VBT是一种新型维生素类药物，国外主要用于增强人体的体能，如可增加运动员肌肉组织的糖原贮存，并可促进线粒体氧化长链脂肪酸。因此VBT是细胞能代谢的调节剂和促进剂。本实验将V BT加入老年成纤维细胞培养液中，发现可加速细胞的增殖速度，增加细胞的传代次数和胶原基因的表达。
, 百拇医药
SCF也可促进老年成纤维细胞胶原基因的表达。小儿成纤维细胞培养上清液中含有大量的促生长物质。有的学者认为[4]，胎儿脑细胞培养液中有大量促细胞增殖的物质，其中有些物质可以削弱老年痴呆症患者细胞DNA合成抑制基因的作用，使细胞的功能得以恢复。本实验结果显示，SCF可加速老年成纤维细胞增殖，并可使Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达增加，尤其增加了Ⅰ 型基因的表达，使Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达量恢复到2∶1的比例。
参考文献
1Sambrook. Molecular Cloning. New York: A laboratory mannu al. 2nd edition.1989.126.
2Summerton J. Rapid method for preparation of bacterial plasmids. Ann Biochem,1983,133:79.
, 百拇医药
3Hatamochi A. Analysis of collagen gene expression by cultured fibroblasts in morphoea.
Br J Dermatology, 1992,126:216221.
4Martin M. Fibronectin and collagen gene expression during in vitro of aging pig skin fibroblasts.
Exp Cell Res, 1990,191:813.
(收稿：1997-03-04), 百拇医药
单位：200011 上海第二医科大学附属第九人民医院整复外科(张余光 现在第一军医大学附属珠江医院整形外科，510282)
关键词：胶原基因表达；皮肤衰老
中华医学美容/980111.htm Regulation study of collagen gene in aging fibroblasts of dermis
Zhang Yuguang,Zhang Disheng,Li Zhihai,et al
【摘要】 目的 针对衰老真皮成纤维细胞胶原基因表达减少的特点，应用胎儿皮肤源性活性蛋白(SCF)进行调控，以增加胶原基因的表达。方法 应用真皮成纤维细胞培养、胶原基因mRNA裂隙杂交和图像分析技术，观察胎儿皮肤源性活性蛋白对真皮胶原基因的调控作用。结果 以Actin作为对照，SCF对老人成纤维细胞胶原基因有明显的调控作用，可以使Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达增加，处理后，I型胶原基因表达增加150 %，Ⅲ型胶原基因增加50 %。结论 SCF可以促进衰老真皮成纤维细胞胶原基因的表达。Regulation study of collagen gene in aging fibroblasts of dermis. Zhang Yuguang,Zhang Disheng,Li Zhihai,et al. Department of Plastic Surgery, No. 9 Peoples Hospital,Shanghai Second Medical University. 200011 ( Zhang Yuguang,Department of plastic Surgery,ZhuJiang Hospital of First Militarg Medical University 510282)
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【Abstract】 Objective In accordance with expression decrease of collagen gene in aging fibroblasts, SCF was used to increase collagen gene expression.Method With fibroblasts cultrue,collagen gene hybridization and image pattern analysis, the regulative effect of SCF for collagen gene was observed. Result In contrast with Actin, SCF can obviously make the collagen gene expression of type Ⅰand type Ⅲ increase by 150 % and by 50 % respectively.Conclusion SCF can increase
, 百拇医药
collagen gene expression in aging fibroblasts of dermis.
【Key words】 Collagen gene Aging demis 皮肤老化与真皮间质蛋白、胶原含量及性质有关。病理学观察发现，随年龄增长和超量紫外线照射，弹力纤维逐渐变性、增厚，胶原含量逐渐减少，真皮中成纤维细胞数量减少，胶原纤维断裂，胶原稳定性增加。皮肤胶原含量和性质变化包括两方面：①真皮细胞中成纤维细胞寿命缩短，合成、分泌胶原的能力降低，胶原降解延缓，新陈代谢缓慢。②日光对胶原的损伤，胶原老化变性，结果使真皮变薄，弹力降低，皮肤松弛。第二方面的变化可通过皮肤结构的重塑得到矫正，而第一方面的变化只有通过调控胶原基因，增加胶原蛋白的分泌，使真皮胶原损伤得以修复，增加胶原蛋白代谢，使真皮中保留可溶性、非稳定胶原。
, 百拇医药
材料与方法
一、细胞培养
1.皮肤来源：老人皮肤来源于55～60岁手术病人，中青年人皮肤来源于30～35岁病人，小儿皮肤来源于初生～2岁小儿。
2.培养：按王氏方法，将不同年龄组皮肤的表皮细胞和成纤维细胞消化培养。小儿细胞进行持续传代培养，原代培养4天后收集细胞，将细胞浓度调至2×106/ml，按不同处理组加入调控剂。
3.分组： ①老人表皮细胞组；②老人表皮细胞VBT处理组；③老人成纤维细胞组；④ 老人表皮细胞EGF处理组；⑤小儿表皮细胞组；⑥老人成纤维细胞SCF处理组；⑦小儿成纤维细胞组；⑧老人成纤维细胞VBT处理组；⑨老人表皮细胞SCF处理组 ；○10老人成纤维细胞EGF处理组。
, 百拇医药
调控处理组，在培养基中加入各种调控物质，浓度如下：
VBT 1 mg/ml； ECF 0.2 mg/ml； SCF 1.0 mg/ml
4.调控药品：EGF：表皮生长因子(上海生化所)；
VBT：维生素BT(上海第二军医大学)；
SCF：胎儿成纤维细胞提取物(上海第二医科大学)。
二、RNA提取采用异硫氰酸胍一酸一氯仿法。
三、含目的探针的质粒来源 Plasmid PHFS含Ⅲ型前胶原基因控针、Plasmid PHCALIU含Ⅰ型前胶原基因探针，均由芬兰Turku 大学的Eero Vuorio 教授惠赠。
, 百拇医药
四、两种cDNA探针制备
1.提取质粒DNA：参考Summerton 方法[1]；
2.胶原cDNA片段的酶切及回收；
3.Ⅰ、Ⅲ型胶原cDNA探针的同位素标记。 用BRL公司的缺口平移试剂盒和Amersham公司的α-32P-dATP进行标记，测定标记探针放射比活为5×107 cpm/μg。
五、杂交方法(RNA点印迹杂交)：浸湿NC和Whatman 3MM滤纸各1张。将Whatman 3MM滤纸放在仪器上，加盖拧紧，接到真空泵上，在50 μ 120×SSC中加入1～2μg
, 百拇医药
待测RNA，加入仪器孔中，关闭真空泵，取下仪器盖及滤膜，NC滤膜夹在2张新的Whatman 3MM滤纸之间放在真空炉中80 ℃烤2小时，用6×SSC、2×Denbardt 试剂0.1 %SDS 进行预杂交。在预杂交液中加入变性的放射性标记探针0.2 μg/100 μl，在适宜的温度下继续温育16～24小时，用1×SSC 0.1 % SDS于室温洗膜20分钟，随后用0.2×SSC 0.1 % SDS于68 ℃洗膜3次，每次20分钟，用X光片进行放射自显影，于-70 ℃曝光24～48小时[1，2]。
六、杂效斑点图像分析：以Actin作为内对照(Actin 斑点灰度为100%)。
结 果
一、EGF 对老年成纤维细胞胶原基因表达的调控。
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表1 EGF对老年成纤维细胞胶原基因表达的影响
EGF
Ⅰ
Ⅲ
斑点
灰度
斑点
灰度
处理前
40%
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45%
处理后
45%
40%
Actin对照
100%
100%
图像分析结果显示EGF对Ⅰ型、Ⅲ型胶原基因的表达无明显调控作用(P>0.05)。
二、VBT对老年成纤维细胞胶基因表达的调控。
表2 VBT对老年成纤维细胞胶原基因表达的影响
, 百拇医药
EGF
Ⅰ
Ⅲ
斑点
灰度
斑点
灰度
处理前
40%
45%
处理后
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98%
86%
Actin对照
100%
100%
图像分析结果显示，VBT可使两种胶原基因表达增加，但对Ⅰ型胶原基因的表达调控作用更明显。使Ⅰ∶Ⅲ比值增高，由调控前1∶1升至1.1∶1。
三、SCF 对老年成纤维细胞胶原基因的调控
表3 SCF 对老年成纤维细胞胶原因表达的调控
EGF
, 百拇医药
Ⅰ
Ⅲ
斑点
灰度
斑点
灰度
处理前
40%
45%
处理后
45%
, 百拇医药
40%
Actin对照
100%
100%
SCF 对老年成纤维细胞胶原基因有明显的调控作用，可使Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达增加，Ⅰ∶Ⅲ比值由调控前1∶1升至1.7∶1。
讨 论
在衰老过程中，皮肤真皮的老化是成纤维细胞与细胞外基质相互之间的平衡关系发生了改变。Warren R[3] 研究了同一地区健康妇女的面部皮肤与年龄、日光之间的关系，分析胶原和弹力纤维的含量变化。结果发现，随着年龄增长和超量紫外线照射，弹力纤维逐渐变性，增
厚，胶原含逐渐减少。这是由于在衰老过程中，胶原基因的表达减少，且各种胶原基因表达的比例也发生了改变。在通常情况下，小儿及青年人皮肤中I型胶原是细胞外基质的主要成分，约占70 %；Ⅲ型胶原约占30 %。而细胞老化时，两者的比例逐渐倒置，且胶原的总分泌量明
, 百拇医药
显减少。因此，要改善因老化而引起的皮肤结构和功能变化，加速胶原蛋白的新陈代谢极为
重要。本实验目的在于进行胶原基因调控以增加胶原基因的表达，使衰老皮肤组织中可溶性
胶原增加，断裂的胶原得以修复和被替代。
从实验结果分析，EGF对老年成纤维细胞胶原基因表达的调控作用不明显，其机理尚不清楚，可能由于老年成纤维细胞EGF受体数量减少，亲和力降低，EGF与EGF受体结合量少，致对细胞增殖的促进作用小，胶原基因表达量也少有关。
VBT是一种新型维生素类药物，国外主要用于增强人体的体能，如可增加运动员肌肉组织的糖原贮存，并可促进线粒体氧化长链脂肪酸。因此VBT是细胞能代谢的调节剂和促进剂。本实验将V BT加入老年成纤维细胞培养液中，发现可加速细胞的增殖速度，增加细胞的传代次数和胶原基因的表达。
, 百拇医药
SCF也可促进老年成纤维细胞胶原基因的表达。小儿成纤维细胞培养上清液中含有大量的促生长物质。有的学者认为[4]，胎儿脑细胞培养液中有大量促细胞增殖的物质，其中有些物质可以削弱老年痴呆症患者细胞DNA合成抑制基因的作用，使细胞的功能得以恢复。本实验结果显示，SCF可加速老年成纤维细胞增殖，并可使Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达增加，尤其增加了Ⅰ 型基因的表达，使Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达量恢复到2∶1的比例。
参考文献
1Sambrook. Molecular Cloning. New York: A laboratory mannu al. 2nd edition.1989.126.
2Summerton J. Rapid method for preparation of bacterial plasmids. Ann Biochem,1983,133:79.
, 百拇医药
3Hatamochi A. Analysis of collagen gene expression by cultured fibroblasts in morphoea.
Br J Dermatology, 1992,126:216221.
4Martin M. Fibronectin and collagen gene expression during in vitro of aging pig skin fibroblasts.
Exp Cell Res, 1990,191:813.
(收稿：1997-03-04), 百拇医药