流式细胞术检测反义核酸对HLA-Ⅰ表达的影响
作者：冯志华 周永兴 姚志强 张盈华 陈从新 张文彬
单位：710038 西安，第四军医大学唐都医院
关键词：
中华传染病杂志980118 * 互补基因位点对应于Ono等发表的adr亚型HBV全基因序列 人类白细胞抗原中Ⅰ类抗原(HLA-Ⅰ)很少或不表达于正常肝细胞膜[1]。乙型肝炎病毒(HBV)感染可诱导HLA-Ⅰ在肝细胞膜上的表达，进一步的研究表明，HLA-Ⅰ的表达与HBV X基因产物反式激活作用有关[2]，而前者的表达又可促进细胞毒T细胞(CTL)对感染肝细胞的双重识别和杀伤，造成肝细胞的破坏。本研究人工合成了互补于HBV X基因关键区的反义核酸(antisense oligodeoxy-
nucleotides, ASODN)，采用流式细胞术，观察了ASODN对2，2，15细胞膜HLA-Ⅰ表达的影响，为寻找防治慢性与重型乙型肝炎的药剂提供理论和实验依据。材料和方法
, 百拇医药
一、材料
HBV基因转染的HepG2细胞(即2，2，15细胞)——中国医学科学院药物技术研究所；HLA-Ⅰ重链多肽区McAb——武汉生物制品研究所；FITC标记的羊抗鼠IgG——美国Sigma公司；EPICS profile Ⅱ型流式细胞仪——美国Coulter公司。
二、方法
(一)硫代磷酸ASODN的合成
DNA合成仪上分别合成互补于HBV X基因序列1510～1530、1555～1581、1768～1791区的ASODN，同时合成与1510～1530区相同的正义序列(SODN)作为对照。各段寡聚物互补基因位点及其碱基序列见附表。
(二) 细胞表面HLA-Ⅰ的检测 2，2，15细胞以2×105接种于Nunclon 24孔培养板，待细胞长成单层，换液并同时分别加入ASODN序列Ⅰ～Ⅲ，并设SODN(序列Ⅳ)及空白对照组。ASODN和SODN浓度均为20μmol/L，每组设3个复孔，作用72小时后分别收集细胞→与工作浓度HLA-ⅠMcAb于4°C混合30分钟→洗涤2次→与FITC标记羊抗鼠IgG于4°C混合30分钟→洗涤后加固定液→流式细胞仪(FCM)检测。
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附表 ASODN互补基因位点及碱基序列 序列编号
基因位点
碱基序列*
Ⅰ
1510-1530(21聚)
GGTGCGCCCCGTGGTCGGCCG
Ⅱ
1555-1581(27聚)
CACACGGTCCGGCAGATGAGAAGGCAC
Ⅲ
1768-1791(24聚)
, http://www.100md.com
TATGCCTACAGCCTCCCAGTACAA
Ⅳ
1510-1530的正义序列
CGGCCGACCACGGGGCGCACC
结果和讨论
我们设计的针对HBV X基因的ASODN Ⅰ～Ⅲ序列，作用于2，2，15细胞72小时，均可抑制细胞膜表面HLA-Ⅰ表达，而SODN这种抑制作用不明显，表达率分别为序列Ⅰ：5.7%，序列Ⅱ：10.8%，序列Ⅲ：2.3%，序列Ⅳ：81.4%，空白对照组：93.2%。
HLA抗原不仅是移植抗原，而且在免疫细胞间勾通信息、双重识别与调控中发挥着重要作用。已证明，HLA参与抗原的呈递，介导T细胞激活；随着肝内炎症活动的加剧，肝细胞HLA-Ⅰ表达增强，CTL反应增强[3]。可见，降低HLA-Ⅰ在肝细胞的过度表达，同时配伍高效抗病毒制剂，可防治肝细胞的大片坏死，阻止慢性及重型肝炎的发生。
, 百拇医药
Zhou等[2]研究表明，HBV DNA转染细胞后，HLA-Ⅰ表达率比未经转染的细胞要高3～4倍，而且这种增高是通过HBxAg对HLA-Ⅰ基因启动子的反式激活造成的。本实验设计的针对X基因高度保守关键区ASODN，不仅可以抑制HBxAg表达[4]，FCM结果表明还可抑制HLA-Ⅰ在肝细胞膜表面的表达。从而推测，HLA-Ⅰ表达的抑制作用可能是通过HBxAg序列特异性抑制HBxAg表达，使后者对HLA-Ⅰ启动子的激活降低而实现的。
参考文献
1 Natali PG, Bigotti A, Nicotra MR, et al. Distribution of human class I (HLA-A,B,C) histocompatibility antigen in normal and malignant tissues of nonlymphoid origion. Cancer Res, 1984,44:4679.
, 百拇医药
2 Zhou DX, Taraboulos A, Du JH, et al. Activation of class I major histocompatibility complex gene expression by hepatitis B virus. J Vir, 1990,64:4025-4028.
3 Fukusato T, Gerber MA, Thung SN, et al. Expression of HLA class I antigens on hepatocytes in liver disease. Am J Pathol, 1986,123:264-270.
4 冯志华，周永兴，姚志强，等.针对HBV X基因的反义核酸体外抗乙肝病毒作用研究.第四军医大学学报，1996，17：152., http://www.100md.com
单位：710038 西安，第四军医大学唐都医院
关键词：
中华传染病杂志980118 * 互补基因位点对应于Ono等发表的adr亚型HBV全基因序列 人类白细胞抗原中Ⅰ类抗原(HLA-Ⅰ)很少或不表达于正常肝细胞膜[1]。乙型肝炎病毒(HBV)感染可诱导HLA-Ⅰ在肝细胞膜上的表达，进一步的研究表明，HLA-Ⅰ的表达与HBV X基因产物反式激活作用有关[2]，而前者的表达又可促进细胞毒T细胞(CTL)对感染肝细胞的双重识别和杀伤，造成肝细胞的破坏。本研究人工合成了互补于HBV X基因关键区的反义核酸(antisense oligodeoxy-
nucleotides, ASODN)，采用流式细胞术，观察了ASODN对2，2，15细胞膜HLA-Ⅰ表达的影响，为寻找防治慢性与重型乙型肝炎的药剂提供理论和实验依据。材料和方法
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一、材料
HBV基因转染的HepG2细胞(即2，2，15细胞)——中国医学科学院药物技术研究所；HLA-Ⅰ重链多肽区McAb——武汉生物制品研究所；FITC标记的羊抗鼠IgG——美国Sigma公司；EPICS profile Ⅱ型流式细胞仪——美国Coulter公司。
二、方法
(一)硫代磷酸ASODN的合成
DNA合成仪上分别合成互补于HBV X基因序列1510～1530、1555～1581、1768～1791区的ASODN，同时合成与1510～1530区相同的正义序列(SODN)作为对照。各段寡聚物互补基因位点及其碱基序列见附表。
(二) 细胞表面HLA-Ⅰ的检测 2，2，15细胞以2×105接种于Nunclon 24孔培养板，待细胞长成单层，换液并同时分别加入ASODN序列Ⅰ～Ⅲ，并设SODN(序列Ⅳ)及空白对照组。ASODN和SODN浓度均为20μmol/L，每组设3个复孔，作用72小时后分别收集细胞→与工作浓度HLA-ⅠMcAb于4°C混合30分钟→洗涤2次→与FITC标记羊抗鼠IgG于4°C混合30分钟→洗涤后加固定液→流式细胞仪(FCM)检测。
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附表 ASODN互补基因位点及碱基序列 序列编号
基因位点
碱基序列*
Ⅰ
1510-1530(21聚)
GGTGCGCCCCGTGGTCGGCCG
Ⅱ
1555-1581(27聚)
CACACGGTCCGGCAGATGAGAAGGCAC
Ⅲ
1768-1791(24聚)
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Ⅳ
1510-1530的正义序列
CGGCCGACCACGGGGCGCACC
结果和讨论
我们设计的针对HBV X基因的ASODN Ⅰ～Ⅲ序列，作用于2，2，15细胞72小时，均可抑制细胞膜表面HLA-Ⅰ表达，而SODN这种抑制作用不明显，表达率分别为序列Ⅰ：5.7%，序列Ⅱ：10.8%，序列Ⅲ：2.3%，序列Ⅳ：81.4%，空白对照组：93.2%。
HLA抗原不仅是移植抗原，而且在免疫细胞间勾通信息、双重识别与调控中发挥着重要作用。已证明，HLA参与抗原的呈递，介导T细胞激活；随着肝内炎症活动的加剧，肝细胞HLA-Ⅰ表达增强，CTL反应增强[3]。可见，降低HLA-Ⅰ在肝细胞的过度表达，同时配伍高效抗病毒制剂，可防治肝细胞的大片坏死，阻止慢性及重型肝炎的发生。
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Zhou等[2]研究表明，HBV DNA转染细胞后，HLA-Ⅰ表达率比未经转染的细胞要高3～4倍，而且这种增高是通过HBxAg对HLA-Ⅰ基因启动子的反式激活造成的。本实验设计的针对X基因高度保守关键区ASODN，不仅可以抑制HBxAg表达[4]，FCM结果表明还可抑制HLA-Ⅰ在肝细胞膜表面的表达。从而推测，HLA-Ⅰ表达的抑制作用可能是通过HBxAg序列特异性抑制HBxAg表达，使后者对HLA-Ⅰ启动子的激活降低而实现的。
参考文献
1 Natali PG, Bigotti A, Nicotra MR, et al. Distribution of human class I (HLA-A,B,C) histocompatibility antigen in normal and malignant tissues of nonlymphoid origion. Cancer Res, 1984,44:4679.
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2 Zhou DX, Taraboulos A, Du JH, et al. Activation of class I major histocompatibility complex gene expression by hepatitis B virus. J Vir, 1990,64:4025-4028.
3 Fukusato T, Gerber MA, Thung SN, et al. Expression of HLA class I antigens on hepatocytes in liver disease. Am J Pathol, 1986,123:264-270.
4 冯志华，周永兴，姚志强，等.针对HBV X基因的反义核酸体外抗乙肝病毒作用研究.第四军医大学学报，1996，17：152., http://www.100md.com