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编号:10242084
肾综合征出血热患者尿沉渣细胞中病毒RNA的检测
http://www.100md.com 《中华传染病杂志》 1998年第1期
     作者:张帆 岳金声 樊万虎 郑军梅 杭长寿

    单位:710061 西安医科大学第一临床医学院(张帆、岳金声、樊万虎);西安市第八医院(郑军梅);中国预防医学科学院病毒学研究所(杭长寿)

    关键词:肾综合征出血热;聚合酶链反应

    中华传染病杂志980115 【摘要】 目的 进一步阐明病毒在肾综合征出血热肾脏损害中的作用。方法 应用套式-逆转录-聚合酶链反应对31例肾综合征出血热患者79份尿液沉渣细胞中病毒核酸进行检测。结果 79份样本中58份阳性,阳性率为73.4%在病程早期(1~7天)各型患者的检出率为100%;在病程后期(≥13天),轻、中、重型患者的检出率分别为0%、16%和85%,重型患者的检出率较中型、轻型患者高(P<0.01,P<0.05);且检出率与肾功能损害密切相关。结论 早期存在病毒对肾脏有直接损伤作用,在重型患者病毒的直接作用为肾脏损害的主要因素。
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    Detection of virus RNA in urinary sediments of the patients with hemorrhagic fever with renal syndrome Zhang Fan, Yue Jinsheng, Fan Wanhu, et al. Department of Infectious Diseases, the First Clinical Medical College, Xian Medical University, Xian 710061

    【Abstract】 Objective In order to explore direct cytopathic effect of HFRS virus to kidney in the patients with hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS). Methods We detected HFRSV RNA in urinary sediments of 79 samples from 31 HFRS patients by nested reverse transcription polymerase chain reaction (nested RT-PCR). Results HFRSV RNA in 58 of 79 (73.4%) samples were posive. During the early stage of HFRS (1~7days), HFRSV RNA were detected in all samples (100%). During the late stage of HFRS(≥13days), the posive ratio of HFRSV RNA in mild moderate and serious patients were 0%, 16% and 85% respectively. The HFRSV RNA were detected more often in the serious patients with HFRS than that in the mild and moderate patients (P<0.01,P<0.05).The detection rate of HFRSV RNA was correlated with the level of renal impairment. Conclusion It suggested that there is direct cytopathic effect of HFRSV virus on kidney, which seems to be the major pathogenic factor in serious patient and the impairment of renal functions may occur in the early stage.
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    【Key words】 Hemorrhagic fever with renal syndrome Polymerase chain reaction

    我们用套式-逆转录-聚合酶链反应(Nested-RT-PCR)对肾综合征出血热患者尿沉渣中的病毒核酸(HFRSV RNA)进行了系列、动态检测,进一步探讨了该病毒在肾脏损害中的作用。

    对象与方法

    一、研究对象

    79份HFRS患者尿标本均采自西安几所医院住院31例患者,其中男26例,女5例;年龄16~68岁,平均34岁。按1986年南京全国出血热临床学术会议制定的标准进行诊断及分型,其中轻型5例,中型9例,危、重型17例。血清HFRS特异性抗体检测均阳性,HFRSV RNA 均阳性。

    二、研究方法
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    (一) 尿沉渣提取 尿液标本取HFRS患者新鲜尿液5ml,2 000r/min离心10分钟,弃上清,沉淀物置-20°C保存。20份非HFRS患者(系膜IgA肾病2份,肾小球肾炎10份,尿毒症8份)及正常人尿液10份亦按上述方法分离出尿沉渣,同样保存。

    (二) 尿沉渣细胞中HFRSV RNA的提取 将上述提取的尿沉渣PBS洗涤3次置于双蒸水75μl中,加入裂解液(4mol/L异硫氰酸胍、10%十二烷基磺酸钠、3mol/L NaAc、0.5mol/L EDTA与等体积水饱和酚混合),混匀后加入氯仿与异戊醇(24∶1)50μl,室温离心 15 000r/min 5分钟,取上清100μl,二倍体积预冷无水乙醇-20°C沉淀30分钟,75%预冷乙醇洗涤,60°C烘干,直接在试管中进行反转录及第一次PCR扩增。

    (三) 引物设计 根据Kim等[1]报道的互补于HFRSV S片段[2,3]、Ⅰ型和Ⅱ型通用引物序列,引物由上海细胞生物研究所合成。其序列如下:SK1 5′-ATTGATGAACCTACAGGA C-3′,SK2 5′-AGCATGAAGGCAGAAGA G-3′,SK3,5′-ACAAGCATGTTGGTGGA C-3′,SK4 5′-TGTATCCCCATTGATTGT G-3′,其中SK1、SK4为外引物,SK2、SK3为内引物。
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    (四) cDNA合成及第一次PCR扩增 试剂均购自Promega公司。向上述已提取RNA管内加入10×反转录缓冲液2μl、2.5mol dNTP 1.6μl、正、反向外引物各25pmol/L、RNasin 10u、AMV2u、Taq酶0.5u,用石蜡油20μl覆盖。42°C水浴30分钟,然后放入DNA循环仪进行如下30次循环:94°C30秒,55°C30秒,72°C30秒。

    (五) 第二次PCR扩增 取第一次PCR产物1μl,向其中加入10×PCR缓冲液2μl、2.5mol dNTP 1.6μl、正向及反向内引物各25pmol/L、Taq酶0.5u,用石蜡油20μl覆盖。在DNA循环仪上按94°C30秒,55°C30秒,72°C30秒进行30次循环。取扩增产物10μl在1.5%琼脂糖凝胶中做电泳,以标准分子量为参考,在紫外透视仪下观察,在403bp处显现荧光者为阳性。

    结 果

    一、HFRS患者尿沉渣细胞中HFRSV RNA的检出
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    31例患者79份尿沉渣细胞中的HFRSV RNA的检出率为73.4%,其中发病1~7天为100%(见表1)。20份非HFRS患者及10份正常人尿标本检测均为阴性(见附图)。

    二、HFRS患者尿沉渣细胞中HFRSV RNA在不同病型HFRS患者中的检出情况

    附图 1~4,7~8为阳性结果;6为阴性结果;9为阴性对照;10为空白对照;5为标准分子量λDNA HindⅢ+EcoRI

    见表2。1~7病日,轻、中、重型患者尿沉渣细胞中均可检出HFRSV RNA; 8~12病日,轻、中型患者检出率开始下降,重型与中型、重型与轻型患者之间检出率出现明显差异,分别P<0.01和P<0.05,而中型与轻型患者之间检出率无差别,P>0.05。

, http://www.100md.com     表1 HFRS患者不同病程尿沉渣细胞中

    HFRSV RNA的检出率 病程(天)

    总例数

    阳性例数

    阳性率(%)

    1~7

    22

    22

    100

    8~12

    21

    17

    81
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    13~22

    23

    14

    61

    >22

    13

    5

    38.5

    合计

    79

    58

    73.4

    表2 不同病型HFRS患者尿沉渣细胞中
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    HFRSV RNA的检出率 病程

    (天)

    轻 型

    中 型

    重、危重型

    总例数

    阳性例数

    总例数

    阳性例数

    总例数

    阳性例数

    1~7

    4
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    4

    5

    5

    13

    13

    8~12

    4

    2

    6

    4

    11

    11

    ≥13

    4
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    0

    12

    2

    20

    17

    三、尿沉渣细胞中HFRSV RNA的检出率与肾脏损害的关系

    以尿蛋白的量为判断肾功能损伤的指标,尿蛋白阴性组、轻度增高组和重度蛋白尿组的检出率分别为33.3%、76.3%和100%,各组之间P值分别为P<0.01、P<0.01和P<0.05。同时尿沉渣细胞HFRSV RNA阳性与阴性组之间血清BUN值有明显差别(36.04±4.32,13.67±4.22,P<0.05)。讨 论

    通过对31例HFRS患者79份系列尿标本的动态检测发现,早期(1~7天)患者尿沉渣细胞中HFRSV RNA的检出率为100%,随着病程的进展检出率逐渐下降。在不同病型的患者中,轻、中型患者的检出率随病程增长明显下降,而重型患者下降幅度不大。在病程后期(≥13天)重症患者的检出率远较中型与轻型患者高,说明尿沉渣细胞中HFRSV RNA存在的时间与病型轻重有密切的关系。通过对肾功能损害临床指标观察,尿沉渣细胞中HFRSV RNA的检出率与肾损害的程度成正比。以上结果表明,在发病早期(1~7天),此时患者多处于发热、低血压休克期,临床上患者多突然出现大量蛋白尿、血尿和肾功能损害,可能为病毒对肾组织的直接损害[4~8]。重型患者在病程后期,尤其是在13病日以后,检出率明显高于轻、中型患者,此时多数患者处于多尿及恢复期,有二例重型患者在第30病日以上仍可在其尿沉渣细胞中检出HFRSV RNA,表明在重症患者病程后期,病毒仍对肾脏有损害作用。可能是临床重型患者多尿期二次肾衰及肾损害慢性化的主要原因。
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    综上所述,HFRS患者尿沉渣细胞中HFRSV RNA的检出率随病程而下降,说明早期原发性肾损伤为病毒直接作用所致,检出率与患者的病情轻重成正相关,与肾损害程度成正比,表明病毒的直接作用为肾脏损害的主要原因。所以临床抗病毒治疗应在早期进行,且重症患者抗病毒治疗疗程应延长,剂量应增大,以彻底阻断病毒的直接致病作用。对于病毒所激发的免疫损害及诱导产生的细胞因子和体液因子的作用,以及它们与病毒作用之间的相互关系,将在今后进一步研究。

    本实验方法操作简便,临床标本易采取,适用于早期临床诊断。

    本课题获卫生部回国人员基金资助

    参考文献

    1 Kim EC, Kim IS, Choi Y, et al. Rapid differentiation between Hantaan and Seoul viruses by polymerase Chain reaction and restriction enzyme analysis. J Med Virol, 1994, 43:245-249.
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    2 Schmaljohn CS, Jennings GB, Hay J, et al. Coding strategy of the S geneme segment of Hantaan virus. Virology, 1986, 155:633-638.

    3 Arikawa J, Lopenotiere HF, Iaconoccr L, et al. Coding properties of the S and the M genome segments of Sapporo rat virus:comparison to other causative agents of hemorrhagic fever with renal syndrome. Virology, 1990, 176:114-119.

    4 Cogriff TM, Lewis RM. Mechanisms of disease in hemorrhagic fever with renal syndrome. Kidney International, 1991,40(Suppl.35):72-80.
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    5 王嘉瑞,杨佩珍,吴谦,等.流行性出血热发病机理的研究.上海医学,1981,4:5-8.

    6 黎磊石,李莉,陈惠平,等.流行性出血热的免疫性肾脏损害.中华内科杂志,1988,27:10-12.

    7 Grankvist O, Jnto P, settergren B, et al. Detection of nephropathia epeidmica virus in patient samples using a nested primer-based polymerase chain reaction. J Infect Dis, 1992,165:934-939.

    8 沈克勤,黎磊石,周虹,等.肾综合征出血热患者肾组织及血液中出血热病毒RNA的检测及临床意义.中华医学杂志,1993,73:609-611., 百拇医药