钙离子阻滞剂在肝脏灌注保存中保护作用的研究
作者：张浩 王学浩 张峰
单位：南京医科大学第一附属医院肝胆外科
关键词：冷灌注保存 钙离子阻滞剂 肝细胞内游离钙浓度([Ca2+]I) 能量代谢
江苏医药990104 摘要 为观察钙离子阻滞剂在肝脏灌注中的保护作用，选择SD大鼠为实验动物，使用尼莫地平，经门静脉不同压力下冷灌注保存。检测各组的高能磷酸化合物、肝细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)、超微结构病理变化。结果发现，肝细胞超微结构在80cmH2O、60cmH2O压力下受到相应的损伤，而应用钙离子阻滞剂后损伤得到明显的改善；同时实验结果显示在60cmH2O、80cmH2O组使用钙离子阻滞剂后，三磷酸腺苷(ATP)含量及能量值(EC值)上升，阻止[Ca2+]i降低，减轻肝细胞损伤。
, http://www.100md.com
进行临床肝移植的先决条件是要有高质量的供肝，肝脏的来源主要有两方面：①人的尸体供肝；②活体部分供肝。在我国，脑死亡法规尚未确立，供肝来源成为阻碍肝移植的一个重要原因。因而如何取得高质量的供肝，显得至关重要。本实验选择SD大鼠为实验动物，经门静脉不同压力下冷灌注保存，设组使用钙离子阻滞剂，观测钙离子阻滞剂在肝脏灌注保存中保护作用。
材料和方法
一、动物及分组
SD大鼠120只，雌雄各半，体重200±10g。随机分成四组。
Ⅰ组：对照组。分三类：A类腹腔内不注射药物；B类术前24小时及1小时注射生理盐水；C类术前24小时及1小时注射尼莫地平0.5mg/g。不进行灌注，麻醉后即切开腹腔取标本。
Ⅱ组：灌注压40cmH2O，同时分A、B、C类灌注，分类条件同Ⅰ组。
, 百拇医药
Ⅲ组：灌注压60cmH2O，同时分A、B、C类灌注，分类条件同Ⅰ组。
Ⅳ组：灌注压80cmH2O，同时分A、B、C类灌注，分类条件同Ⅰ组。
二、动物模型的建立
术前用1%戊巴比妥钠0.5ml腹腔注射麻醉，弧形切开腹腔，游离出门静脉远端并结扎，插管并灌注4℃Collin?s液，即刻切开上腔静脉，以开放流出道。切取肝脏置于4℃Collin?s液中保存1.5小时。切取部位固定在鼠肝的左二叶。
三、标本收集及测试方法
1.肝组织中磷酸腺苷(ATP、ADP、AMP)含量测定
(1)标本收集：各组取肝组织约1g置于液氮中保存。
, 百拇医药
(2)试剂：ATP二钠，ADP二钠，AMP标准品由南京华东医药公司提供，高氯酸、氢氧化钾、甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾均分析纯产品，所需试剂均临时配制。
(3)仪器：采用美国Waters高效液相色谱仪、510泵(510HPLC Pump)、996PDA检测器、Mileunnium2010色谱工作站，图像、数据处理利用专业Windows软件。
(4)标本处理：标本从液氮中取出，迅速称取500mg，精确至0.001g，置于1ml0.4NHCLO4溶液中研磨5～8min(冰浴)低温离心10000转/分15分钟，取上清，0.6NKOH中和使pH值为7.0，再次低温下离心，取上清进行检测。上清可保存于-30℃冰箱中待测，但时间不宜过长。
2.肝细胞内游离钙浓度的检测
(1)肝细胞悬液制备：取肝组织约2g置于4℃1640培养液中，冰浴下，剪切成约1mm大小，动作须轻柔，用200目尼龙网过滤，低温离心4000转/分，15min。去上清，加1ml1640培养液混匀成悬液，备用。
, 百拇医药
(2)试剂：Fura-2AM粉剂及DMEM均购自Sigma公司，小牛血清购自上海生化所，其它试剂均为分析纯。
(3)仪器：AR-CM-MIC阳离子测定仪，美国SPEX公司生产，离心机、恒温孵箱、倒置显微镜Olymphas公司生产。
(4)肝细胞悬液处理：
①将制备的肝细胞悬液吸取0.1ml+小牛血清+无钙Krebs缓冲液+Fura-2/AM30℃温孵35～40min，负载后，用无钙Krebs缓冲液洗脱二次，分别离心，弃上清，加入无钙缓冲液后即制成肝细胞悬液。②取悬液置于载玻片上，通过样品选择窗口来选择样品中的单细胞测定，激发光波长分别为340nm和380nm，发射光波长为505nm采样间隙为1.0S，连续记录细胞的荧光强度得出F340nm/F380nm的比值。根据荧光比值，输入各种参数，使用DM3000软件，计算机可自动计算[Ca2+]i。[Ca2+]i的计算公式为：[Ca2+]i＝Kd.(FD/Fs).(R-Rmin)/(Rmax-R)
, 百拇医药
3.病理、超微结构观察
(1)光镜观察：各组取肝组织用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片(5μm)HE染色后光镜下观察。
(2)透射电镜观察：取各组肝组织标本，处理后在PHILIPS EM-400透射电镜下观察摄片。
四、数据处理
所有结果均以
±s表示。统计方法采用Student t检验，显著性水平为P<0.05。
, 百拇医药
结 果
一、标本的大体改变
各组在灌注后即刻变白，除80cmH2O组肝脏较硬外，其它各组肝脏均柔软。
二、高能磷酸化合物及细胞内游离钙浓度
高能磷酸化合物ATP是供能的主要形式，另外2ADP→ATP+AMP及ADP降解为AMP时均有能量释放，所以在评价一组织的能量时常常采用Atkinson?s能量价公式，能量价(ENERGY CHARGE，EC)＝(ATP+1/2ADP)/(ATP+ADP+AMP)，这里也采用这种表达方式。ATP的含量测定结果见表1，EC值见表2。随着灌注压力的增高，ATP、EC下降，应用尼莫地平后ATP、EC明显增高。细胞内游离钙离子浓度测定结果如表3所示，随着灌注压力的增高，[Ca2+]i增高，应用尼莫地平后[Ca2+]i明显下降。
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如表1、2、3所示，对照组内A、B、C三类间无显著性差异(P>0.05)；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组与对照组Ⅰ中各相应类项相比有显著性差异(P<0.05)；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组内A、B两类间无显著性差异(P>0.05)；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组内C类与A、B类项相比有显著性差异(P<0.05)。
表1 各组肝组织ATP(μmol.g-1)值
A类
B类
C类
Ⅰ组
1.493±0.244
1.324±0.330
1.355±0.204
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Ⅱ组
1.020±0.182
1.259±0.109
1.011±0.321
Ⅲ组
0.939±0.351
1.107±0.437
1.056±0.364
Ⅳ组
0.430±0.233
0.599±0.335
0.761±0.258
, 百拇医药
表2 各组肝组织EC值
A类
B类
C类
Ⅰ组
0.662±0.111
0.575±0.108
0.426±0.052
Ⅱ组
0.465±0.084
0.484±0.068
0.686±0.088
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Ⅲ组
0.444±0.106
0.460±0.054
0.668±0.077
Ⅳ组
0.372±0.036
0.353±0.023
0.473±0.052
表3 各组细胞内游离钙浓度(nmol.L-1)
A类
B类
, 百拇医药
C类
Ⅰ组
103.60±4.87
103.80±4.75
102.60±5.38
Ⅱ组
121.00±8.22
125.00±12.00
116.50±12.60
Ⅲ组
160.50±17.80
171.70±15.30
, 百拇医药
125.00±17.80
Ⅳ组
279.80±21.35
264.20±13.50
190.00±26.60
三、电镜观察结果
Ⅰ组(无论是否加尼莫地平)超微结构保存均较好，与正常对照组无明显差异。
Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组大鼠肝细胞可见一些线粒体肿胀、嵴排列紊乱、模糊、基质淡、内质网扩张等变化，并随压力的增高上述变化程度增加。应用钙离子阻滞剂后这些改变有所减轻。
四、光镜观察结果
, 百拇医药 Ⅰ组中见肝组织结构无异常；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组中A、B见肝细胞浊肿、肝窦扩张充血、肝细胞坏死及灶性出血、汇管区淋巴细胞侵润并随压力的增高上述变化程度增加，而应用钙离子阻滞剂后即各组的C类改变明显减轻。讨 论
正常的肝细胞膜能逆Ca2+浓度梯度泵出Ca2+，其主要是通过能量依赖Ca2+―ATP酶和Na+交换系统，这一能量消耗系统在缺血缺氧的情况下仍然需要消耗ATP。
有临床经验证明，钙离子阻滞剂的应用具有有益效果，但其机制尚未阐明，Thomas等推论[1]，如果肝细胞Na+/K+梯度保持平衡，细胞膜的损伤即减轻，Ca2+内流被避免。另外如果被动转运离子通道被药物阻断，则通过膜的离子减少，维持Na+/K+梯度所需能量减少，因而在肝脏的保存中应用钙离子阻滞剂以阻止Ca2+内流，减轻钙超载，使细胞及细胞器膜的损伤减小，有助于保持肝细胞Na+/K+梯度平衡，减轻肝细胞泵出Ca2+负荷，从而降低能量消耗[2～4]。
, 百拇医药
本实验通过肝细胞超微结构的观察，可知80cmH2O、60cmH2O压力下肝细胞受到相应的损伤，而应用钙离子阻滞剂后其损伤得到明显的改善。
实验观察中还可知在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组使用钙离子阻滞剂后，较未使用者肝细胞内游离钙浓度明显下降，分别为12.0%、12.5%及28.6%，而Ⅰ组无明显改变。
同时实验结果显示在Ⅲ、Ⅳ组使用钙离子阻滞剂后，较未使用者肝组织中的ATP含量及EC值均较同组上升，ATP分别上升了12.40%及76.98%，EC分别上升了50.50%和27.20%而Ⅰ、Ⅱ组无明显改变。
本实验研究结果显示，随着灌注压的增高，肝细胞内游离钙浓度升高，ATP及EC值下降。说明不适当的压力会导致肝细胞内钙超载，能量消耗。电镜结果证实肝细胞受到相应损伤，推测可能在压力增高的情况下，细胞质膜上钠-钙交换异常，可导致钙离子的被动性弥散增加，细胞内游离钙浓度增高，形成钙超载，钙超载可引起线粒体内氧化磷酸化过程障碍以及胞浆内磷脂酶、蛋白酶等激活，可导致并促进细胞的不可逆性损伤[5，6]。本实验选用了尼莫地平作为钙离子阻滞剂，在同一压力条件下，使用尼莫地平后肝细胞损伤程度明显改善，细胞内游离钙浓度显著下降，ATP及EC值均上升，而在未灌注的对照组中未有明显改变，说明在肝细胞受到损伤时，阻止钙离子的被动性弥散，减轻钙超载，起到对肝细胞的保护作用，同时致使能量消耗减小，对肝脏移植物的活性起到保护作用。
, 百拇医药
邮政编码：210029
参考文献
[1] Thomas A， et al. Transplantation 1995；59：904.
[2] Nishikawa Y， et al. Liver 1994 Aug； 14(4)：200.
[3] Otto G， et al. Tansplantation 1986；42：122.
[4] Foegh ML， et al. Transplantation 1985；40：211.
[5] Kimura J， et al. Transplant Proc 1994 Aug； 26(4)：2272.
[6] Smeland E， et al. Anticancer Res 1995；15(4)：1221.
(1998年8月30日收稿 同年10月5日修回), 百拇医药
单位：南京医科大学第一附属医院肝胆外科
关键词：冷灌注保存 钙离子阻滞剂 肝细胞内游离钙浓度([Ca2+]I) 能量代谢
江苏医药990104 摘要 为观察钙离子阻滞剂在肝脏灌注中的保护作用，选择SD大鼠为实验动物，使用尼莫地平，经门静脉不同压力下冷灌注保存。检测各组的高能磷酸化合物、肝细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)、超微结构病理变化。结果发现，肝细胞超微结构在80cmH2O、60cmH2O压力下受到相应的损伤，而应用钙离子阻滞剂后损伤得到明显的改善；同时实验结果显示在60cmH2O、80cmH2O组使用钙离子阻滞剂后，三磷酸腺苷(ATP)含量及能量值(EC值)上升，阻止[Ca2+]i降低，减轻肝细胞损伤。
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进行临床肝移植的先决条件是要有高质量的供肝，肝脏的来源主要有两方面：①人的尸体供肝；②活体部分供肝。在我国，脑死亡法规尚未确立，供肝来源成为阻碍肝移植的一个重要原因。因而如何取得高质量的供肝，显得至关重要。本实验选择SD大鼠为实验动物，经门静脉不同压力下冷灌注保存，设组使用钙离子阻滞剂，观测钙离子阻滞剂在肝脏灌注保存中保护作用。
材料和方法
一、动物及分组
SD大鼠120只，雌雄各半，体重200±10g。随机分成四组。
Ⅰ组：对照组。分三类：A类腹腔内不注射药物；B类术前24小时及1小时注射生理盐水；C类术前24小时及1小时注射尼莫地平0.5mg/g。不进行灌注，麻醉后即切开腹腔取标本。
Ⅱ组：灌注压40cmH2O，同时分A、B、C类灌注，分类条件同Ⅰ组。
, 百拇医药
Ⅲ组：灌注压60cmH2O，同时分A、B、C类灌注，分类条件同Ⅰ组。
Ⅳ组：灌注压80cmH2O，同时分A、B、C类灌注，分类条件同Ⅰ组。
二、动物模型的建立
术前用1%戊巴比妥钠0.5ml腹腔注射麻醉，弧形切开腹腔，游离出门静脉远端并结扎，插管并灌注4℃Collin?s液，即刻切开上腔静脉，以开放流出道。切取肝脏置于4℃Collin?s液中保存1.5小时。切取部位固定在鼠肝的左二叶。
三、标本收集及测试方法
1.肝组织中磷酸腺苷(ATP、ADP、AMP)含量测定
(1)标本收集：各组取肝组织约1g置于液氮中保存。
, 百拇医药
(2)试剂：ATP二钠，ADP二钠，AMP标准品由南京华东医药公司提供，高氯酸、氢氧化钾、甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾均分析纯产品，所需试剂均临时配制。
(3)仪器：采用美国Waters高效液相色谱仪、510泵(510HPLC Pump)、996PDA检测器、Mileunnium2010色谱工作站，图像、数据处理利用专业Windows软件。
(4)标本处理：标本从液氮中取出，迅速称取500mg，精确至0.001g，置于1ml0.4NHCLO4溶液中研磨5～8min(冰浴)低温离心10000转/分15分钟，取上清，0.6NKOH中和使pH值为7.0，再次低温下离心，取上清进行检测。上清可保存于-30℃冰箱中待测，但时间不宜过长。
2.肝细胞内游离钙浓度的检测
(1)肝细胞悬液制备：取肝组织约2g置于4℃1640培养液中，冰浴下，剪切成约1mm大小，动作须轻柔，用200目尼龙网过滤，低温离心4000转/分，15min。去上清，加1ml1640培养液混匀成悬液，备用。
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(2)试剂：Fura-2AM粉剂及DMEM均购自Sigma公司，小牛血清购自上海生化所，其它试剂均为分析纯。
(3)仪器：AR-CM-MIC阳离子测定仪，美国SPEX公司生产，离心机、恒温孵箱、倒置显微镜Olymphas公司生产。
(4)肝细胞悬液处理：
①将制备的肝细胞悬液吸取0.1ml+小牛血清+无钙Krebs缓冲液+Fura-2/AM30℃温孵35～40min，负载后，用无钙Krebs缓冲液洗脱二次，分别离心，弃上清，加入无钙缓冲液后即制成肝细胞悬液。②取悬液置于载玻片上，通过样品选择窗口来选择样品中的单细胞测定，激发光波长分别为340nm和380nm，发射光波长为505nm采样间隙为1.0S，连续记录细胞的荧光强度得出F340nm/F380nm的比值。根据荧光比值，输入各种参数，使用DM3000软件，计算机可自动计算[Ca2+]i。[Ca2+]i的计算公式为：[Ca2+]i＝Kd.(FD/Fs).(R-Rmin)/(Rmax-R)
, 百拇医药
3.病理、超微结构观察
(1)光镜观察：各组取肝组织用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片(5μm)HE染色后光镜下观察。
(2)透射电镜观察：取各组肝组织标本，处理后在PHILIPS EM-400透射电镜下观察摄片。
四、数据处理
所有结果均以
±s表示。统计方法采用Student t检验，显著性水平为P<0.05。, 百拇医药
结 果
一、标本的大体改变
各组在灌注后即刻变白，除80cmH2O组肝脏较硬外，其它各组肝脏均柔软。
二、高能磷酸化合物及细胞内游离钙浓度
高能磷酸化合物ATP是供能的主要形式，另外2ADP→ATP+AMP及ADP降解为AMP时均有能量释放，所以在评价一组织的能量时常常采用Atkinson?s能量价公式，能量价(ENERGY CHARGE，EC)＝(ATP+1/2ADP)/(ATP+ADP+AMP)，这里也采用这种表达方式。ATP的含量测定结果见表1，EC值见表2。随着灌注压力的增高，ATP、EC下降，应用尼莫地平后ATP、EC明显增高。细胞内游离钙离子浓度测定结果如表3所示，随着灌注压力的增高，[Ca2+]i增高，应用尼莫地平后[Ca2+]i明显下降。
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如表1、2、3所示，对照组内A、B、C三类间无显著性差异(P>0.05)；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组与对照组Ⅰ中各相应类项相比有显著性差异(P<0.05)；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组内A、B两类间无显著性差异(P>0.05)；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组内C类与A、B类项相比有显著性差异(P<0.05)。
表1 各组肝组织ATP(μmol.g-1)值
A类
B类
C类
Ⅰ组
1.493±0.244
1.324±0.330
1.355±0.204
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Ⅱ组
1.020±0.182
1.259±0.109
1.011±0.321
Ⅲ组
0.939±0.351
1.107±0.437
1.056±0.364
Ⅳ组
0.430±0.233
0.599±0.335
0.761±0.258
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表2 各组肝组织EC值
A类
B类
C类
Ⅰ组
0.662±0.111
0.575±0.108
0.426±0.052
Ⅱ组
0.465±0.084
0.484±0.068
0.686±0.088
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Ⅲ组
0.444±0.106
0.460±0.054
0.668±0.077
Ⅳ组
0.372±0.036
0.353±0.023
0.473±0.052
表3 各组细胞内游离钙浓度(nmol.L-1)
A类
B类
, 百拇医药
C类
Ⅰ组
103.60±4.87
103.80±4.75
102.60±5.38
Ⅱ组
121.00±8.22
125.00±12.00
116.50±12.60
Ⅲ组
160.50±17.80
171.70±15.30
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125.00±17.80
Ⅳ组
279.80±21.35
264.20±13.50
190.00±26.60
三、电镜观察结果
Ⅰ组(无论是否加尼莫地平)超微结构保存均较好，与正常对照组无明显差异。
Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组大鼠肝细胞可见一些线粒体肿胀、嵴排列紊乱、模糊、基质淡、内质网扩张等变化，并随压力的增高上述变化程度增加。应用钙离子阻滞剂后这些改变有所减轻。
四、光镜观察结果
, 百拇医药 Ⅰ组中见肝组织结构无异常；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组中A、B见肝细胞浊肿、肝窦扩张充血、肝细胞坏死及灶性出血、汇管区淋巴细胞侵润并随压力的增高上述变化程度增加，而应用钙离子阻滞剂后即各组的C类改变明显减轻。讨 论
正常的肝细胞膜能逆Ca2+浓度梯度泵出Ca2+，其主要是通过能量依赖Ca2+―ATP酶和Na+交换系统，这一能量消耗系统在缺血缺氧的情况下仍然需要消耗ATP。
有临床经验证明，钙离子阻滞剂的应用具有有益效果，但其机制尚未阐明，Thomas等推论[1]，如果肝细胞Na+/K+梯度保持平衡，细胞膜的损伤即减轻，Ca2+内流被避免。另外如果被动转运离子通道被药物阻断，则通过膜的离子减少，维持Na+/K+梯度所需能量减少，因而在肝脏的保存中应用钙离子阻滞剂以阻止Ca2+内流，减轻钙超载，使细胞及细胞器膜的损伤减小，有助于保持肝细胞Na+/K+梯度平衡，减轻肝细胞泵出Ca2+负荷，从而降低能量消耗[2～4]。
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本实验通过肝细胞超微结构的观察，可知80cmH2O、60cmH2O压力下肝细胞受到相应的损伤，而应用钙离子阻滞剂后其损伤得到明显的改善。
实验观察中还可知在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组使用钙离子阻滞剂后，较未使用者肝细胞内游离钙浓度明显下降，分别为12.0%、12.5%及28.6%，而Ⅰ组无明显改变。
同时实验结果显示在Ⅲ、Ⅳ组使用钙离子阻滞剂后，较未使用者肝组织中的ATP含量及EC值均较同组上升，ATP分别上升了12.40%及76.98%，EC分别上升了50.50%和27.20%而Ⅰ、Ⅱ组无明显改变。
本实验研究结果显示，随着灌注压的增高，肝细胞内游离钙浓度升高，ATP及EC值下降。说明不适当的压力会导致肝细胞内钙超载，能量消耗。电镜结果证实肝细胞受到相应损伤，推测可能在压力增高的情况下，细胞质膜上钠-钙交换异常，可导致钙离子的被动性弥散增加，细胞内游离钙浓度增高，形成钙超载，钙超载可引起线粒体内氧化磷酸化过程障碍以及胞浆内磷脂酶、蛋白酶等激活，可导致并促进细胞的不可逆性损伤[5，6]。本实验选用了尼莫地平作为钙离子阻滞剂，在同一压力条件下，使用尼莫地平后肝细胞损伤程度明显改善，细胞内游离钙浓度显著下降，ATP及EC值均上升，而在未灌注的对照组中未有明显改变，说明在肝细胞受到损伤时，阻止钙离子的被动性弥散，减轻钙超载，起到对肝细胞的保护作用，同时致使能量消耗减小，对肝脏移植物的活性起到保护作用。
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邮政编码：210029
参考文献
[1] Thomas A， et al. Transplantation 1995；59：904.
[2] Nishikawa Y， et al. Liver 1994 Aug； 14(4)：200.
[3] Otto G， et al. Tansplantation 1986；42：122.
[4] Foegh ML， et al. Transplantation 1985；40：211.
[5] Kimura J， et al. Transplant Proc 1994 Aug； 26(4)：2272.
[6] Smeland E， et al. Anticancer Res 1995；15(4)：1221.
(1998年8月30日收稿 同年10月5日修回), 百拇医药