三才汤不同溶媒提取液对D-半乳糖衰老小鼠睾丸线粒体GSH-Px、LPO影响的实验研究1
作者：曲凤玉 魏晓东 李士莉 王玉民 白书阁 栗坤 白晶
单位：曲凤玉 魏晓东 李士莉 王玉民 白书阁(佳木斯大学医学院生化教研室，佳木斯 154002)；栗 坤(佳木斯大学医学院药理教研室)；白 晶(佳木斯大学医学院图书馆)
关键词：三才汤；线粒体；谷胱甘肽过氧化物酶；过氧化脂质；抗衰老
中国老年学杂志/990125 摘 要 研究了小鼠睾丸线粒线GSH-Px、LPO增龄性变化及三才汤不同溶媒提取液对衰老小鼠睾丸线粒体GSH-Px、LPO的影响。结果表明，小鼠睾丸线粒体GSH-Px活性中年期后开始下降，LPO含量则随增龄而升高。三才汤醇提液和水提液均能显著提高小鼠睾丸线粒体GSH-Px活性(P<0.01)，能显著降低小鼠睾丸线粒体LPO含量(P<0.01或P<0.05)；但是氯仿提取液即不能提高小鼠睾丸线粒体GSH-Px活性，也不能降低LPO含量。
, 百拇医药
三才汤是中医药古典补益经方，由人参、熟地黄、天门冬各等份配伍而成。《治法机要》和《温病条辨》记载三才汤具有益气养阴，延年益寿之功效。有关三才汤的现代药理研究未见报道。本实验通过观察小鼠睾丸线粒体GSH-Px及LPO的随龄变化趋势，进一步观察对比三才汤水提液、氯仿提取液和乙醇提取液对D-半乳糖致小鼠亚急性衰老模型〔1〕睾丸线粒体GSH-Px活性和LPO含量的影响，探讨三才汤抗氧化作用和抗衰老机制。
1 材料与方法
1.1 动物 昆明种健康雄性小白鼠，3～4月龄，体重20±2 g；6～7月龄，体重30±2 g，由白求恩医科大学动物部提供。人参、熟地黄、天门冬由佳木斯市药材公司提供，由本院生药教研室鉴定。
1.2 试剂和仪器 氯仿(分析纯)、乙醇(95%)由沈阳化学试剂厂生产；D-半乳糖由上海试剂二厂生产，GSH-Px测试盒、蛋白定量测试盒由南京建成生物工程研究所提供。上海722B型光度计，江苏FIQ-2型旋涡混匀器，创新电热恒温水浴箱，湖南GL20A低温高速离心机。
, 百拇医药
1.3 实验方法
1.3.1 药物制备 将人参、熟地黄、天门冬热空气烘干，粉碎成粗粉。各称取25 g混合，用375 ml蒸馏水(W/V=1∶5)回流提取3次，合并3次提取液，稀释至相当于生药浓度0.7 g/ml，为水提液；另取等量三味药，用375 ml氯仿回流提取3次，合并提取液，回收氯仿，热水浴挥尽氯仿，将药材挥干；继续用95%乙醇375 ml继续回流提取3次，合并提取液，回收乙醇，热水浴挥尽乙醇，提取液分别用蒸馏水稀释至生药浓度0.7 g/ml，冷藏备用。
1.3.2 动物处理 将3～4月龄昆明种健康雄性小白鼠随机分成6组，青年对照组(12只)，衰老模型对照组(12只)，模型给药组(3×10只)，6～7月龄为中年对照组(12只)，各组分笼饲养，1 w后，将青年组与中年组小鼠断头处死，立即取出睾丸，用4 ℃含1.15% KCl的0.1 M tris-HCl缓冲液(pH=4)制成睾丸匀浆(W/V)，1 000 r/min离心10 min，取上清10 000 r/min离心 30 min，得线粒体沉淀，用上述缓冲液制成线粒体悬液〔2〕。衰老模型组皮下注射D-半乳糖(7 mg/ml，100 mg/kg体重)，同时灌胃温开水连续30 d，其它处理同青年组和中年组。模型给药组皮下注射D-半乳糖同时，灌胃三才汤水提液、氯仿提取液和乙醇提取液(5 g/kg体重)连续3 d，其它处理同上。
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1.4 指标测定 GSH-Px测定，蛋白定量(双缩尿法)按试剂盒说明程序进行；LPO测定，TBA法〔3〕。
1.5 统计学方法 各项指标用均数±标准差(
±s)表示，实验数据统计学处理采用方差分析、q检验。
2 结 果
各组实验前后睾丸线粒体GSH-Px活性及LPO含量见表1。
表1 小鼠睾丸线粒体GSH-Px、LPO随龄变化及三才汤不同
溶媒提取液对其影响(±s) 组 别
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n
GSH-Px
(单位/mg蛋白)
LPO
(nmol/mg蛋白)
青年对照组
12
10.34±1.36
4.11±0.62
中年对照组
12
15.13±1634
, 百拇医药
10.85±1.54
衰老模型对照组
12
13.07±1.673)
15.43±2.073)
三才汤水提液组
10
20.97±2.402)
13.22±1.981)
三才汤氯仿提取液组
10
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12.47±2.21
15.51±2.09
三才汤乙醇提取液组
10
18.13±2.332)
11.51±1.882)
与衰老模型组相比1)P<0.05，2)P<0.01；与中年组相比：3)P<0.01
实验结果表明小鼠睾丸线粒体GSH-Px活性中年期后开始下降，LPO含量则随增龄而升高，与文献〔4，2〕报道一致。三才汤水提液、乙醇提取液均能显著提高衰老小鼠睾丸线粒体GSH-Px活性(P<0.01)，降低LPO含量(P<0.05或P<0.01)；但脂溶性的氯仿提取液不能提高衰老小鼠睾丸线粒体GSH-Px活性，亦不能降低LPO含量。线粒体是细胞内氧代谢的主要场所，其膜上又富含多不饱和脂肪酸，使得线粒体成为自由基进攻的主要靶部位〔5〕，实验研究表明生物体内一种抗氧化剂可部分地被另一种抗氧化剂取代，许多传统的补益中药含有天然的抗氧化成分，运用中药来补充外源性抗氧化剂或促使机体产生内源性的抗氧化物质，抑制脂质过氧化损伤，是中药延缓衰老的重要机制。三才汤的组方人参〔6〕、熟地黄〔6〕、天门冬〔7〕均有含抗氧化成分的报道。本实验结果提示三才汤脂溶性的提取液对衰老小鼠睾丸线粒体无抗氧化作用，而极性溶剂提取液对衰老小鼠睾丸线粒体有抗氧化作用。三才汤不同溶媒提取液对衰老模型小鼠睾丸线粒体GSH-Px、LPO影响的差异，可能是抗氧化成分在不同溶媒中的溶出率不同，也可能是中药抗氧化作用的选择性所致。本实验研究为抗衰老中药筛选中剂型的选择提供了可靠的实验依据。
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1 黑龙江省自然科学基金资助项目D9818，黑龙江省教委科研项目
作者简介：曲凤玉，女，34岁，讲师，硕士，从事衰老生化机制与中药抗衰老研究
参考文献
1 龚国清，徐敝本.小鼠衰老模型研究.中国药科大学学报，1991；22(2)：103
2 詹 皓，孙存普，刘传缋 et al.衰老过程中雄性大鼠脏器自由基浓度和过氧化脂质的变化.中华老年医学杂志，1991；10(3)：166
3 陈顺忠，金有余，李常淳 et al.过氧化脂质显色的三种方法比较.临床检验杂志，1984；2(4)：8
4 田清涞，李云兰.酶与衰老.老年学杂志，1993；13(6)：372
5 高姝娟，刘锡锰，高 贵.谷胱甘肽的抗线粒体脂质过氧化作用.生物化学杂志，1997；13 (3)：287
6 孟 申，张之南.中药有效成分抗氧化作用的实验研究.中国药理学通报，1992；10(5)：326
7 藏堂.传统益寿精要.第1版，北京：世界图书出版公司，1992：262
〔1998-08-15收稿 1998-12-01修回〕, http://www.100md.com
单位：曲凤玉 魏晓东 李士莉 王玉民 白书阁(佳木斯大学医学院生化教研室，佳木斯 154002)；栗 坤(佳木斯大学医学院药理教研室)；白 晶(佳木斯大学医学院图书馆)
关键词：三才汤；线粒体；谷胱甘肽过氧化物酶；过氧化脂质；抗衰老
中国老年学杂志/990125 摘 要 研究了小鼠睾丸线粒线GSH-Px、LPO增龄性变化及三才汤不同溶媒提取液对衰老小鼠睾丸线粒体GSH-Px、LPO的影响。结果表明，小鼠睾丸线粒体GSH-Px活性中年期后开始下降，LPO含量则随增龄而升高。三才汤醇提液和水提液均能显著提高小鼠睾丸线粒体GSH-Px活性(P<0.01)，能显著降低小鼠睾丸线粒体LPO含量(P<0.01或P<0.05)；但是氯仿提取液即不能提高小鼠睾丸线粒体GSH-Px活性，也不能降低LPO含量。
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三才汤是中医药古典补益经方，由人参、熟地黄、天门冬各等份配伍而成。《治法机要》和《温病条辨》记载三才汤具有益气养阴，延年益寿之功效。有关三才汤的现代药理研究未见报道。本实验通过观察小鼠睾丸线粒体GSH-Px及LPO的随龄变化趋势，进一步观察对比三才汤水提液、氯仿提取液和乙醇提取液对D-半乳糖致小鼠亚急性衰老模型〔1〕睾丸线粒体GSH-Px活性和LPO含量的影响，探讨三才汤抗氧化作用和抗衰老机制。
1 材料与方法
1.1 动物 昆明种健康雄性小白鼠，3～4月龄，体重20±2 g；6～7月龄，体重30±2 g，由白求恩医科大学动物部提供。人参、熟地黄、天门冬由佳木斯市药材公司提供，由本院生药教研室鉴定。
1.2 试剂和仪器 氯仿(分析纯)、乙醇(95%)由沈阳化学试剂厂生产；D-半乳糖由上海试剂二厂生产，GSH-Px测试盒、蛋白定量测试盒由南京建成生物工程研究所提供。上海722B型光度计，江苏FIQ-2型旋涡混匀器，创新电热恒温水浴箱，湖南GL20A低温高速离心机。
, 百拇医药
1.3 实验方法
1.3.1 药物制备 将人参、熟地黄、天门冬热空气烘干，粉碎成粗粉。各称取25 g混合，用375 ml蒸馏水(W/V=1∶5)回流提取3次，合并3次提取液，稀释至相当于生药浓度0.7 g/ml，为水提液；另取等量三味药，用375 ml氯仿回流提取3次，合并提取液，回收氯仿，热水浴挥尽氯仿，将药材挥干；继续用95%乙醇375 ml继续回流提取3次，合并提取液，回收乙醇，热水浴挥尽乙醇，提取液分别用蒸馏水稀释至生药浓度0.7 g/ml，冷藏备用。
1.3.2 动物处理 将3～4月龄昆明种健康雄性小白鼠随机分成6组，青年对照组(12只)，衰老模型对照组(12只)，模型给药组(3×10只)，6～7月龄为中年对照组(12只)，各组分笼饲养，1 w后，将青年组与中年组小鼠断头处死，立即取出睾丸，用4 ℃含1.15% KCl的0.1 M tris-HCl缓冲液(pH=4)制成睾丸匀浆(W/V)，1 000 r/min离心10 min，取上清10 000 r/min离心 30 min，得线粒体沉淀，用上述缓冲液制成线粒体悬液〔2〕。衰老模型组皮下注射D-半乳糖(7 mg/ml，100 mg/kg体重)，同时灌胃温开水连续30 d，其它处理同青年组和中年组。模型给药组皮下注射D-半乳糖同时，灌胃三才汤水提液、氯仿提取液和乙醇提取液(5 g/kg体重)连续3 d，其它处理同上。
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1.4 指标测定 GSH-Px测定，蛋白定量(双缩尿法)按试剂盒说明程序进行；LPO测定，TBA法〔3〕。
1.5 统计学方法 各项指标用均数±标准差(
±s)表示，实验数据统计学处理采用方差分析、q检验。2 结 果
各组实验前后睾丸线粒体GSH-Px活性及LPO含量见表1。
表1 小鼠睾丸线粒体GSH-Px、LPO随龄变化及三才汤不同
溶媒提取液对其影响(
±s) 组 别, 百拇医药
n
GSH-Px
(单位/mg蛋白)
LPO
(nmol/mg蛋白)
青年对照组
12
10.34±1.36
4.11±0.62
中年对照组
12
15.13±1634
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10.85±1.54
衰老模型对照组
12
13.07±1.673)
15.43±2.073)
三才汤水提液组
10
20.97±2.402)
13.22±1.981)
三才汤氯仿提取液组
10
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12.47±2.21
15.51±2.09
三才汤乙醇提取液组
10
18.13±2.332)
11.51±1.882)
与衰老模型组相比1)P<0.05，2)P<0.01；与中年组相比：3)P<0.01
实验结果表明小鼠睾丸线粒体GSH-Px活性中年期后开始下降，LPO含量则随增龄而升高，与文献〔4，2〕报道一致。三才汤水提液、乙醇提取液均能显著提高衰老小鼠睾丸线粒体GSH-Px活性(P<0.01)，降低LPO含量(P<0.05或P<0.01)；但脂溶性的氯仿提取液不能提高衰老小鼠睾丸线粒体GSH-Px活性，亦不能降低LPO含量。线粒体是细胞内氧代谢的主要场所，其膜上又富含多不饱和脂肪酸，使得线粒体成为自由基进攻的主要靶部位〔5〕，实验研究表明生物体内一种抗氧化剂可部分地被另一种抗氧化剂取代，许多传统的补益中药含有天然的抗氧化成分，运用中药来补充外源性抗氧化剂或促使机体产生内源性的抗氧化物质，抑制脂质过氧化损伤，是中药延缓衰老的重要机制。三才汤的组方人参〔6〕、熟地黄〔6〕、天门冬〔7〕均有含抗氧化成分的报道。本实验结果提示三才汤脂溶性的提取液对衰老小鼠睾丸线粒体无抗氧化作用，而极性溶剂提取液对衰老小鼠睾丸线粒体有抗氧化作用。三才汤不同溶媒提取液对衰老模型小鼠睾丸线粒体GSH-Px、LPO影响的差异，可能是抗氧化成分在不同溶媒中的溶出率不同，也可能是中药抗氧化作用的选择性所致。本实验研究为抗衰老中药筛选中剂型的选择提供了可靠的实验依据。
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1 黑龙江省自然科学基金资助项目D9818，黑龙江省教委科研项目
作者简介：曲凤玉，女，34岁，讲师，硕士，从事衰老生化机制与中药抗衰老研究
参考文献
1 龚国清，徐敝本.小鼠衰老模型研究.中国药科大学学报，1991；22(2)：103
2 詹 皓，孙存普，刘传缋 et al.衰老过程中雄性大鼠脏器自由基浓度和过氧化脂质的变化.中华老年医学杂志，1991；10(3)：166
3 陈顺忠，金有余，李常淳 et al.过氧化脂质显色的三种方法比较.临床检验杂志，1984；2(4)：8
4 田清涞，李云兰.酶与衰老.老年学杂志，1993；13(6)：372
5 高姝娟，刘锡锰，高 贵.谷胱甘肽的抗线粒体脂质过氧化作用.生物化学杂志，1997；13 (3)：287
6 孟 申，张之南.中药有效成分抗氧化作用的实验研究.中国药理学通报，1992；10(5)：326
7 藏堂.传统益寿精要.第1版，北京：世界图书出版公司，1992：262
〔1998-08-15收稿 1998-12-01修回〕, http://www.100md.com