酶联免疫吸附试验定量检测产毒性大肠杆菌定居因子
作者：陈清 王雅贤 俞守义 张兆山
单位：第一军医大学流行病学教研室，广州，510515；军事医学科学院生物工程研究所，北京，100071
关键词：产毒性大肠杆菌；定居因子；酶联免疫吸附试验
摘要 摘要：目的 为了特异、敏感和方便地检测产毒性大肠杆菌(ETEC)的CFAⅠ和CFAⅡ。方法和结果 我们用CFAⅠ或CFAⅡ阳性ETEC株免疫的兔抗血清所纯化的抗体，建立了检测CFAⅠ和CFAⅡ的ELISA试验方法，并且探索了简便的标本处理方法。结论 本法特异、敏感、简单易行，适合于临床实验室和流行病学调查应用。
中图分类号：R18
Quantitative measure of the colonization factor antigens of enterotoxigenic Escherichia coli by enzyme-linked immunosorbent assay
, http://www.100md.com
Chen Qing Wang Yaxian Yu Shouyi
Department of Epidemiology, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Zhang Zhaoshan
Institute of Biological Engineering, Academy of Military Medical Sciences, Beijing, 100071
Abstract: Objective To develop a simple, rapid and easy method for determining the expression of colonization factor antigensⅠand Ⅱ(CFAⅠand CFAⅡ) of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) Method and Result By using anti- CFAⅠserum and anti-CFAⅡ serum of immune rabbits, a enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed. Conclusion The ELISA is a specific, sensitive, simple and easy to use method, which is suitable for to clinic laboratory and epidemiological trial.
, 百拇医药
Key words: ETEC; colonization factor antigens; ELISA
定居因子(Colonization factor antigens, CFAs)是产毒性大肠杆菌(ETEC)的毒力因子之一，也是鉴定ETEC的依据之一。ETEC的CFAs有10多种，但最常见的是CFAⅠ和CFAⅡ。CFAⅠ由单一的抗原组成，CFAⅡ由CS1、CS2和CS3 3种抗原成分组成，CS3是CFAⅡ的共有抗原。检测CFAs，对于ETEC感染的临床诊断，或进行ETEC感染的流行病学调查有重要意义。为此，本室建立了特异、 敏感、可以进行定量检测CFAⅠ和CFAⅡ的ELISA法。
1 材料和方法
1.1 抗体纯化 CFAⅠ和CFAⅡ(CS3)兔抗血清由军事医学科学院张兆山教授惠赠，血凝效价在1：100以上。含CFAⅠ或CFAⅡ的ETEC菌株分别在CFA平板上20 ℃培养24 h，CFA平板含1%水解酪蛋白(Oxoid产品)、0.15%酵母粉(Oxiod产品)、0.005% MgSO4、0.005% MnCl2、2%琼脂粉。用0.1 mol PBS (pH7.4)收集菌苔，6 000 r/min离心10 min，再用PBS洗3次，加入丙酮4 ℃过夜，PBS洗3次。含CFAⅠ或CFAⅡ的菌悬液在室温分别吸附相应的血清2 h。上述吸附重复2次，即可进行IgG分离纯化：经吸附的血清用0.1 mol PB(pH 7.2)平衡后，通过DEAE-Sephadex A50层析柱，收集含蛋白的洗脱液，混合, 置透析袋中浓缩，测蛋白含量。提纯的抗体用于包被及辣根过氧化物酶(HRP)标记。
, 百拇医药
1.2 HRP标记 采用改良过碘酸钠法[1] ，HRP为上海东风试剂厂产品。
1.3 细菌培养 采用3种培养方法，(1) LB肉汤培养37 ℃12 h；(2) CFA平板37 ℃16 h；(3) LB平板37℃、16 h。
1.4 标本处理 肉汤培养的细菌以4种不同的方法处理∶方法(1) 直接检测；方法(2)培养液离心后取沉淀加蒸馏水重悬，-20 ℃冷冻1 h以上，然后100 ℃ 3 min；方法(3)按(2)反复冻融2次；方法(4)离心后加生理盐水重悬，不冻融。经处理的标本用PBS以1:10为起始稀释度作10倍系列稀释备用。琼脂平板培养的细菌按方法(3)处理。
1.5 ELISA检测CFA 以提纯的抗体适量稀释包被聚乙烯板(浙江黄岩产品)4 ℃过夜，30%小牛血清封板，加待测标本后37 ℃培养1 h，生理盐水和0.05%吐温20洗涤，加入抗CFA-HRP结合物37 ℃1 h，OPD显色，用南京生产的DG-3021型酶联检测仪测492 nm的吸光度A值，以≥阴性对照的2倍为阳性。
, 百拇医药
2 结果
2.1 包被的抗体浓度 从兔抗血清纯化的IgG浓度为4 000 mg/L。IgG作系列的稀释用于包被，稀释的IgG浓度从10～200 mg/L，标本处理以方法(3)为标准处理方法。结果表明以20 mg/L的包被浓度为最敏感。
2.2 抗CFA-HRP结合物的最佳浓度 抗CFAⅠ-HRP以1:200，抗CFAⅡ-HRP以1:400为最佳使用浓度。
2.3 不同培养及标本处理方法对检测结果的影响 取LB平板与CFA平板的菌苔或1 ml LB培养物沉淀，冻融后用PBS调整它们的Dλ280 nm一致，再作检测 。结果表明ETEC在CFA平板上生长时CFAⅠ和CFAⅡ的表达高于LB平板，检测的敏感度相差一个稀释度，用LB平板培养的敏感度又较LB肉汤高一个稀释度。
比较了4种标本处理方法。结果表明以方法(3)即反复冻融2次的效果较好。
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2.4 特异性 对一些肠道致病菌的检测结果表明本法有较好的特异性(表1)。
表1 不同种类细菌(标准株)的Dλ280 nm值
Tab.1 Dλ280 nm of different bacterial strains by ELISA
Bacteria
No of bacteria
CFAⅠ-ELISA
CFAⅡ-ELISA
E44813(CFAⅠ)
1
, http://www.100md.com
0.323
0.127
E44815(CFAⅡ)
1
0.086
0.422
ETEC(CFA)
4
0.079±0.08
0.110±0.08
Shigella Spp
2
, 百拇医药
0.074±0.03
0.108±0.05
S.Typhi
1
0.085
0.088
S.Paratyphi
1
0.069
0.102
EHEC O 157
2
, http://www.100md.com 0.087±0.02
0.112±0.07
E.coli 8099
1
0.074
0.097
V.O139
1
0.099
0.082
*The bacteria were cultured in LB medium at 37 ℃ for 12 h
, 百拇医药
3 讨论
CFAs是鉴定ETEC的主要依据之一，它所产生的抗体是保护性抗体，因此，建立一种特异、敏感、简单易行和便于定量的检测CFAs的方法有重要的诊断和流行病学意义。目前检测CFAs的免疫学方法主要有血凝法、酶斑点法和ELISA法，但在CFAⅠ和CFAⅡ的检测上，主要采用前两种方法[1,2]。血凝法可以定量，但敏感性不高，酶斑点法有较高的敏感性，但易出现假阳性反应，而且难以进行定量检测。ELISA法能够定量，还可以通过采用合适的抗体包被量及酶反应浓度提高反应信号和降低本底，特别是夹心法ELISA，可以使非特异性反应大大降低。
本研究表明，用兔抗血清提纯的CFAⅠ和CFAⅡ建立夹心ELISA法检测ETEC的CFAⅠ和CFAⅡ，特异、敏感、简单，可以较好地测量CFAⅠ和CFAⅡ的表达情况。过去有文献报道CFAs的表达与培养基的种类有关，表达以CFA琼脂平板>营养琼脂平板>营养肉汤[3,4]，本结果证实存在这种现象。 过去在采用ELISA检测CFAs时，需提取CFAs抗原，使该法的实际应用受到限制。因为CFAs属于菌毛抗原，参考陈锦英等的方法[5]，我们采用冻融法，也取得了满意的结果，而且本法简单，适合临床实验室和流行病学调查应用。 有些CFAs之间的N末端的氨基酸序列相似，故有时会发生交叉反应。我们调整包被抗体及酶的浓度，可以大大降低交叉反应，虽然同时使检测的敏感性也受到一些影响，但检测的敏感度已经可以满足实际应用的需要。
, http://www.100md.com
作者单位：陈清，女，1959年出生，1997年在第一军医大学获博士学位，研究员，电话85148389
参考文献
1 Ghosh AR, Sen D, Sack DA et al. Evaluation of conventional media for detection of colonization factor antigens of enterotoxigenic Escherichia coli. J Clin Microbiol, 1993, 31:2163
2 Viboud GI, Binsztein N, Svennerholm AM. Characterization of monoclonal antibodies against putative colonization factors of enterotoxigenic Escherichia coli and their use in an epidemiological study. J Clin Microbiol, 1993, 31:558
, 百拇医药
3 Payne D, Moore N, Lambert P. Use of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to measure the expression of the K88 fimbrial antigen by enterotoxigenic Escherichia (ETEC). J Immunol Methods, 1993,159:283
4 Levine MM, Kaper JB, Black RE et al. New knowledge on pathogenesis of bacterial enteric infections as applied to vaccine development. Microbiol Rev, 1983,47:510
5 陈锦英，杨惠彬，何建民等. 致肾盂肾炎大肠杆菌粘附特性的研究. 微生物学通报, 1995, 22(1)：32
(收稿日期：1998-08-12), 百拇医药
单位：第一军医大学流行病学教研室，广州，510515；军事医学科学院生物工程研究所，北京，100071
关键词：产毒性大肠杆菌；定居因子；酶联免疫吸附试验
摘要 摘要：目的 为了特异、敏感和方便地检测产毒性大肠杆菌(ETEC)的CFAⅠ和CFAⅡ。方法和结果 我们用CFAⅠ或CFAⅡ阳性ETEC株免疫的兔抗血清所纯化的抗体，建立了检测CFAⅠ和CFAⅡ的ELISA试验方法，并且探索了简便的标本处理方法。结论 本法特异、敏感、简单易行，适合于临床实验室和流行病学调查应用。
中图分类号：R18
Quantitative measure of the colonization factor antigens of enterotoxigenic Escherichia coli by enzyme-linked immunosorbent assay
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Chen Qing Wang Yaxian Yu Shouyi
Department of Epidemiology, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Zhang Zhaoshan
Institute of Biological Engineering, Academy of Military Medical Sciences, Beijing, 100071
Abstract: Objective To develop a simple, rapid and easy method for determining the expression of colonization factor antigensⅠand Ⅱ(CFAⅠand CFAⅡ) of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) Method and Result By using anti- CFAⅠserum and anti-CFAⅡ serum of immune rabbits, a enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed. Conclusion The ELISA is a specific, sensitive, simple and easy to use method, which is suitable for to clinic laboratory and epidemiological trial.
, 百拇医药
Key words: ETEC; colonization factor antigens; ELISA
定居因子(Colonization factor antigens, CFAs)是产毒性大肠杆菌(ETEC)的毒力因子之一，也是鉴定ETEC的依据之一。ETEC的CFAs有10多种，但最常见的是CFAⅠ和CFAⅡ。CFAⅠ由单一的抗原组成，CFAⅡ由CS1、CS2和CS3 3种抗原成分组成，CS3是CFAⅡ的共有抗原。检测CFAs，对于ETEC感染的临床诊断，或进行ETEC感染的流行病学调查有重要意义。为此，本室建立了特异、 敏感、可以进行定量检测CFAⅠ和CFAⅡ的ELISA法。
1 材料和方法
1.1 抗体纯化 CFAⅠ和CFAⅡ(CS3)兔抗血清由军事医学科学院张兆山教授惠赠，血凝效价在1：100以上。含CFAⅠ或CFAⅡ的ETEC菌株分别在CFA平板上20 ℃培养24 h，CFA平板含1%水解酪蛋白(Oxoid产品)、0.15%酵母粉(Oxiod产品)、0.005% MgSO4、0.005% MnCl2、2%琼脂粉。用0.1 mol PBS (pH7.4)收集菌苔，6 000 r/min离心10 min，再用PBS洗3次，加入丙酮4 ℃过夜，PBS洗3次。含CFAⅠ或CFAⅡ的菌悬液在室温分别吸附相应的血清2 h。上述吸附重复2次，即可进行IgG分离纯化：经吸附的血清用0.1 mol PB(pH 7.2)平衡后，通过DEAE-Sephadex A50层析柱，收集含蛋白的洗脱液，混合, 置透析袋中浓缩，测蛋白含量。提纯的抗体用于包被及辣根过氧化物酶(HRP)标记。
, 百拇医药
1.2 HRP标记 采用改良过碘酸钠法[1] ，HRP为上海东风试剂厂产品。
1.3 细菌培养 采用3种培养方法，(1) LB肉汤培养37 ℃12 h；(2) CFA平板37 ℃16 h；(3) LB平板37℃、16 h。
1.4 标本处理 肉汤培养的细菌以4种不同的方法处理∶方法(1) 直接检测；方法(2)培养液离心后取沉淀加蒸馏水重悬，-20 ℃冷冻1 h以上，然后100 ℃ 3 min；方法(3)按(2)反复冻融2次；方法(4)离心后加生理盐水重悬，不冻融。经处理的标本用PBS以1:10为起始稀释度作10倍系列稀释备用。琼脂平板培养的细菌按方法(3)处理。
1.5 ELISA检测CFA 以提纯的抗体适量稀释包被聚乙烯板(浙江黄岩产品)4 ℃过夜，30%小牛血清封板，加待测标本后37 ℃培养1 h，生理盐水和0.05%吐温20洗涤，加入抗CFA-HRP结合物37 ℃1 h，OPD显色，用南京生产的DG-3021型酶联检测仪测492 nm的吸光度A值，以≥阴性对照的2倍为阳性。
, 百拇医药
2 结果
2.1 包被的抗体浓度 从兔抗血清纯化的IgG浓度为4 000 mg/L。IgG作系列的稀释用于包被，稀释的IgG浓度从10～200 mg/L，标本处理以方法(3)为标准处理方法。结果表明以20 mg/L的包被浓度为最敏感。
2.2 抗CFA-HRP结合物的最佳浓度 抗CFAⅠ-HRP以1:200，抗CFAⅡ-HRP以1:400为最佳使用浓度。
2.3 不同培养及标本处理方法对检测结果的影响 取LB平板与CFA平板的菌苔或1 ml LB培养物沉淀，冻融后用PBS调整它们的Dλ280 nm一致，再作检测 。结果表明ETEC在CFA平板上生长时CFAⅠ和CFAⅡ的表达高于LB平板，检测的敏感度相差一个稀释度，用LB平板培养的敏感度又较LB肉汤高一个稀释度。
比较了4种标本处理方法。结果表明以方法(3)即反复冻融2次的效果较好。
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2.4 特异性 对一些肠道致病菌的检测结果表明本法有较好的特异性(表1)。
表1 不同种类细菌(标准株)的Dλ280 nm值
Tab.1 Dλ280 nm of different bacterial strains by ELISA
Bacteria
No of bacteria
CFAⅠ-ELISA
CFAⅡ-ELISA
E44813(CFAⅠ)
1
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0.323
0.127
E44815(CFAⅡ)
1
0.086
0.422
ETEC(CFA)
4
0.079±0.08
0.110±0.08
Shigella Spp
2
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0.074±0.03
0.108±0.05
S.Typhi
1
0.085
0.088
S.Paratyphi
1
0.069
0.102
EHEC O 157
2
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0.112±0.07
E.coli 8099
1
0.074
0.097
V.O139
1
0.099
0.082
*The bacteria were cultured in LB medium at 37 ℃ for 12 h
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3 讨论
CFAs是鉴定ETEC的主要依据之一，它所产生的抗体是保护性抗体，因此，建立一种特异、敏感、简单易行和便于定量的检测CFAs的方法有重要的诊断和流行病学意义。目前检测CFAs的免疫学方法主要有血凝法、酶斑点法和ELISA法，但在CFAⅠ和CFAⅡ的检测上，主要采用前两种方法[1,2]。血凝法可以定量，但敏感性不高，酶斑点法有较高的敏感性，但易出现假阳性反应，而且难以进行定量检测。ELISA法能够定量，还可以通过采用合适的抗体包被量及酶反应浓度提高反应信号和降低本底，特别是夹心法ELISA，可以使非特异性反应大大降低。
本研究表明，用兔抗血清提纯的CFAⅠ和CFAⅡ建立夹心ELISA法检测ETEC的CFAⅠ和CFAⅡ，特异、敏感、简单，可以较好地测量CFAⅠ和CFAⅡ的表达情况。过去有文献报道CFAs的表达与培养基的种类有关，表达以CFA琼脂平板>营养琼脂平板>营养肉汤[3,4]，本结果证实存在这种现象。 过去在采用ELISA检测CFAs时，需提取CFAs抗原，使该法的实际应用受到限制。因为CFAs属于菌毛抗原，参考陈锦英等的方法[5]，我们采用冻融法，也取得了满意的结果，而且本法简单，适合临床实验室和流行病学调查应用。 有些CFAs之间的N末端的氨基酸序列相似，故有时会发生交叉反应。我们调整包被抗体及酶的浓度，可以大大降低交叉反应，虽然同时使检测的敏感性也受到一些影响，但检测的敏感度已经可以满足实际应用的需要。
, http://www.100md.com
作者单位：陈清，女，1959年出生，1997年在第一军医大学获博士学位，研究员，电话85148389
参考文献
1 Ghosh AR, Sen D, Sack DA et al. Evaluation of conventional media for detection of colonization factor antigens of enterotoxigenic Escherichia coli. J Clin Microbiol, 1993, 31:2163
2 Viboud GI, Binsztein N, Svennerholm AM. Characterization of monoclonal antibodies against putative colonization factors of enterotoxigenic Escherichia coli and their use in an epidemiological study. J Clin Microbiol, 1993, 31:558
, 百拇医药
3 Payne D, Moore N, Lambert P. Use of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to measure the expression of the K88 fimbrial antigen by enterotoxigenic Escherichia (ETEC). J Immunol Methods, 1993,159:283
4 Levine MM, Kaper JB, Black RE et al. New knowledge on pathogenesis of bacterial enteric infections as applied to vaccine development. Microbiol Rev, 1983,47:510
5 陈锦英，杨惠彬，何建民等. 致肾盂肾炎大肠杆菌粘附特性的研究. 微生物学通报, 1995, 22(1)：32
(收稿日期：1998-08-12), 百拇医药