Triton X-100存在下的Lowry蛋白定量法
作者：张兴梅 石玉生
单位：第一军医大学1生物化学教研室；南方医院放疗科，广州，510515
关键词：Triton；X-100；蛋白定量；Lowry法
第一军医大学学报990127 摘要：本文建立了一种Triton X-100存在下的Lowry 蛋白定量法，可在Triton X-100存在下较简便、准确地测定蛋白质的含量。
中图分类号：Q503
Lowry 蛋白定量法是生化领域内一种广泛应用的方法，能够比较简单、精确地测定蛋白含量[ 1] 。但是，在生化实验中的蛋白质溶液往往含有一些干扰蛋白定量的物质，例如Triton X-100、四乙基碘化铵、丙酮。本文以测定含有0.1% Triton X-100的蛋白质样品的蛋白含量的过程为例，介绍Triton X-100存在下的微量Lowry 蛋白定量法的具体方法及步骤。
, 百拇医药
1 材料
1.1 仪器 微量多道滴定扫描仪，台式高速离心机。
1.2 试剂 Triton X-100，购自英国BDH公司，牛血清白蛋白(BSA)，由军事医学科学院药材供应站分装，其它试剂均为国产分析纯。
1.2.1 C-T试剂( Copper-tartrate reagent ) 10 % NaCO3 10 ml；1% 酒石酸钠钾 0.9 ml；5% CuSO4 0.1 ml， 用时新鲜配制。
1.2.2 Folin 试剂 Folin 原液按Lowry法配制，用时按1:10 ( v/v ) 以水稀释。
2 方法与结果
2.1 标准曲线的制作 取干燥的牛血清白蛋白2 mg，加入2 ml 1 mol/L NaOH和2 ml 蒸馏水，再加入4 m l Triton X-100配制成含有0.1% Triton X-100的0.5 g/l 的蛋白质标准溶液。取不同量，用0.5 mol/L NaOH 补至200 m l。空白对照以200 m l 0.5 mol/L NaOH代替。加C-T试剂200 m l，室温静置10 min，加入Folin 试剂 600 m l 立即混匀。50 ℃孵温10 min后，在微量多道滴定扫描仪上测690 nm 处的消光值。以牛血清白蛋白的含量( mg )为横坐标(X)，A690 nm为纵坐标(Y)，制作蛋白质标准曲线，直线回归方程式：X = 0.241Y-0.001， r = 0.998。蛋白含量在40 m g以内与消光值呈正相关。
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2.2 蛋白含量的测定 稀释待测蛋白样品若干倍使Triton X-100的含量为0.1%。取0.5 ml，加蒸馏水至1 ml，加20% TCA ( 三氯乙酸 ) 333 m l沉淀蛋白质( TCA的终浓度为5% )。静置10 min，台式高速离心机7 000×g离心5 min，弃去上清液，沉淀中加入1 mol/L NaOH 250 m l。50 ℃孵温1 h，使呈透明溶液，而后加入250 m l蒸馏水稀释。取200 m l，余同上述标准曲线制备，测定690 nm处的消光值。利用标准曲线方程式求蛋白质样品的蛋白含量(mg)，据公式：蛋白质浓度(g/L)= 蛋白含量×稀释倍数/0.2得出蛋白样品浓度。
3 讨论
文献中有用在显色反应之前加入SDS的Lowry定量法[ 2] 。但是，本实验测定含有Triton X-100的蛋白质样品时，先经TCA沉淀可去除样品中的其它可溶性干扰物质，而Triton X-100则与蛋白质被沉淀下来。Triton X-100可在1%浓度以下并不使显色降低，故做相同Triton X-100浓度的蛋白标准曲线可以准确定量蛋白质[ 3] 。作者建立的Triton X-100存在下的微量Lowry 蛋白定量法，也可用于其它干扰物质存在下的蛋白定量。
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致谢
本文承孙曼霁教授审阅，特此致谢!
作者简介：张兴梅，女，1971年出生，1997年毕业于军事医学科学院，硕士，助教，电话85148356
参考文献
1 Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem,1951,193(3): 265
2 Wang CS, Smith RL. Lowry determination of protein in the presence of Triton X-100. Anal Biochem,1975,63(1):414
3 朱美财.Triton X-100及四乙基碘化铵存在下的Lowry 蛋白定量法.军事医学科学院院刊，1991,15(2):143
(收稿日期：1998-07-21), http://www.100md.com
单位：第一军医大学1生物化学教研室；南方医院放疗科，广州，510515
关键词：Triton；X-100；蛋白定量；Lowry法
第一军医大学学报990127 摘要：本文建立了一种Triton X-100存在下的Lowry 蛋白定量法，可在Triton X-100存在下较简便、准确地测定蛋白质的含量。
中图分类号：Q503
Lowry 蛋白定量法是生化领域内一种广泛应用的方法，能够比较简单、精确地测定蛋白含量[ 1] 。但是，在生化实验中的蛋白质溶液往往含有一些干扰蛋白定量的物质，例如Triton X-100、四乙基碘化铵、丙酮。本文以测定含有0.1% Triton X-100的蛋白质样品的蛋白含量的过程为例，介绍Triton X-100存在下的微量Lowry 蛋白定量法的具体方法及步骤。
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1 材料
1.1 仪器 微量多道滴定扫描仪，台式高速离心机。
1.2 试剂 Triton X-100，购自英国BDH公司，牛血清白蛋白(BSA)，由军事医学科学院药材供应站分装，其它试剂均为国产分析纯。
1.2.1 C-T试剂( Copper-tartrate reagent ) 10 % NaCO3 10 ml；1% 酒石酸钠钾 0.9 ml；5% CuSO4 0.1 ml， 用时新鲜配制。
1.2.2 Folin 试剂 Folin 原液按Lowry法配制，用时按1:10 ( v/v ) 以水稀释。
2 方法与结果
2.1 标准曲线的制作 取干燥的牛血清白蛋白2 mg，加入2 ml 1 mol/L NaOH和2 ml 蒸馏水，再加入4 m l Triton X-100配制成含有0.1% Triton X-100的0.5 g/l 的蛋白质标准溶液。取不同量，用0.5 mol/L NaOH 补至200 m l。空白对照以200 m l 0.5 mol/L NaOH代替。加C-T试剂200 m l，室温静置10 min，加入Folin 试剂 600 m l 立即混匀。50 ℃孵温10 min后，在微量多道滴定扫描仪上测690 nm 处的消光值。以牛血清白蛋白的含量( mg )为横坐标(X)，A690 nm为纵坐标(Y)，制作蛋白质标准曲线，直线回归方程式：X = 0.241Y-0.001， r = 0.998。蛋白含量在40 m g以内与消光值呈正相关。
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2.2 蛋白含量的测定 稀释待测蛋白样品若干倍使Triton X-100的含量为0.1%。取0.5 ml，加蒸馏水至1 ml，加20% TCA ( 三氯乙酸 ) 333 m l沉淀蛋白质( TCA的终浓度为5% )。静置10 min，台式高速离心机7 000×g离心5 min，弃去上清液，沉淀中加入1 mol/L NaOH 250 m l。50 ℃孵温1 h，使呈透明溶液，而后加入250 m l蒸馏水稀释。取200 m l，余同上述标准曲线制备，测定690 nm处的消光值。利用标准曲线方程式求蛋白质样品的蛋白含量(mg)，据公式：蛋白质浓度(g/L)= 蛋白含量×稀释倍数/0.2得出蛋白样品浓度。
3 讨论
文献中有用在显色反应之前加入SDS的Lowry定量法[ 2] 。但是，本实验测定含有Triton X-100的蛋白质样品时，先经TCA沉淀可去除样品中的其它可溶性干扰物质，而Triton X-100则与蛋白质被沉淀下来。Triton X-100可在1%浓度以下并不使显色降低，故做相同Triton X-100浓度的蛋白标准曲线可以准确定量蛋白质[ 3] 。作者建立的Triton X-100存在下的微量Lowry 蛋白定量法，也可用于其它干扰物质存在下的蛋白定量。
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致谢
本文承孙曼霁教授审阅，特此致谢!
作者简介：张兴梅，女，1971年出生，1997年毕业于军事医学科学院，硕士，助教，电话85148356
参考文献
1 Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem,1951,193(3): 265
2 Wang CS, Smith RL. Lowry determination of protein in the presence of Triton X-100. Anal Biochem,1975,63(1):414
3 朱美财.Triton X-100及四乙基碘化铵存在下的Lowry 蛋白定量法.军事医学科学院院刊，1991,15(2):143
(收稿日期：1998-07-21), http://www.100md.com