急性白血病抗凋亡基因BCL-2的表达及其意义
作者：刘陶文 黎金庆 周润华 莫东华 刘 健 马 越 唐超生
单位：刘陶文 桂林医学院生物工程研究所 广西桂林市 541004；黎金庆 周润华 莫东华 刘健 马越 唐超生 血液病研究室
关键词：急性白血病；BCL-2基因；凋亡
华夏医学990104 摘要 目的：探讨BCL-2基因转录在急性白血病中的作用。方法：应用逆转录/聚合酶链反应(RT-PCR)检测20例急性白血病患者细胞中BCL-2mRNA的表达。结果：9例完全缓解(CR)患者中2例(22.2%)呈BCL-mRNA阳性，而11例不缓解(NR，包括难治及复发)患者均呈BCL-2mRNA阳性(100%)，两组BCL-2mRNA阳性比例的差异非常显著(P<0.01)。结论：急性白血病BCL-2的表达升高可直接影响化疗效果，且是判断患者预后的有用指标。
中图分类号 R730.3;R733
, http://www.100md.com
The Expression of BCL-2 mRNA and Its Significance in Acute Leukemia
Liu Taowen,Li Jinqing,Zhou Runhua,et al.
Institute of Bioengineering,Research Unit of Hematology,Guilin Medical College (541004)
Abstract Objective:To evaluate the clinical significance of expression of BCL-2 mRNA in acute leukemia.Methods:The BCL-2 mRNA expression in 20 cases of acute leukemia [complete remission (CR,n=9);nor remission (NR) including refractory or relapse (n=11)] was investigated by using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).Results:The expression of BCL-2 mRNA was positive in two out of nine CR patients (22.2%) and total of 11 NR subjects (100%),and significantly statistical difference was revealed between two groups (P<0.01).Conclusion:The expression of BCL-2 is involved chemotherapeutic resistance of acute leukemia and led to be a factor of unfavorable outcome.
, 百拇医药
Key words acute leukemia;BCL-2;apoptosis
细胞凋亡(Apoptosis)是调节体内细胞数量的生理机制，凋亡障碍是肿瘤发生的重要分子基础之一。BCL-2基因可特异阻遏细胞凋亡，其过度表达使细胞生存期延长,与肿瘤耐受化疗及复发有关[1～3]。笔者报道用RT-PCR测定20例急性白血病患者细胞对BCL-2的表达情况及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 观察对象 20例急性白血病患者，男12例，女8例，中位年龄29岁(13～43岁)。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)11例，急性非淋巴细胞白血病(ANLL)9例。所有病例均接受化疗，ALL用VP(长春新碱+强的松)、VDCP(长春新碱+柔红霉素+环磷酰胺+强的松),ANLL用DA(柔红霉素+阿糖胞苷)、HA(高三尖杉酯碱+阿糖胞苷)方案,[M3用全反式维甲酸(ATRA)]。诊断标准依据法美英白血病协作组(FAB)(1985)。处于完全缓解(CR)9例，不缓解(包括难治复发)11例，以Hiddeman W等的标准判断[4]。
, 百拇医药
1.2 标本采集及RNA提取 以肝素抗凝骨髓(30u/ml)，用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞，即刻提取总RNA[5]，加保护剂(湖南长沙来福生物工程公司提供)后置-20℃保存。
1.3 RT-PCR同时扩增BCL-2和β2微球蛋白基因(β2-MG，作内参照) 引物及其它RT、PCR有关试剂由北京师范大学生物系周卫东教授提供。引物序列为:逆转录均用随机引物。
BCL-2(170bp): 5′ACTTGTGGTCCAGATAGG3′
5′CGACTTCGCCGAGATGTC3′
β2-MG(300bp):5′AGTATGCCTGCCGTGTGAAC3′
5′AAGTTGCCAGCCCTCCTAGA3′
, 百拇医药
cDNA的合成：取RNA1μg在含AMV逆转录酶2u、100ng逆转录引物，总体积40μl的逆转录反应体系中45℃水浴反应30min。PCR：在25μl反应体系中，含cDNA 5μl、PCR液(含dNTP)20μl、Tag酶1u，混匀，置基因扩增仪(PTC100，美国PE公司产)上扩增。扩增条件：94℃变性45s、55℃退火45s、72℃延伸45s、循环35周，最后1周于72℃延伸10min。每次扩增都作一个空白对照(无RNA)。
1.4 DNA电泳观察 取10μl PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用Phi×174DNA/HaeⅢ作DNA分子量标准带，溴乙锭染色,紫外透射仪上观察。BCL-2电泳带为170bp、β2-MG为300bp，只显示β2-MG(无BCL-2带)则BCL-2为阴性，只显于BCL-2(无β2-MG带)则BCL-2为假阳性，同时显示170bp和300bp方能判断为BCL-2阳性。
, 百拇医药
1.5 结果统计学处理 采用χ2检验。
2 结果
对20例急性白血病患者细胞表达BCL-2 mRNA的检测结果见表1。
表1 CR与NR急性白血病BCL-2表达的比较(n) 组别
n
BCL-2 mRNA阳性数(阳性率)
P
CR
9
2(22.2%)
<0.01
, 百拇医药
NR
11
11(100%)
3 讨论
BCL-2是新一类癌基因——凋亡调控基因BCL-2家族的代表，其编码26kd的蛋白存在于线粒体、核膜及内质网,与同家族的其它成员组成不同比例的同、异二聚体而影响凋亡启动[6]。BCL-2蛋白抗凋亡的分子基础与其使细胞内钙重新分布及抗氧化剂有关[7，8]。骨髓未成熟细胞高表达BCL-2，使存在于增殖池的细胞增多及时间延长。已发现BCL-2可阻抑增殖期细胞的凋亡和延长非增殖期细胞的存活时间[9]。由此导致细胞的凋亡障碍，则增加遗传物质的突变机率，进而影响细胞的恶性转化过程。本实验观察到11例未缓解、难治复发急性白血病均呈BCL-2mRNA表达阳性，而9例完全缓解患者中仅2例为BCL-2mRNA表达阳性(P<0.01)，结果支持BCL-2介导使细胞逃脱生理性凋亡、抵抗机体自然防御与临床治疗的机制，并与Campos等的报道类似[3]。此外，高表达BCL-2的恶性肿瘤细胞具有较强的髓外生存、适应能力及高度的自我更新潜能。对这些患者宜调整化疗方案，选用诱导凋亡的制剂。因此，促细胞凋亡已成为治疗恶性肿瘤的新途径。我国学者用砷剂成功治疗急性早幼粒细胞白血病并发现其作用机制是下调BCL-2蛋白表达而诱导细胞凋亡[10]。新近研究发现转BCL-2基因且造血系统对其高表达的小鼠可抵抗致死量的放射线[11]。对多种血液系恶性肿瘤中BCL-2表达的研究表明其具有独立的预后价值[12，13]。故认为BCL-2高表达不但影响白血病细胞对化疗的敏感性，还可作为判断患者预后的一个有效指标。
, 百拇医药
*广西卫生厅科研基金(9509)和桂林医学院科研基金资助(9701)课题
作者简介：刘陶文(1964～)，男，1989年安徽皖南医学院硕士生毕业，1991.9～1993.8上海第二医科大学瑞金医院上海血液学研究所血液内科博士生。发表论文20余篇。
参考文献
[1] Yang E,Korsmeyer SJ.Molecular thanatopsis:a discourse on the BCL-2 family and cell death.Blood,1996,88:386
[2] Hannun YA.Apoptosis and the dilemma of cancer chemotherapy.Blood,1997,89:1845
[3] Campos L,Rouanlt JP,Salido O,et al.High expression of BCL-2 protein in acute myeloid leukemia cells is associated with poor response to chemotherapy.Blood,1993,81:3091
, 百拇医药
[4] Hiddeman W,Bucher T.Treatment strategies in acute myeloid leukemia.Blut,1990,6:183
[5] Chomczynski P,Sacchi N.Single step method of RNA isolation by acid guanidnium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156
[6] Yang E,Zha J,Jockel J,et al.Bad,a heterodimeric partner for BCL-XL and BCL-2,displaces Bax and promotes cell death.Cell,1995,80:285
[7] Kane DJ,Sarafian TA,Anton R,et al.BCL-2 inhibition of neural death:Decreased generation of reactive oxygen species.Science,1993,262:1274
, http://www.100md.com
[8] Baffy G,Miyashita T,Williamson JR,et al.Apoptosis induced by withdrawal of interleukin-3 (IL-3) from an IL-3-dependent hematopoietic cell line is associated with repartitioning of intracellular calcium and is blocked by enforced BCL-2 oncoprotein production.J Biol Chem,1993,268:6511
[9] Hale AJ,Smith CA,Sutheland LC,et al.Apoptosis:molecular regulation of cell death.Eur J Biochem,1996,236:1
[10] Chen GQ,Zhu J,Shi XG,et al.In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia:As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of BCL-2 expression and modulation of PML-RAR α/PML proteins.Blood,1996,88:1052
, 百拇医药
[11] Domen J,Candy KL,Weissman IL,et al.Systemic overexpression of BCL-2 in the hematopoitetic system protects transgenic mice from the consequences of lethal irradiation.Blood,1998,91:2272
[12] Findly HW,Gu L,Yeager AM,et al.Expression and regulation of BCL-2,BCL-XL,and bax correlate with P53 status and sensitivity to apoptosis in childhood acute lymphoblastic leukemia.Blood,1997,89:2986
[13] Pepper C,Bentley P,Hoy T.Rugulation of clinical chemoresistance by BCL-2 and bax oncoproteins in B-cell chronic lymphocytic leukemia.Brit J Haematol,1996,95:513
(收稿 1998-12-14), 百拇医药
单位：刘陶文 桂林医学院生物工程研究所 广西桂林市 541004；黎金庆 周润华 莫东华 刘健 马越 唐超生 血液病研究室
关键词：急性白血病；BCL-2基因；凋亡
华夏医学990104 摘要 目的：探讨BCL-2基因转录在急性白血病中的作用。方法：应用逆转录/聚合酶链反应(RT-PCR)检测20例急性白血病患者细胞中BCL-2mRNA的表达。结果：9例完全缓解(CR)患者中2例(22.2%)呈BCL-mRNA阳性，而11例不缓解(NR，包括难治及复发)患者均呈BCL-2mRNA阳性(100%)，两组BCL-2mRNA阳性比例的差异非常显著(P<0.01)。结论：急性白血病BCL-2的表达升高可直接影响化疗效果，且是判断患者预后的有用指标。
中图分类号 R730.3;R733
, http://www.100md.com
The Expression of BCL-2 mRNA and Its Significance in Acute Leukemia
Liu Taowen,Li Jinqing,Zhou Runhua,et al.
Institute of Bioengineering,Research Unit of Hematology,Guilin Medical College (541004)
Abstract Objective:To evaluate the clinical significance of expression of BCL-2 mRNA in acute leukemia.Methods:The BCL-2 mRNA expression in 20 cases of acute leukemia [complete remission (CR,n=9);nor remission (NR) including refractory or relapse (n=11)] was investigated by using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).Results:The expression of BCL-2 mRNA was positive in two out of nine CR patients (22.2%) and total of 11 NR subjects (100%),and significantly statistical difference was revealed between two groups (P<0.01).Conclusion:The expression of BCL-2 is involved chemotherapeutic resistance of acute leukemia and led to be a factor of unfavorable outcome.
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Key words acute leukemia;BCL-2;apoptosis
细胞凋亡(Apoptosis)是调节体内细胞数量的生理机制，凋亡障碍是肿瘤发生的重要分子基础之一。BCL-2基因可特异阻遏细胞凋亡，其过度表达使细胞生存期延长,与肿瘤耐受化疗及复发有关[1～3]。笔者报道用RT-PCR测定20例急性白血病患者细胞对BCL-2的表达情况及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 观察对象 20例急性白血病患者，男12例，女8例，中位年龄29岁(13～43岁)。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)11例，急性非淋巴细胞白血病(ANLL)9例。所有病例均接受化疗，ALL用VP(长春新碱+强的松)、VDCP(长春新碱+柔红霉素+环磷酰胺+强的松),ANLL用DA(柔红霉素+阿糖胞苷)、HA(高三尖杉酯碱+阿糖胞苷)方案,[M3用全反式维甲酸(ATRA)]。诊断标准依据法美英白血病协作组(FAB)(1985)。处于完全缓解(CR)9例，不缓解(包括难治复发)11例，以Hiddeman W等的标准判断[4]。
, 百拇医药
1.2 标本采集及RNA提取 以肝素抗凝骨髓(30u/ml)，用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞，即刻提取总RNA[5]，加保护剂(湖南长沙来福生物工程公司提供)后置-20℃保存。
1.3 RT-PCR同时扩增BCL-2和β2微球蛋白基因(β2-MG，作内参照) 引物及其它RT、PCR有关试剂由北京师范大学生物系周卫东教授提供。引物序列为:逆转录均用随机引物。
BCL-2(170bp): 5′ACTTGTGGTCCAGATAGG3′
5′CGACTTCGCCGAGATGTC3′
β2-MG(300bp):5′AGTATGCCTGCCGTGTGAAC3′
5′AAGTTGCCAGCCCTCCTAGA3′
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cDNA的合成：取RNA1μg在含AMV逆转录酶2u、100ng逆转录引物，总体积40μl的逆转录反应体系中45℃水浴反应30min。PCR：在25μl反应体系中，含cDNA 5μl、PCR液(含dNTP)20μl、Tag酶1u，混匀，置基因扩增仪(PTC100，美国PE公司产)上扩增。扩增条件：94℃变性45s、55℃退火45s、72℃延伸45s、循环35周，最后1周于72℃延伸10min。每次扩增都作一个空白对照(无RNA)。
1.4 DNA电泳观察 取10μl PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用Phi×174DNA/HaeⅢ作DNA分子量标准带，溴乙锭染色,紫外透射仪上观察。BCL-2电泳带为170bp、β2-MG为300bp，只显示β2-MG(无BCL-2带)则BCL-2为阴性，只显于BCL-2(无β2-MG带)则BCL-2为假阳性，同时显示170bp和300bp方能判断为BCL-2阳性。
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1.5 结果统计学处理 采用χ2检验。
2 结果
对20例急性白血病患者细胞表达BCL-2 mRNA的检测结果见表1。
表1 CR与NR急性白血病BCL-2表达的比较(n) 组别
n
BCL-2 mRNA阳性数(阳性率)
P
CR
9
2(22.2%)
<0.01
, 百拇医药
NR
11
11(100%)
3 讨论
BCL-2是新一类癌基因——凋亡调控基因BCL-2家族的代表，其编码26kd的蛋白存在于线粒体、核膜及内质网,与同家族的其它成员组成不同比例的同、异二聚体而影响凋亡启动[6]。BCL-2蛋白抗凋亡的分子基础与其使细胞内钙重新分布及抗氧化剂有关[7，8]。骨髓未成熟细胞高表达BCL-2，使存在于增殖池的细胞增多及时间延长。已发现BCL-2可阻抑增殖期细胞的凋亡和延长非增殖期细胞的存活时间[9]。由此导致细胞的凋亡障碍，则增加遗传物质的突变机率，进而影响细胞的恶性转化过程。本实验观察到11例未缓解、难治复发急性白血病均呈BCL-2mRNA表达阳性，而9例完全缓解患者中仅2例为BCL-2mRNA表达阳性(P<0.01)，结果支持BCL-2介导使细胞逃脱生理性凋亡、抵抗机体自然防御与临床治疗的机制，并与Campos等的报道类似[3]。此外，高表达BCL-2的恶性肿瘤细胞具有较强的髓外生存、适应能力及高度的自我更新潜能。对这些患者宜调整化疗方案，选用诱导凋亡的制剂。因此，促细胞凋亡已成为治疗恶性肿瘤的新途径。我国学者用砷剂成功治疗急性早幼粒细胞白血病并发现其作用机制是下调BCL-2蛋白表达而诱导细胞凋亡[10]。新近研究发现转BCL-2基因且造血系统对其高表达的小鼠可抵抗致死量的放射线[11]。对多种血液系恶性肿瘤中BCL-2表达的研究表明其具有独立的预后价值[12，13]。故认为BCL-2高表达不但影响白血病细胞对化疗的敏感性，还可作为判断患者预后的一个有效指标。
, 百拇医药
*广西卫生厅科研基金(9509)和桂林医学院科研基金资助(9701)课题
作者简介：刘陶文(1964～)，男，1989年安徽皖南医学院硕士生毕业，1991.9～1993.8上海第二医科大学瑞金医院上海血液学研究所血液内科博士生。发表论文20余篇。
参考文献
[1] Yang E,Korsmeyer SJ.Molecular thanatopsis:a discourse on the BCL-2 family and cell death.Blood,1996,88:386
[2] Hannun YA.Apoptosis and the dilemma of cancer chemotherapy.Blood,1997,89:1845
[3] Campos L,Rouanlt JP,Salido O,et al.High expression of BCL-2 protein in acute myeloid leukemia cells is associated with poor response to chemotherapy.Blood,1993,81:3091
, 百拇医药
[4] Hiddeman W,Bucher T.Treatment strategies in acute myeloid leukemia.Blut,1990,6:183
[5] Chomczynski P,Sacchi N.Single step method of RNA isolation by acid guanidnium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156
[6] Yang E,Zha J,Jockel J,et al.Bad,a heterodimeric partner for BCL-XL and BCL-2,displaces Bax and promotes cell death.Cell,1995,80:285
[7] Kane DJ,Sarafian TA,Anton R,et al.BCL-2 inhibition of neural death:Decreased generation of reactive oxygen species.Science,1993,262:1274
, http://www.100md.com
[8] Baffy G,Miyashita T,Williamson JR,et al.Apoptosis induced by withdrawal of interleukin-3 (IL-3) from an IL-3-dependent hematopoietic cell line is associated with repartitioning of intracellular calcium and is blocked by enforced BCL-2 oncoprotein production.J Biol Chem,1993,268:6511
[9] Hale AJ,Smith CA,Sutheland LC,et al.Apoptosis:molecular regulation of cell death.Eur J Biochem,1996,236:1
[10] Chen GQ,Zhu J,Shi XG,et al.In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia:As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of BCL-2 expression and modulation of PML-RAR α/PML proteins.Blood,1996,88:1052
, 百拇医药
[11] Domen J,Candy KL,Weissman IL,et al.Systemic overexpression of BCL-2 in the hematopoitetic system protects transgenic mice from the consequences of lethal irradiation.Blood,1998,91:2272
[12] Findly HW,Gu L,Yeager AM,et al.Expression and regulation of BCL-2,BCL-XL,and bax correlate with P53 status and sensitivity to apoptosis in childhood acute lymphoblastic leukemia.Blood,1997,89:2986
[13] Pepper C,Bentley P,Hoy T.Rugulation of clinical chemoresistance by BCL-2 and bax oncoproteins in B-cell chronic lymphocytic leukemia.Brit J Haematol,1996,95:513
(收稿 1998-12-14), 百拇医药