三联袋两次离心法分离脐血有核细胞研究△
作者：辜少玲 廖灿 刘斌 魏佳雪
单位：广州市妇婴医院 广州市优生围产研究所
关键词：脐血库；两次离心法；回收率
临床血液学杂志990106 摘要 目的：为建立脐血库，减少脐血的储存空间，需 要进行脐血分离。各种早期的脐血分离方法导致祖细胞的严重丧失，本文探讨了成本较低、 方法简便的两次离心法分离脐血祖细胞的回收情况。方法：采用三联袋对35例脐血(平均体 积81 ml)进行两次离心分离，将其分离成WBC层、RBC层和血浆层，脐血终体积平均40 ml。 结果：有核细胞计数、总祖细胞数、CD+34细胞回收率分别为82.3%，76%～ 96.3%，94.1%。WBC层做需氧及厌氧菌测定。应用这个封闭系统可减少条件并保持 无菌。在终体积为40 ml的脐血内保存干细胞的回收量。RBC和血浆部分，可用于测定ABO血 型、病毒检测。结论：脐血可用经济简单的方法大大减少体积，是一种可以用以建立脐血库 的尝试。
, 百拇医药
脐带血富含造血干细胞，来源丰富，可代替骨髓进行造血干 细胞移植。目前已通过临床证明，利用造血干细胞移植是治疗恶性血液病，如白血病、淋巴 瘤和再生障碍性贫血等的有效方法。为了能够及时提供适合移植的脐血，必须建立脐血库。 由于脐血需实体冻存，占用空间大，费用高，必须找出一种可减少脐血冻存体积、降低成本 的方法。
1 材料和方法
1.1 标本来源 35例脐血标本来自本院产科，产妇为健康 /足月分娩，标本采用文献〔1〕方法采集，采集量55～128 ml，平均为81.37± 18.48 ml。
1.2 脐血分离方法〔2〕 脐血收集在400 ml三联 袋(上海血液中心)中，在10℃ 1 800 r/min倒置离心15 min，弃去下层红细胞层于一转移袋 中，然后正向离心3 000 r/min 15 min，弃去部分血浆于另一转移袋中，使白细胞层的体积 浓缩为40 ml左右。
, 百拇医药
1.3 检测指标 ①血液分析：用美国Coulter JT-Ⅱ血细 胞计数仪检测分离前后的白细胞数和白细胞分类计数。②祖细胞培养：采用文献〔3〕 方法培养分离前后的CFU-GM，BFU-E和CFU-GEMM。培养体系甲基纤维素半固体培养基， 包含粒系刺激因子(G-CSF，100 ng/ml麒麟公司)，红细胞生成素(EPO，IU/ml)、白细胞介 素3(IL-3，10 ng/ml)以及干细胞因子(SCF，50 ng/ml)均购自Sigma公司。③CD+34 细胞检测〔4〕：抗体为PE标记的抗人CD+34抗体(美国，Pharmigen公司) ，采用FACS流式细胞仪分析(美国，Becton Dickinshon公司)，开淋巴细胞窗检测分离前后 的CD+34细胞百分率(在广州医学院第一附属医院检测)。④细菌培养：做分离前后 需氧菌和厌氧菌检测。
2 结果
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2.1 WBC回收率 分离前WBC总数(11.091±4.76) ×108，分离后WBC总数(9.13±4.64)×108，回收率82.3%见附表。
2.2 总祖细胞回收率 分离前CFU-GM(1.455±0.1 7)×105，BFU-E (0.561±0.198)×105，CFU-GEMM (0.096±0.05 )×105，分离后CFU-GM(1.401±0.19)×105，BFU-E(0.448±0.16 )×105，CFU-GEMM(0.073±0.03)×105，回收率分别为96.3%，80%，7 6%，详见附表。
2.3 CD+34回收率 分离前CD+34细胞总 数(3.4±1.32)×106，分离后CD+34细胞总数为(3.09±1.07) ×106，回收率94.1%(见附表)
, 百拇医药
附表 分离前后WBC、CD+34祖细胞数的 回收
±s n=35 回收项目
分离前
分离后
回收率
(%)
WBC、CD+34细胞总数
WBC总数
(×108)
11 .09±4.76
, 百拇医药
9.13±4.64
82.3
CD+34细胞总数
(×106)
3.40±1.32
3.0 9±1.07
94.1
祖细胞数(×105)
CFU-GM
1.46±0.17
1.40±0.19
, http://www.100md.com
96.3
BFU-E
0.56±0.19
0.45±0.16
80.0
CFU-GEMM
0.09±0.05
0.07±0.03
76.0
2.4 细菌培养 35例脐血标本分离后做需氧菌和厌氧菌培 养，均无1例污染。
3 讨论
应用三联袋两次离心法分离脐血有核细胞，WBC、祖细胞、CD+34细胞 回收率比Ficoll分离的效果好。Broxmeyer等〔5〕采用Ficoll分离101份脐血，分离 后WBC、祖细胞的分离率分别为15.09%，6%～40%。Payne〔6〕研究了Fioll分离 脐血后CD+34细胞的回收率为51.4%，而两次离心法分离的WBC、祖细胞和CD+ 34细胞的回收率分别为82.3%、76%～96.3%和94.1%。Ficoll分离血量多 的样本时，使用的离心管数多，工作量大，并且很容易造成污染，而使用三联袋这种封闭系 统进行分离，不易造成污染。我们做了35份分离后脐血的需氧菌和厌氧菌的培养，均无1例 有污染。分离过程中，移入转移袋中的RBC和血浆，可用于测定ABO血型、病毒检测，这些均 是建立脐血库所需的检查，从而减少再从新生儿抽血的麻烦。两次离心法分离的WBC、祖细 胞的回收率虽然不如和6%羟乙基淀粉(HES)高，Rusbinstein〔7〕利用6% HES分离脐 血最后体积浓缩至20 ml，WBC回收率91%，前体细胞回收率(CFU-GM、BFU-E、CFU-GEMM) 为98%，但两次离心法分离不使用任何试剂，成本低，操作简单。这对费用昂贵的脐血库来 说，可省一笔开支。因此，采用三联袋两次离心法分离脐血有核细胞是一种既经济又简单的 方法，可大大减少冻存体积，是一种可用以建立脐血库的尝试。
, http://www.100md.com
△ 本课题为广东省科委、广州市科委重点课题，广东省卫生厅“五个一”工程
邮政编码：广州市，510180
参考文献
[1] Campos L,Roubin N,Guyotae D,et al.Definition of op timal cnditions for collection and cryopreservation of umbilical cord blood hema topoietic cells.Cryobiology,1995,32:511
[2] Aedmokun JA,Chapman C,Dunn J,et al.Umbilical cord blood collection and separation for haenatopoietic progenitor cell banking.BMT,1997,19:1023
, http://www.100md.com
[3] 裴雪涛，王立生，徐黎，等.造血生长因子对脐血CD+34细胞的体外扩增 作用。中华血液学杂志，1996，17：304
[4] Sousa T,Sousa ME,Godinho E,et al.Umbilical cord blood processing:volum e reduction and recovery of CD+34 cells.BMT,1997,17:311
[5] Broxmeyer ME,et al.Cord blood transplantation:an update.EXP Hematol,19 94,22:675
[6] Payne TA,et al.Phenotypic analysis of early hematopoietic progenitors in cord blood and determination of their correlation with clonogenic progenitors :BMT,1995,15:187
[7] Rubinstein P,et al.Processing and cropreservation of placental/umbilic al cord blood for unrelated bone marrow reconstitution.Proc Natl Acd Sci,USA
(1998-06-16 收稿), http://www.100md.com
单位：广州市妇婴医院 广州市优生围产研究所
关键词：脐血库；两次离心法；回收率
临床血液学杂志990106 摘要 目的：为建立脐血库，减少脐血的储存空间，需 要进行脐血分离。各种早期的脐血分离方法导致祖细胞的严重丧失，本文探讨了成本较低、 方法简便的两次离心法分离脐血祖细胞的回收情况。方法：采用三联袋对35例脐血(平均体 积81 ml)进行两次离心分离，将其分离成WBC层、RBC层和血浆层，脐血终体积平均40 ml。 结果：有核细胞计数、总祖细胞数、CD+34细胞回收率分别为82.3%，76%～ 96.3%，94.1%。WBC层做需氧及厌氧菌测定。应用这个封闭系统可减少条件并保持 无菌。在终体积为40 ml的脐血内保存干细胞的回收量。RBC和血浆部分，可用于测定ABO血 型、病毒检测。结论：脐血可用经济简单的方法大大减少体积，是一种可以用以建立脐血库 的尝试。
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脐带血富含造血干细胞，来源丰富，可代替骨髓进行造血干 细胞移植。目前已通过临床证明，利用造血干细胞移植是治疗恶性血液病，如白血病、淋巴 瘤和再生障碍性贫血等的有效方法。为了能够及时提供适合移植的脐血，必须建立脐血库。 由于脐血需实体冻存，占用空间大，费用高，必须找出一种可减少脐血冻存体积、降低成本 的方法。
1 材料和方法
1.1 标本来源 35例脐血标本来自本院产科，产妇为健康 /足月分娩，标本采用文献〔1〕方法采集，采集量55～128 ml，平均为81.37± 18.48 ml。
1.2 脐血分离方法〔2〕 脐血收集在400 ml三联 袋(上海血液中心)中，在10℃ 1 800 r/min倒置离心15 min，弃去下层红细胞层于一转移袋 中，然后正向离心3 000 r/min 15 min，弃去部分血浆于另一转移袋中，使白细胞层的体积 浓缩为40 ml左右。
, 百拇医药
1.3 检测指标 ①血液分析：用美国Coulter JT-Ⅱ血细 胞计数仪检测分离前后的白细胞数和白细胞分类计数。②祖细胞培养：采用文献〔3〕 方法培养分离前后的CFU-GM，BFU-E和CFU-GEMM。培养体系甲基纤维素半固体培养基， 包含粒系刺激因子(G-CSF，100 ng/ml麒麟公司)，红细胞生成素(EPO，IU/ml)、白细胞介 素3(IL-3，10 ng/ml)以及干细胞因子(SCF，50 ng/ml)均购自Sigma公司。③CD+34 细胞检测〔4〕：抗体为PE标记的抗人CD+34抗体(美国，Pharmigen公司) ，采用FACS流式细胞仪分析(美国，Becton Dickinshon公司)，开淋巴细胞窗检测分离前后 的CD+34细胞百分率(在广州医学院第一附属医院检测)。④细菌培养：做分离前后 需氧菌和厌氧菌检测。
2 结果
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2.1 WBC回收率 分离前WBC总数(11.091±4.76) ×108，分离后WBC总数(9.13±4.64)×108，回收率82.3%见附表。
2.2 总祖细胞回收率 分离前CFU-GM(1.455±0.1 7)×105，BFU-E (0.561±0.198)×105，CFU-GEMM (0.096±0.05 )×105，分离后CFU-GM(1.401±0.19)×105，BFU-E(0.448±0.16 )×105，CFU-GEMM(0.073±0.03)×105，回收率分别为96.3%，80%，7 6%，详见附表。
2.3 CD+34回收率 分离前CD+34细胞总 数(3.4±1.32)×106，分离后CD+34细胞总数为(3.09±1.07) ×106，回收率94.1%(见附表)
, 百拇医药
附表 分离前后WBC、CD+34祖细胞数的 回收
±s n=35 回收项目分离前
分离后
回收率
(%)
WBC、CD+34细胞总数
WBC总数
(×108)
11 .09±4.76
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9.13±4.64
82.3
CD+34细胞总数
(×106)
3.40±1.32
3.0 9±1.07
94.1
祖细胞数(×105)
CFU-GM
1.46±0.17
1.40±0.19
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96.3
BFU-E
0.56±0.19
0.45±0.16
80.0
CFU-GEMM
0.09±0.05
0.07±0.03
76.0
2.4 细菌培养 35例脐血标本分离后做需氧菌和厌氧菌培 养，均无1例污染。
3 讨论
应用三联袋两次离心法分离脐血有核细胞，WBC、祖细胞、CD+34细胞 回收率比Ficoll分离的效果好。Broxmeyer等〔5〕采用Ficoll分离101份脐血，分离 后WBC、祖细胞的分离率分别为15.09%，6%～40%。Payne〔6〕研究了Fioll分离 脐血后CD+34细胞的回收率为51.4%，而两次离心法分离的WBC、祖细胞和CD+ 34细胞的回收率分别为82.3%、76%～96.3%和94.1%。Ficoll分离血量多 的样本时，使用的离心管数多，工作量大，并且很容易造成污染，而使用三联袋这种封闭系 统进行分离，不易造成污染。我们做了35份分离后脐血的需氧菌和厌氧菌的培养，均无1例 有污染。分离过程中，移入转移袋中的RBC和血浆，可用于测定ABO血型、病毒检测，这些均 是建立脐血库所需的检查，从而减少再从新生儿抽血的麻烦。两次离心法分离的WBC、祖细 胞的回收率虽然不如和6%羟乙基淀粉(HES)高，Rusbinstein〔7〕利用6% HES分离脐 血最后体积浓缩至20 ml，WBC回收率91%，前体细胞回收率(CFU-GM、BFU-E、CFU-GEMM) 为98%，但两次离心法分离不使用任何试剂，成本低，操作简单。这对费用昂贵的脐血库来 说，可省一笔开支。因此，采用三联袋两次离心法分离脐血有核细胞是一种既经济又简单的 方法，可大大减少冻存体积，是一种可用以建立脐血库的尝试。
, http://www.100md.com
△ 本课题为广东省科委、广州市科委重点课题，广东省卫生厅“五个一”工程
邮政编码：广州市，510180
参考文献
[1] Campos L,Roubin N,Guyotae D,et al.Definition of op timal cnditions for collection and cryopreservation of umbilical cord blood hema topoietic cells.Cryobiology,1995,32:511
[2] Aedmokun JA,Chapman C,Dunn J,et al.Umbilical cord blood collection and separation for haenatopoietic progenitor cell banking.BMT,1997,19:1023
, http://www.100md.com
[3] 裴雪涛，王立生，徐黎，等.造血生长因子对脐血CD+34细胞的体外扩增 作用。中华血液学杂志，1996，17：304
[4] Sousa T,Sousa ME,Godinho E,et al.Umbilical cord blood processing:volum e reduction and recovery of CD+34 cells.BMT,1997,17:311
[5] Broxmeyer ME,et al.Cord blood transplantation:an update.EXP Hematol,19 94,22:675
[6] Payne TA,et al.Phenotypic analysis of early hematopoietic progenitors in cord blood and determination of their correlation with clonogenic progenitors :BMT,1995,15:187
[7] Rubinstein P,et al.Processing and cropreservation of placental/umbilic al cord blood for unrelated bone marrow reconstitution.Proc Natl Acd Sci,USA
(1998-06-16 收稿), http://www.100md.com