含绿色荧光蛋白和HyTK基因双顺反子腺病毒载体的构建及鉴定
作者：叶传忠 陈仕平 裴雪涛 杜 楠 李 梁 冯 凯
单位：叶传忠 陈仕平 福建医科大学附属协和医院泌尿外科(福州 350001); 裴雪涛 李 梁 冯 凯 军事医学科学院放射医学研究所， 国家生物医学检测中心(北京 100850); 杜 楠 第三军医大学全军复合伤研究所(重庆 400038)
关键词：绿色荧光蛋白；HyTK基因；内部核糖体进入位点；腺病毒载体
福建医科大学学报990101 目的 构建一种带有绿色荧光蛋白(GFP)和潮霉素磷酸转移酶和HSV-TK的融合基因(HyTK基因)的新型腺病毒载体，用于简便、快速地了解自杀基因在恶性肿瘤中的转染效率和提高疗效。方法 利用脑炎心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES),将GFP的cDNA与HyTK真核表达载体重组，构建获得含GFP和HyTK基因真核表达载体，在Lipofectin介导下转染COS-7细胞，检测其表达后进一步克隆获得含GFP和HyTK基因双顺反子腺病毒载体。结果 构建含绿色荧光蛋白和HyTK基因双顺反子腺病毒载体，显示该载体可获得HyTK基因及GFP的良好表达。 结论 含绿色荧光蛋白和HyTK基因双顺反子腺病毒载体的构建为HyTK基因治疗恶性肿瘤用于临床提供了新的治疗工具及随访检测手段。
, http://www.100md.com
The Construction of Internal Ribosomal Entry Site-containing Adenoviral Vector Carring Green Fluorescent Protein and HyTK Gene
Ye Chuanzhong1, Chen Shiping1, Pei Xuetao2, et al
(1.Department of Urology, The Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou, 350001 2.Academy of Military Medical Sciences, Beijing, 100850)
Objective In order to facilitate the suicide gene delivery into neoplasms, a chimeric gene of HSV-TK and green flurescent protein(GFP) was constructed.Methods To construct this kind of adenoviral vector,method of molecular cloning was used. The internal ribosome entry site(IRES) which could coordinate expression of two genes in a single vector was optioned.Results A polycistronic adenoviral vector carring GFP and hygromycin phosphotransferase-thymidine kinase fusion(HyTK) gene was successful constructed. Conclusion This new kind of adenoviral vector could serves as a new tool and method for neoplasms gene therapy.
, 百拇医药
Key words green flurescent protein; hygromycin phosphotransferase thymidine kinase fusion gene; internal ribosome entry site; adenoviral vector
将单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)基因导入肿瘤细胞中表达，联合Gancyclovir(更昔洛韦，GCV)是当前恶性肿瘤基因治疗方案中较为成熟的一种。利用微小RNA病毒家族中的脑炎心肌炎病毒(EMCV)的5'-端非翻译区具有内核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)功能的特点,将HyTK基因及绿色荧光蛋白( green flurescent protein，GFP)的cDNA连接起来，构建成含GFP和HyTK基因双顺反子的腺病毒载体，为进行腺病毒介导的肿瘤基因治疗提供适合的载体系统。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 1640培养基，DNAizol DNA提取试剂盒，Lipofectin 转染试剂盒，IPTG、X-gal(GIBCO公司)。DNA纯化试剂盒，T4连接酶，小牛肠碱性磷酸酶(CIP)，限制性内切酶，Taq酶(Promega公司)。PCR引物第一对为：P1：5'-GAAACCGAACTGCCCGCT-GT-3'，P2：5'-GCCGTCAACCAAGCTCTGAT-3'，扩增530 bp的HyTK基因片段(中国科学院微生物研究所基因工程中心合成)；第二对用于扩增700 bp的GFP基因,P3：5'-AGGGCGAGGAGCTGT-TCA-3'，P4：5'-GGTCACGAACTCCAGC-AG-3'(大连宝生公司合成)；胎牛血清(FCS)(杭州四季青公司)。
1.2 质粒、菌株及细胞株 质粒tgCMV/HyTK,内含2.0 kb潮霉素磷酸转移酶和HSV-TK的融合基因(HyTK)的cDNA[1]，含绿色荧光蛋白(GFP)的真核表达载体pCMX，真核表达载体pIRES.neo、克隆载体pGEM-7Zf(+)、腺病毒载体pΔE1sp1A，大肠杆菌X-blue菌株及COS-7细胞由本室保存。
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1.3 质粒tgCMV/HyTK-IRES-GFP的构建及鉴定 按分子克隆常规程序进行DNA的酶切、连接与转化，将IRES与GFP基因先行插入pGEM-7Zf(+)的合适位点，随之按分子克隆常规程序进行DNA的酶切、连接与转化，将此IRES-GFP片段基因克隆到真核表达载体tgCMV/HyTK 中，构建成tgCMV/HyTK-IRES-GFP。根据文献[2]方法制备XL1-blue菌感受态，电穿孔法转化，蓝白斑筛选阳性克隆，快速小量制备质粒DNA，紫外分光光度计定量，酶切鉴定插入片段的大小及方向。
1.4 转染 参考文献[3]提供的Lipofectin优化转染条件，将质粒tgCMV/HyTK-IRES-GFP转染COS-7细胞以获得瞬时表达。
1.5 荧光倒置显微镜观察 荧光倒置显微镜(Olympusik-70)下观察COS-7/ HyTK-IRES-GFP细胞中发绿色荧光的细胞。
, http://www.100md.com 1.6 PCR检测转基因细胞的HyTK-IRES-GFP表达 参照DNAzol DNA提取试剂盒说明书的流程提取COS-7/HyTK-IRES-GFP细胞基因组DNA，取DNA 2 μl用于HyTK基因的PCR扩增，50 μl体系：200 μmol/L dNTPs，1.5 mmol/L Mg2+，P1、P2引物各0.5 μmol/L，95℃预变性1 min，加Taq酶
2 U，PCR仪上扩增:94℃变性45 s,60℃退火45 s,72℃延伸30 s,30个循环后72℃延伸7 min, 2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，GDS800型凝胶图像分析系统(美国UVP公司)成像。同以上体系改用引物P3、P4行GFP基因的扩增。
1.7 质粒pΔE1sp1A /HyTK-IRES-GFP的构建及鉴定 按分子克隆常规程序进行DNA的酶切、连接与转化，酶切鉴定插入片段的大小及方向。
, http://www.100md.com 2 结 果
2.1 质粒tgCMV/HyTK-IRES-GFP的构建及鉴定 先用HindⅢ及BamH I双酶切质粒pCMX/GFP,回收0.8 kb片段,获得GFP基因；并将此片段克隆到PGEM-7Zf(+)DNA的Hind Ⅲ-BamH I位点，蓝白斑筛选得到pGEM-7Zf(+)/GFP质粒；Smal Ⅰ及EcoR I 双酶切载体pIRES.neo 并回收小片段(IRES片段)，将其克隆到pGEM-7Zf(+)/GFP质粒的EcoR I-Smal Ⅰ位点获得质粒pGEM-7Zf(+)/IRES-GFP，再将此质粒用BamH Ⅰ单酶切回收获1.7 kb片段IRES-GFP；将真核表达载体tgCMV/HyTK用Bgl Ⅱ单切并用CIP将其5＇末端去磷酸化后，将IRES-GFP与tyCMN/HyTK用T4连接酶连接过夜，再用Bgl Ⅱ酶切60 min后转化、提取质粒DNA，Xho Ⅰ单酶切鉴定大小(6719 bps)，Xho I+ Bstx Ⅰ双酶切鉴定插入方向，正确插入获得2.9 kb和3.8 kb片段，反向插入则获得2.0 kb和4.6 kb片段(图
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1)。用DNA纯化试剂盒小量提取质粒获得的tgCMV/HyTK-IRES-GFP溶于dH2O 50 μl, 浓度为0.39 μg/μl。
图1 tgCMV/HyTK-IRES-GFP酶切鉴定结果
1.λDNA/EcoR Ⅰ Marker(bps) 21226,7421, 5804,5643,4878,3530 2.Bstx Ⅰ+Xho Ⅰ tgCMMV/HyTK-GFP-IRES(反向插入) 3.BamH Ⅰ tgCMV/HyTK-IRES-GFP 4.Bstx Ⅰ+Xho Ⅰ tgCMMV/HyTK-IRES-GFP 5.DL15000 DNA marker(bp):15000,10000, 7500,5000,2500,(1000)
2.2 转染 转染前一天将2×105 COS-7细胞悬浮于DMEM完全培养液5 ml中，接种于60 mm平皿。在12 mm×75 mm无菌试管中制备下列溶液：A：将2 μg质粒DNA溶于无血清DMEM培养基至100 μl。B：Lipofectin 10 μl稀释于无血清DMEM培养基90 μl中。合并溶液A和溶液B，轻轻混匀，置室温15 min。加无血清DMEM培养基1.8 ml至细胞中，将Lipofectin-DNA混合物混匀后，小心滴加至细胞上，轻轻混匀。12 h后弃转染液，DMEM培养基洗涤一次，加DMEM完全培养液5 ml，继续培养48 h后送荧光倒置显微镜观察及提取基因组DNA。
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2.3 荧光倒置显微镜观察 COS-7/ HyTK-IRES-GFP细胞中可观察到绿色荧光或强绿色荧光(图
2)。
图2荧光显微镜下见转HyTK-IRES-GFP基因COS7细胞
2.4 PCR检测转基因细胞的HyTK-IRES-GFP表达 用提取的DNA行PCR检测,可分别特异性扩增出530 bp的HyTK基因片段和700 bp的GFP基因片段两条明显亮带。而其亲代COS-7细胞则未扩出这些片段,从而证实有HyTK基因和GFP基因的转染。
2.5 质粒pΔE1sp1A/HyTK-IRES-GFP的构建及鉴定 用XhoⅠ及BamH Ⅰ双酶切质粒tgCMV/HyTK-IRES-GFP，回收4.7 kb片段,获得带CMV启动子和SV40 PolyA+尾的HyTK-IRES-GFP片段，利用BamH Ⅰ与Bgl Ⅱ为共末端酶的特点，将此片段定向克隆到pΔE1sp1A腺病毒载体的Xho Ⅰ-BamH Ⅰ位点。提取质粒DNA，BamH Ⅰ单酶切鉴定大小(11.1 kb)，见图3。
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图3 质粒pΔE1sp1A/HyTK-IRES-GFP酶切鉴定结果
1. DL15000 DNA marker(bp):15000,10000, 7500,5000,2500,(1000) 2.Xho Ⅰ pΔE1sp1A/HyTK-IRES-GFP 3.Xho Ⅰ pΔE1sp1A
3 讨 论
如何简便、快速、经济地了解和提高目的基因的转染效率并筛选出转基因细胞是目前基因治疗中的一个重要课题，选择一种理想的报告和标记基因是解决此问题的关键。源于维多利亚水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是新近发现的一种报告基因，由于其产生荧光无需任何底物或辅助因子，而且它可耐受光漂白及福尔马林固定，能制成长期保存的标本[4]，因而较传统的标记基因如β-半乳糖苷酶(Lacz)、荧光素酶(luc)等有明显的优越性。因此笔者设想构建同时带有HyTK和GFP cDNA的腺病毒载体，使之同时具备治疗基因和报告基因的功能，使得无论是ex vivo还是in vivo效率均能一目了然。此外，基因治疗中常用的多基因表达方式主要是通过使用多启动子或重组表达融合蛋白，但由于多启动子之间或目的基因之间的相互影响，往往减弱甚至丧失某些基因的表达。微小RNA病毒家族中的脑炎心肌炎病毒的5'-端非翻译区包含的顺式作用元件能在内部起始位点开始不依赖于帽子的翻译,即所谓的内核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)[5,6]，在HyTK和GFP之间插入一个IRES可保证两个基因的同时高效表达。为此笔者应用脑炎心肌炎病毒的IRES，在HyTK和GFP之间插入，经过一系列克隆构建获得含GFP和HyTK基因双顺反子腺病毒载体。
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在目前基因治疗临床方案中，最常用的是逆转录病毒载体系统。但由于逆转录病毒具有潜在的遗传毒性，外源基因随机整合入细胞基因组，有可能导致附近基因的突变和异常表达。此外，逆转录病毒的载导容量有限(最大不超过10 kb)，且难以获得高滴度病毒。这些都大大限制了逆转录病毒载体的使用范围[7]。腺病毒(Adenovirus, Ad)是一种近年来受到普遍重视的基因载体系统，并已成功地用于基因治疗的临床试验。其优势主要在于(1)腺病毒载体比较容易制备和操作；(2)宿主范围广、感染率高，对非增生分裂细胞也有感染性；(3)理化性质较稳定，可以通过沉淀、柱层析或超离心等方法获得高滴度病毒载体。通常纯化载体的滴度可达1010～1012空斑形成单位/ml (plaque-forming unit, PFU/ml)；(4)遗传毒性较低，因为腺病毒感染和复制过程无需整合入宿主细胞的基因组，由腺病毒转载的外源基因以附加型方式表达[8]。由于进一步鉴定此腺病毒载体需将重组获得的的pΔE1sp1A/HyTK-IRES-GFP与腺病毒基因右臂(质粒pJM17，40.07 kb)共转染293细胞，通过同源重组，并由293细胞提供E1区才可获得完整病毒，进而再行鉴定，步骤较为繁琐、周期长。所以笔者在初步鉴定时选用了细胞克隆过程中先行获得的tgCMV/HyTK-IRES-GFP载体(已带有CMV启动子和SV40 PolyA+尾)及COS-7细胞。COS-7细胞是稳定转化了SV40大T抗原基因的非洲绿猴肾细胞株，是目前最常用的瞬时表达系统之一[3]，将克隆过程中先行获得的tgCMV/HyTK-IRES-GFP载体经Lipofectin法转染COS-7细胞，PCR检测证实GFP及HyTK基因均在细胞中整合；荧光显微镜下可清晰见到转基因细胞发出绿色荧光。初步说明此双顺反子能较好地同时表达HyTK基因和绿色荧光蛋白，进而将其克隆获得腺病毒载体pΔE1sp1A /HyTK-IRES-GFP。
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笔者设想今后充分利用GFP可耐受光漂白及福尔马林固定；腺病毒转导系统转染效率高，操作简单，便于临床推广等特点，进行活体直接转移(in vivo)实验以进一步提高HSV-TK/GCV系统基因治疗的疗效，这方面的工作正在进行之中。
致谢：军事医学科学院胡志远硕士及第二军医大学王征旭博士给予多方帮助，在此表示感谢。
参考文献
[1]Lupton SD,Brunton LL,Kalberg VA, et al. Dominant positive and negative selection using a hygromycin phosphotransferase-thymidine kinase-fusion gene. Molecul Cellul Biol, 1991;11: 3374
[2]Sheng Y, Mancino V, Birren B. Transformation of Escherichia coli with large DNA molecules by electroporation. Nucleic Acid Res,1995;23:1990
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[3]胡志远，邢桂春，贺福初，等.用脂质体转染COS-7细胞条件的优化.军事医学科学院院刊，1997；21：125
[4]Misteli T, Spector DL. Application of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nature Biotechnol,1997;15:961
[5]Levenson VV, Transue EDE, Roninson IB. Internal ribosomal entry site-containing retroviral vectors with green fluorescent protein and drug resistance markers. Human Gene Therap, 1998;9:1233
[6]Tahara H, Zitvogol L, Storkus WJ,et al. Effective eradication of established murine tumor with IL-12 gene therapy using a polycistronic retroviral vector.J Immunol, 1995;12:6466
[7]Miller AD.Proooduction of retroviral vectors. Current protocols in human genetics.NewYork:John & Sons Inc. 1997;12.5.17-12.5.19
[8]Davis AR, Wilson JM. Adenoviral vectors. Current protocols in human genetics. NewYork:John & Sons Inc. 1997;12.4.16-12.4.18
(收稿：1998-11-10 修回：1998-12-29), http://www.100md.com
单位：叶传忠 陈仕平 福建医科大学附属协和医院泌尿外科(福州 350001); 裴雪涛 李 梁 冯 凯 军事医学科学院放射医学研究所， 国家生物医学检测中心(北京 100850); 杜 楠 第三军医大学全军复合伤研究所(重庆 400038)
关键词：绿色荧光蛋白；HyTK基因；内部核糖体进入位点；腺病毒载体
福建医科大学学报990101 目的 构建一种带有绿色荧光蛋白(GFP)和潮霉素磷酸转移酶和HSV-TK的融合基因(HyTK基因)的新型腺病毒载体，用于简便、快速地了解自杀基因在恶性肿瘤中的转染效率和提高疗效。方法 利用脑炎心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES),将GFP的cDNA与HyTK真核表达载体重组，构建获得含GFP和HyTK基因真核表达载体，在Lipofectin介导下转染COS-7细胞，检测其表达后进一步克隆获得含GFP和HyTK基因双顺反子腺病毒载体。结果 构建含绿色荧光蛋白和HyTK基因双顺反子腺病毒载体，显示该载体可获得HyTK基因及GFP的良好表达。 结论 含绿色荧光蛋白和HyTK基因双顺反子腺病毒载体的构建为HyTK基因治疗恶性肿瘤用于临床提供了新的治疗工具及随访检测手段。
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Ye Chuanzhong1, Chen Shiping1, Pei Xuetao2, et al
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Objective In order to facilitate the suicide gene delivery into neoplasms, a chimeric gene of HSV-TK and green flurescent protein(GFP) was constructed.Methods To construct this kind of adenoviral vector,method of molecular cloning was used. The internal ribosome entry site(IRES) which could coordinate expression of two genes in a single vector was optioned.Results A polycistronic adenoviral vector carring GFP and hygromycin phosphotransferase-thymidine kinase fusion(HyTK) gene was successful constructed. Conclusion This new kind of adenoviral vector could serves as a new tool and method for neoplasms gene therapy.
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Key words green flurescent protein; hygromycin phosphotransferase thymidine kinase fusion gene; internal ribosome entry site; adenoviral vector
将单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)基因导入肿瘤细胞中表达，联合Gancyclovir(更昔洛韦，GCV)是当前恶性肿瘤基因治疗方案中较为成熟的一种。利用微小RNA病毒家族中的脑炎心肌炎病毒(EMCV)的5'-端非翻译区具有内核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)功能的特点,将HyTK基因及绿色荧光蛋白( green flurescent protein，GFP)的cDNA连接起来，构建成含GFP和HyTK基因双顺反子的腺病毒载体，为进行腺病毒介导的肿瘤基因治疗提供适合的载体系统。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 1640培养基，DNAizol DNA提取试剂盒，Lipofectin 转染试剂盒，IPTG、X-gal(GIBCO公司)。DNA纯化试剂盒，T4连接酶，小牛肠碱性磷酸酶(CIP)，限制性内切酶，Taq酶(Promega公司)。PCR引物第一对为：P1：5'-GAAACCGAACTGCCCGCT-GT-3'，P2：5'-GCCGTCAACCAAGCTCTGAT-3'，扩增530 bp的HyTK基因片段(中国科学院微生物研究所基因工程中心合成)；第二对用于扩增700 bp的GFP基因,P3：5'-AGGGCGAGGAGCTGT-TCA-3'，P4：5'-GGTCACGAACTCCAGC-AG-3'(大连宝生公司合成)；胎牛血清(FCS)(杭州四季青公司)。
1.2 质粒、菌株及细胞株 质粒tgCMV/HyTK,内含2.0 kb潮霉素磷酸转移酶和HSV-TK的融合基因(HyTK)的cDNA[1]，含绿色荧光蛋白(GFP)的真核表达载体pCMX，真核表达载体pIRES.neo、克隆载体pGEM-7Zf(+)、腺病毒载体pΔE1sp1A，大肠杆菌X-blue菌株及COS-7细胞由本室保存。
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1.3 质粒tgCMV/HyTK-IRES-GFP的构建及鉴定 按分子克隆常规程序进行DNA的酶切、连接与转化，将IRES与GFP基因先行插入pGEM-7Zf(+)的合适位点，随之按分子克隆常规程序进行DNA的酶切、连接与转化，将此IRES-GFP片段基因克隆到真核表达载体tgCMV/HyTK 中，构建成tgCMV/HyTK-IRES-GFP。根据文献[2]方法制备XL1-blue菌感受态，电穿孔法转化，蓝白斑筛选阳性克隆，快速小量制备质粒DNA，紫外分光光度计定量，酶切鉴定插入片段的大小及方向。
1.4 转染 参考文献[3]提供的Lipofectin优化转染条件，将质粒tgCMV/HyTK-IRES-GFP转染COS-7细胞以获得瞬时表达。
1.5 荧光倒置显微镜观察 荧光倒置显微镜(Olympusik-70)下观察COS-7/ HyTK-IRES-GFP细胞中发绿色荧光的细胞。
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2 U，PCR仪上扩增:94℃变性45 s,60℃退火45 s,72℃延伸30 s,30个循环后72℃延伸7 min, 2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，GDS800型凝胶图像分析系统(美国UVP公司)成像。同以上体系改用引物P3、P4行GFP基因的扩增。
1.7 质粒pΔE1sp1A /HyTK-IRES-GFP的构建及鉴定 按分子克隆常规程序进行DNA的酶切、连接与转化，酶切鉴定插入片段的大小及方向。
, http://www.100md.com 2 结 果
2.1 质粒tgCMV/HyTK-IRES-GFP的构建及鉴定 先用HindⅢ及BamH I双酶切质粒pCMX/GFP,回收0.8 kb片段,获得GFP基因；并将此片段克隆到PGEM-7Zf(+)DNA的Hind Ⅲ-BamH I位点，蓝白斑筛选得到pGEM-7Zf(+)/GFP质粒；Smal Ⅰ及EcoR I 双酶切载体pIRES.neo 并回收小片段(IRES片段)，将其克隆到pGEM-7Zf(+)/GFP质粒的EcoR I-Smal Ⅰ位点获得质粒pGEM-7Zf(+)/IRES-GFP，再将此质粒用BamH Ⅰ单酶切回收获1.7 kb片段IRES-GFP；将真核表达载体tgCMV/HyTK用Bgl Ⅱ单切并用CIP将其5＇末端去磷酸化后，将IRES-GFP与tyCMN/HyTK用T4连接酶连接过夜，再用Bgl Ⅱ酶切60 min后转化、提取质粒DNA，Xho Ⅰ单酶切鉴定大小(6719 bps)，Xho I+ Bstx Ⅰ双酶切鉴定插入方向，正确插入获得2.9 kb和3.8 kb片段，反向插入则获得2.0 kb和4.6 kb片段(图
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1)。用DNA纯化试剂盒小量提取质粒获得的tgCMV/HyTK-IRES-GFP溶于dH2O 50 μl, 浓度为0.39 μg/μl。
图1 tgCMV/HyTK-IRES-GFP酶切鉴定结果
1.λDNA/EcoR Ⅰ Marker(bps) 21226,7421, 5804,5643,4878,3530 2.Bstx Ⅰ+Xho Ⅰ tgCMMV/HyTK-GFP-IRES(反向插入) 3.BamH Ⅰ tgCMV/HyTK-IRES-GFP 4.Bstx Ⅰ+Xho Ⅰ tgCMMV/HyTK-IRES-GFP 5.DL15000 DNA marker(bp):15000,10000, 7500,5000,2500,(1000)
2.2 转染 转染前一天将2×105 COS-7细胞悬浮于DMEM完全培养液5 ml中，接种于60 mm平皿。在12 mm×75 mm无菌试管中制备下列溶液：A：将2 μg质粒DNA溶于无血清DMEM培养基至100 μl。B：Lipofectin 10 μl稀释于无血清DMEM培养基90 μl中。合并溶液A和溶液B，轻轻混匀，置室温15 min。加无血清DMEM培养基1.8 ml至细胞中，将Lipofectin-DNA混合物混匀后，小心滴加至细胞上，轻轻混匀。12 h后弃转染液，DMEM培养基洗涤一次，加DMEM完全培养液5 ml，继续培养48 h后送荧光倒置显微镜观察及提取基因组DNA。
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2.3 荧光倒置显微镜观察 COS-7/ HyTK-IRES-GFP细胞中可观察到绿色荧光或强绿色荧光(图
2)。
图2荧光显微镜下见转HyTK-IRES-GFP基因COS7细胞
2.4 PCR检测转基因细胞的HyTK-IRES-GFP表达 用提取的DNA行PCR检测,可分别特异性扩增出530 bp的HyTK基因片段和700 bp的GFP基因片段两条明显亮带。而其亲代COS-7细胞则未扩出这些片段,从而证实有HyTK基因和GFP基因的转染。
2.5 质粒pΔE1sp1A/HyTK-IRES-GFP的构建及鉴定 用XhoⅠ及BamH Ⅰ双酶切质粒tgCMV/HyTK-IRES-GFP，回收4.7 kb片段,获得带CMV启动子和SV40 PolyA+尾的HyTK-IRES-GFP片段，利用BamH Ⅰ与Bgl Ⅱ为共末端酶的特点，将此片段定向克隆到pΔE1sp1A腺病毒载体的Xho Ⅰ-BamH Ⅰ位点。提取质粒DNA，BamH Ⅰ单酶切鉴定大小(11.1 kb)，见图3。
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图3 质粒pΔE1sp1A/HyTK-IRES-GFP酶切鉴定结果
1. DL15000 DNA marker(bp):15000,10000, 7500,5000,2500,(1000) 2.Xho Ⅰ pΔE1sp1A/HyTK-IRES-GFP 3.Xho Ⅰ pΔE1sp1A
3 讨 论
如何简便、快速、经济地了解和提高目的基因的转染效率并筛选出转基因细胞是目前基因治疗中的一个重要课题，选择一种理想的报告和标记基因是解决此问题的关键。源于维多利亚水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是新近发现的一种报告基因，由于其产生荧光无需任何底物或辅助因子，而且它可耐受光漂白及福尔马林固定，能制成长期保存的标本[4]，因而较传统的标记基因如β-半乳糖苷酶(Lacz)、荧光素酶(luc)等有明显的优越性。因此笔者设想构建同时带有HyTK和GFP cDNA的腺病毒载体，使之同时具备治疗基因和报告基因的功能，使得无论是ex vivo还是in vivo效率均能一目了然。此外，基因治疗中常用的多基因表达方式主要是通过使用多启动子或重组表达融合蛋白，但由于多启动子之间或目的基因之间的相互影响，往往减弱甚至丧失某些基因的表达。微小RNA病毒家族中的脑炎心肌炎病毒的5'-端非翻译区包含的顺式作用元件能在内部起始位点开始不依赖于帽子的翻译,即所谓的内核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)[5,6]，在HyTK和GFP之间插入一个IRES可保证两个基因的同时高效表达。为此笔者应用脑炎心肌炎病毒的IRES，在HyTK和GFP之间插入，经过一系列克隆构建获得含GFP和HyTK基因双顺反子腺病毒载体。
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在目前基因治疗临床方案中，最常用的是逆转录病毒载体系统。但由于逆转录病毒具有潜在的遗传毒性，外源基因随机整合入细胞基因组，有可能导致附近基因的突变和异常表达。此外，逆转录病毒的载导容量有限(最大不超过10 kb)，且难以获得高滴度病毒。这些都大大限制了逆转录病毒载体的使用范围[7]。腺病毒(Adenovirus, Ad)是一种近年来受到普遍重视的基因载体系统，并已成功地用于基因治疗的临床试验。其优势主要在于(1)腺病毒载体比较容易制备和操作；(2)宿主范围广、感染率高，对非增生分裂细胞也有感染性；(3)理化性质较稳定，可以通过沉淀、柱层析或超离心等方法获得高滴度病毒载体。通常纯化载体的滴度可达1010～1012空斑形成单位/ml (plaque-forming unit, PFU/ml)；(4)遗传毒性较低，因为腺病毒感染和复制过程无需整合入宿主细胞的基因组，由腺病毒转载的外源基因以附加型方式表达[8]。由于进一步鉴定此腺病毒载体需将重组获得的的pΔE1sp1A/HyTK-IRES-GFP与腺病毒基因右臂(质粒pJM17，40.07 kb)共转染293细胞，通过同源重组，并由293细胞提供E1区才可获得完整病毒，进而再行鉴定，步骤较为繁琐、周期长。所以笔者在初步鉴定时选用了细胞克隆过程中先行获得的tgCMV/HyTK-IRES-GFP载体(已带有CMV启动子和SV40 PolyA+尾)及COS-7细胞。COS-7细胞是稳定转化了SV40大T抗原基因的非洲绿猴肾细胞株，是目前最常用的瞬时表达系统之一[3]，将克隆过程中先行获得的tgCMV/HyTK-IRES-GFP载体经Lipofectin法转染COS-7细胞，PCR检测证实GFP及HyTK基因均在细胞中整合；荧光显微镜下可清晰见到转基因细胞发出绿色荧光。初步说明此双顺反子能较好地同时表达HyTK基因和绿色荧光蛋白，进而将其克隆获得腺病毒载体pΔE1sp1A /HyTK-IRES-GFP。
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笔者设想今后充分利用GFP可耐受光漂白及福尔马林固定；腺病毒转导系统转染效率高，操作简单，便于临床推广等特点，进行活体直接转移(in vivo)实验以进一步提高HSV-TK/GCV系统基因治疗的疗效，这方面的工作正在进行之中。
致谢：军事医学科学院胡志远硕士及第二军医大学王征旭博士给予多方帮助，在此表示感谢。
参考文献
[1]Lupton SD,Brunton LL,Kalberg VA, et al. Dominant positive and negative selection using a hygromycin phosphotransferase-thymidine kinase-fusion gene. Molecul Cellul Biol, 1991;11: 3374
[2]Sheng Y, Mancino V, Birren B. Transformation of Escherichia coli with large DNA molecules by electroporation. Nucleic Acid Res,1995;23:1990
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[3]胡志远，邢桂春，贺福初，等.用脂质体转染COS-7细胞条件的优化.军事医学科学院院刊，1997；21：125
[4]Misteli T, Spector DL. Application of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nature Biotechnol,1997;15:961
[5]Levenson VV, Transue EDE, Roninson IB. Internal ribosomal entry site-containing retroviral vectors with green fluorescent protein and drug resistance markers. Human Gene Therap, 1998;9:1233
[6]Tahara H, Zitvogol L, Storkus WJ,et al. Effective eradication of established murine tumor with IL-12 gene therapy using a polycistronic retroviral vector.J Immunol, 1995;12:6466
[7]Miller AD.Proooduction of retroviral vectors. Current protocols in human genetics.NewYork:John & Sons Inc. 1997;12.5.17-12.5.19
[8]Davis AR, Wilson JM. Adenoviral vectors. Current protocols in human genetics. NewYork:John & Sons Inc. 1997;12.4.16-12.4.18
(收稿：1998-11-10 修回：1998-12-29), http://www.100md.com